שיטת הקרנה לזיהוי הטרוכרומטין-קידום תרופות באמצעות דרוזוהילה

נכון לעכשיו אין תרופות המבוססות היטב בקידום היווצרות הטרוכרומטין. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה לזיהוי תרכובות מולקולות קטנות המקדמות תהליך זה. פרוטוקול ההקרנה שלנו מספק פשוט, זול, קל לעקוב במערכת vivo לזיהוי סמים קידום הטרוכרומטין.

זיהוי תרכובות המקדמות היווצרות הטרוכרומטין עלול להוביל לגילוי מנגנונים של סרטן המקנים וטיפול בסרטן. חסכוני זה נמדד לזיהוי תרכובות קידום הטרוכרומטין ב Drosophila יכול לשמש גם כדי לספור להיטים טופס כפי שהוא אמצעי מניעה מאגר התא הגבוה ביותר של הקרנת תאים. פרוטוקול ההקרנה שלנו יכול גם להיות שימושי עבור מסכי טייס מהיר כמו מערכת זו Drosophila TranSheet מייצרת פנוטיפ צבע עיניים מגוונים כי הוא בקורלציה הפוכה לכמות הטרוכרומטין נוכח לטוס.

עוזר להדגים את ההליך יהיה קני דאו, סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה שלנו. לאחר זיהוי והכנת ספריית תרופות להקרנה באמצעות ממס מתאים, ואת הריכוז הרצוי, לחצות שלושה זבובים זכר עם שלושה או יותר זבובים נקבה בתולה בבקבוקון מזון 25 על ידי 95 מילימטר. עם תשעה מילימטרים של מדיום מזון דרוסופילה סטנדרטי.

הגדר שלושה בקבוקונים משוכפלים עבור כל תרופה. הוסף בקבוקון בקרה אחד עבור המסך. ולאפשר לזבובים להטיל ביצים במשך יומיים בטמפרטורת החדר.

ביום השני של הצלב, הרדמה את הזבובים עם פרץ קצר של פחמן דו חמצני. ולזרוק את זבובי ההורה בבקבוק המכיל 70% אתנול. לאחר מכן, לדלל כל תרכובת התרופה מן המניה הראשונית להשתתף ריכוז סופי מיקרו טוחן ב 33% DMSO במים.

ולהוסיף 60 microliters של התרופה, או את השליטה 33% DMSO לבד, על גבי מזון לטוס. לאחר מכן ודא כי אין זבובים הורים נמצאים בתוך הבקבוקונים. ולהוסיף את פתרון התרופה לבקבוקונים המתאימים.

יומיים לאחר זבובי F1 להגיח, להעביר זבובים הרדמה מבקבוקון אחד בכל פעם על כרית ניתוח נקבובי עם פחמן דו חמצני סינון דרך מתחת לנייר המסנן. תחת מיקרוסקופ לנתח, לבחון כל זבוב שלם, זיהוי כל הזכרים הטרוזיגים על ידי חוסר שלהם פנוטיפ כנף מתולתל o דומיננטי. ציון צבע העיניים של כל זכר הטרוזיגים בסולם של 1 עד 5.

עם ציון אחד שהוקצה פחות מ 5% אדום מפוזר שטח הפנים הכולל של העין. הוסף ציון שני זבובים עם שטח פנים כולל של 6 עד 25% נקודה אדומה. שלושה זבובים עם שטח פנים כולל של 26 עד 50% נקודה אדומה.

ארבעה זבובים עם 51 עד 75% שטח פנים כולל של עין נקודה אדומה. וחמישה זבובים עם שטח פנים כולל של יותר מ-75% נקודה אדומה. לאחר מכן לחשב את אינדקס הצבע הממוצע של כל הזכרים מכל בקבוקון הבקיע ב- triplicate.

כדי לאשר כי התרכובות אכן לקדם היווצרות הטרוכרומטין, טכניקת אימות שונה, כגון כתמים מערביים, ניתן לבצע. בניסוי מייצג זה, ספריית תרופות מולקולה קטנה, אונקולוגיה להגדיר 3, אשר מורכב 97 תרופות אונקולוגיות מורשה ה-FDA, הוקרן באמצעות זן DX1 של Drosophila Melanogaster. על פי ההקרנה, מטוטרקסאט, מקודד כמו E7 בספרייה, גרם וריאציה ביותר בתוך זן Dx1.

מציע כי מטוטרקסט יכול להיות התרופה המבטיחה ביותר לקידום הטרוכרומטין לטיפול ממוקד סרטן בעתיד. כדי לאשר עוד יותר כי תרכובת זו מקדמת טרנספורמציה הטרוכרומטין, נתונים כתם מערבי בוצע. הדגמת הרגולציה של הטרוכרומטין פורמטין הקשורים חלבון, H3K9 trimethylation, ואימות תוצאות ההקרנה.

הצעד הקריטי הוא ניקוד צבע העיניים של כל אחד לבן 11-18 DX1 זבובים זכר הטרוזיגים בסולם של אחד עד חמישה על פי מסלול מחקר קבוע מראש. אנחנו יכולים להשתמש כתמים מערביים או immunostaining כדי לאשר את הלהיטים. הגילוי של תרכובות החשודות לקדם היווצרות הטרוכרומטין עשוי גם להוביל לגילוי של מנגנון גנטי IV של התפתחות סרטן וניסויים קליניים בחולים אנושיים.