Name: שיטת הקרנה לזיהוי הטרוכרומטין-קידום תרופות באמצעות דרוזוהילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: למד שיטת הקרנה לזיהוי תרכובות המקדמות הטרוכרומטין בדרוזוהילה באמצעות פנוטיפי צבע עין משתנים. פרוטוקול זה מספק מערכת פשוטה ויעילה לזיהוי תרופות לטיפול בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לג בירכדלר, א. באך ומרכז המלאי של בלומינגטון דרוסופילה עבור זנים דרוזופילה שונים; המכון הלאומי לסרטן (NCI) תוכנית Therapeutics התפתחותית עבור האונקולוגיה להגדיר מולקולה קטנה בספרייה סמים; UCSD סטודנטים לתואר ראשון כולל איימי צ ' אנג, טאסיק אתה, ג'סיקה סינג-באנג, רחל Meza, ו אלכס צ'אבז. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי מענק מחקר של האגודה האמריקנית לבית החזה לJ.L. ומימון מ-NIH: R01GM131044 כדי W.X.L.

1. הכנה לספריות תרופות
<ol><li>לזהות ולהכין ספריית סמים להיות מוקרן באמצעות הממס המתאים בריכוז הרצוי (למשל, 10 מ"מ ב DMSO). הערה: דוגמה ספציפית לספריית תרופות היא מערכת האונקולוגיה השלישי מ המכון לסרטן הלאומי (NCI) תוכנית Therapeutics התפתחותית (DTP). תרכובות בקבוצה זו מסופקים כ 20 μL ב 10 מ"מ ב 100% DMSO ב 2 96-ובכן PP U-בתחתית לוחות ומאוחסנים ב-20 ° c. מפות הלוח NCI, ואת הנתונים הכימיים הבסיסיים של כל תרופה ניתן למצוא באתרי האינטרנט הבאים: <a href="https://dtp.cancer.gov/dtpstandard/servlet/PlateMap?searchlist=4740&outputformat=html&searchtype=plate&Submit=Submit" target="_blank">לוחית מספר 4740 של NCI</a> <a href="https://dtp.cancer.gov/dtpstandard/servlet/PlateMap?searchlist=4741&outputformat=html&searchtype=plate&Submit=Submit" target="_blank">לוחית מספר 4741 של NCI</a>
</li>
</ol>2. מסך עבור הטרוכרומטין-קידום תרופות באמצעות דרוזוהילה
<ol><li>
דרוסופילה אסטרטגיית רבייה (איור 1א)<ol>
<li>יום 1: לחצות שלושה w1118/y; DX1/CyO זכר זבובים ושלושה או יותר בתולה w1118 נקבה זבובים בבקבוקון 25 מ"מ x 95 מ"מ מזון עם 9 מ מ של מזון מסוג drosophila ילה מדיה (בלומינגטון מתכון). הגדר שלוש מבחנות שכפול עבור כל תרופה ושליטה אחת עבור המסך. הערה: DX1 זבובים סופקו על ידי ג ' יימס birchler (אוניברסיטת מיזורי)9,13.</li>
		<li>יום 2 ויום 3: הניחו לזבובים להטיל ביצים במשך יומיים בטמפרטורת החדר (22 ° c).</li>
		<li>יום 4: להשתמש בפרץ קצר של CO2 גז כדי להשליך את זבוב ההורה ולהיפטר של זבוב ההורה "חדר המתים לעוף" (בקבוק המכיל 70% אלכוהול).</li>
	</ol>
</li>
	<li>. להאכיל את התרופות לדרוסופילה להקרנה<ol>
<li>לדלל כל תרכובת התרופה מהמלאי המקורי (20 μL ב 10 מ"מ ב 100% DMSO ב 96-טוב PP U-בתחתית לוחות) עד 10 μM ריכוז סופי עם 33% DMSO במים. השתמש ב-33% DMSO במים ללא כל תרופה כפקד. הערה: חלק מהסמים מסיסים במים ירודים והתפרקה ב-DMSO. 100% DMSO רעיל לזבובים. .33% נסבל</li>
		<li>יום 4: פיפטה 60 μL של 10 מתוך פתרון התרופה μM או שליטה על החלק העליון של מזון לעוף. בשלב זה, ודא כי זבובים ההורה הוסרו ויש ביצים לעוף וזוחלים הזחלים הראשון על המזון.</li>
		<li>יום 6: חזור על ליטוף 60 μL של אותו הפתרון של 10 μM תרופה לבקבוקון המזון. הערה: מאחר והתרופות נוספו למזון לעוף, מזון הפנים העליון מכיל כמעט 10 הריכוז μM והאוכל התחתון לא יכול להיות חודר לחלוטין. כל הזבובים להטיל ביצים על גבי האוכל ולאכול את האוכל העליון משטח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להתבונן ולהבקיע צבע עיניים שינויים.<ol>
<li>יומיים לאחר הזבובים F1 לצאת (בערך ביום 14), לבחון את הזבובים. השתמש פרץ קצר של CO2 כדי להוריד את הזבובים F1 ולהסיר את הזבובים מן המבחנה שלהם על משטח מבתר נקבובי עם CO2 ללגום מתחת נייר סינון.</li>
		<li>לבדוק את הזבובים על הלוח הזה תחת מיקרוסקופ ניתוח. בדוק את כל זבוב ולזהות את כל w1118/y; DX1/+ heterozygous זכרים על ידי חסרי הכנף cyo דומיננטי מתולתל האגף.</li>
		<li>ציון צבע העין של כל אחד w1118/y; DX1/+ heterozygous גברים זבובים בקנה מידה של 1 עד 5 (איור 1B). אחוז צבע העיניים הלבנות דורג כדלקמן: 1. < 5% מפוזרים על פני השטח הכולל עיניים מפוזרות 2.6%-25% כתמים אדומים עין שטח כולל הקרקע 3.26%-50% העיניים האדומות כתמים בשטח השטח הכולל 4.51%-75% כתמים אדומים עין שטח הקרקע הכולל 5. > 75% כתמים אדומים עין שטח הקרקע הכולל הערה: לחילופין, הומוגון ראשי לטוס ב 100% מתנול ולהשתמש ספקטרומטר למדוד פיגמנטציה העין ב OD 450 nm. בחר רק זכרים, כי PEV הוא בולט יותר DX1 זכרים. ציון יותר מ 10 זכרים בכל בקבוקון.</li>
		<li>לחשב את אינדקס צבע ממוצע של כל הזכרים מכל בקבוקון הבקיע. בצע מטריפליטים עבור כל תרכובת (איור 1ג). הערה: מכיוון שצבע העיניים משתנה עם הגיל, זהו שלב רגיש לזמן. יש לחשב את צבע העין באותו גיל – בן יומיים. בדרך כלל > 10 זבובים צריך להיות הבקיע בכל בקבוקון.</li>
		<li>כדי לאשר כי תרכובות אכן לקדם את היווצרות הטרוכרומטין, להשתמש בטכניקה שונה כגון בלוק המערבי כדי לאמת (איור 1G).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Morgan, M. A., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of cancer.</a> Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).</li>
<li>Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+heterochromatin+formation+and+transcription+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 3(2015).</li>
<li>Allshire, R. C., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+principles+of+heterochromatin+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ten principles of heterochromatin formation and function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Grewal, S. I., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+and+epigenetic+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin and epigenetic control of gene expression.</a> Science. 301 (5634), 798-802 (2003).</li>
<li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin%3A+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li>
<li>Ci, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+Protein+1alpha+Mediates+Development+and+Aggressiveness+of+Neuroendocrine+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin-Encoded+Satellite+RNAs+Induce+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer.</a> Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).</li>
<li>Dorer, D. R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansions+of+transgene+repeats+cause+heterochromatin+formation+and+gene+silencing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila.</a> Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).</li>
<li>Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+protein+1+binds+transgene+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays.</a> Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).</li>
<li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK+signaling+globally+counteracts+heterochromatic+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing.</a> Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).</li>
<li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+STAT+is+required+for+directly+maintaining+HP1+localization+and+heterochromatin+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability.</a> Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).</li>
<li>Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-Element+repression+in+Drosophila+melanogaster+by+variegating+clusters+of+P-lacZ-white+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes.</a> Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).</li>
<li>Loyola, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+methotrexate+as+a+heterochromatin-promoting+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11673(2019).</li>
<li>Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+Heterochromatin+Protein+1+%28HP1%29+to+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression.</a> Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).</li>
<li>Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin%3A+Guardian+of+the+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin: Guardian of the Genome.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+tumour+suppression+occurs+via+heterochromatin-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing.</a> Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unphosphorylated+STAT5A+stabilizes+heterochromatin+and+suppresses+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

הטרוכרוטין היא צורה מרוכזת של דנ א אשר ממלאת תפקיד מרכזי בוויסות הביטוי הגנטי. זה הופך יותר ויותר מוכר בסרטן עשוי לשמש יעד פוטנציאלי לטיפול בסרטן15,16,17,18. תרכובות קטנות מולקולה משמשות בדרך כלל בפיתוח התרופה בשל יתרונות בייצור, שימור, ומטבוליזם בגוף האדם. כדי לזהות הטרוכרומטין-קידום תרכובות קטנות-מולקולה, שיטה יעילה תוכננה והוצגה באמצעות DX1drosophila ילה מאמץ, אשר הוכח להשפ...

הטרוכרומטין היא צורה מרוכזת של דנ א אשר ממלאת תפקיד מרכזי בביטוי הגנים, בוויסות הפרדה של כרומוזום במהלך חלוקת התא, ובהגנה מפני אי-יציבות הגנום1. הטרוכרומטין נחשב הרגולטור הדיכוי הגנטי כדי להגן על שלמות כרומוזום במהלך מיטוזיס תא2,3. הוא משויך ל-di ו tri-מתילציה של היסטון H3 ליזין 9 (H3K9me) במהלך מחויבות השושלת4,5. יתר על כן, הגיוס של חלבון הטרוכרומטין 1 (HP1) חלבונים chromodomain נחשב גם להיות משויך עם הטרוכרומטין ודיכוי אפיגנטי של ביטוי גנים6. חלבונים אלה הם רכיבים חיוניים וסמנים של היווצרות הטרוכרומטין.
מאז אי-יציבות גנומית מאפשר לתאים לרכוש שינויים גנטיים לקדם קרצינובגנזה, הטרוכרומטין הוא הופך להיות מוכר יותר בפיתוח סרטן יכול להיות מיועד לטיפול בסרטן7,8. כיום, אין תרופות שהוקמו היטב בסיוע להיווצרות הטרוכרומטין. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה אך יעילה להקרנה תרכובות קטנות-מולקולה לקדם את היווצרות הטרוכרומטין. ההקרנה נעשית על ידי הטיפול בדרוסופילה עם ספרייה של תרופות מולקולות קטנות. שיטה זו מנצלת צבע עיניים מגוונים העין בתוך DX1drosophila ילה זן המושפע על ידי רמות הטרוכרומטין. DX1 זבובים מכילים מערך דו-מושביים של שבעה מפלסים [lac-w] transgenes, אשר יש ביטוי מגוון/דיכאון בהתאם הטרוכרוהמלחה, ולכן, היקף המגוון בצבע העיניים משקף את רמת הטרוכרומטין. באופן ספציפי, הטרוכרוטין יכול להתגלות על ידי היחס העולה של צבע עיניים מגוונים (עין לבנה). להיפך, הטרוכרומטין היורדת יזוהו על ידי שיעור העלייה של P [lac-w] הביטוי (עין אדומה)9,10,11,12.
לכן, אנו מנצלים את המערכת הזאת של דרוזולה טרנסגנטית המפיקה מגוון מגוונים של צבע עיניים מאחר והביטוי שלה מתואם ישירות לכמות הטרוכרומטין הנוכחית. עם גילוי תרכובות החשודות לקדם את היווצרות הטרוכרומטין, אנו עשויים לאשר חשד זה באמצעות שיטות אחרות כגון אבן חשופה מערבית. אלה הטרוכרוטין-קידום חומרים עשויים להתפתח עוד לניסויים קליניים בחולים בעתיד.

<table><tbody><tr>זבובי <td>Drosophila</td><td></td><td>DX1 strain</td><td>DX1 סופקו באדיבות על ידי ג'יימס בירצ'לר (אוניברסיטת מיזורי)</td></tr><tr><td>Drosophila תקשורת מזון</td><td>UCSD מטבח</td><td></td><td></td>זבובים</tr><tr><td>Methotrexate</td><td>NCI ספריית</td><td></td><td></td>תרופות</tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>אתיל אלכוהול</td><td>סיגמא</td><td>E7023-500 מ"ל</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת הקרנה לזיהוי הטרוכרומטין-קידום תרופות באמצעות דרוזוהילה

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila ילה היא אורגניזם מודל מעולה כי ניתן להשתמש כדי המסך תרכובות שעשוי להיות שימושי עבור טיפול בסרטן. השיטה המתוארת כאן היא חסכונית בשיטה vivo כדי לזהות הטרוכרוטין-קידום תרכובות באמצעות Drosophila ילה. המאמץ הDX1 של דרוזוההילה , לאחר שצבע עיניים מגוון המשקף את האקסון של היווצרות הטרוכרומטין, ובכך מספק כלי עבור הטרוכרומטין לקידום התרופה. בשיטת ההקרנה הזאת, מגוון העין מבוסס על השטח של פיגמנטציה אדומה הכובשת חלקים של העין, והוא הבקיע בקנה מידה של 1 עד 5. שיטת ההקרנה פשוטה ורגישה ומאפשרת בדיקת תרכובות בvivo. הקרנת סמים בשיטה זו מספקת דרך מהירה וזולה לזיהוי הטרוכרומטין-קידום תרופות שיכולות להיות השפעות מועילות בtherapeutics הסרטן. זיהוי תרכובות לקדם את היווצרות של הטרוכרומטין יכול גם להוביל לגילוי של מנגנונים אפיגנטיים של התפתחות הסרטן.

פרוטוקול זה נעשה שימוש בהצלחה כדי להקרין תרכובות המקדמים את היווצרות הטרוכרומטין בדרוסופילה, שהוא יעיל ובעלות נמוכה במערכת vivo לפיתוח התרופה (איור 1). הוקרן ספרייה קטנה מולקולה סמים, אונקולוגיה Set III, אשר מורכב של 97 FDA תרופות מורשה לאונקולוגיה, באמצעות זן DX1 של Drosophila ילה melanogaster (איור 1B). התוצאות עבור תרופה משמעותית היו מיוצגים בגרף עמודות (איור 1ג, ד). על...

דרוזופילה הוא מודל ניסיוני נפוץ המתאים לסינון תרופות עם יישומים פוטנציאליים לטיפול בסרטן. כאן, אנו מתארים את השימוש של דרוזוהילה מגוונים העין פנוטיפים כשיטה להקרנה תרכובות קטנות מולקולה לקדם את היווצרות הטרוכרומטין.

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

נכון לעכשיו אין תרופות המבוססות היטב בקידום היווצרות הטרוכרומטין. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה לזיהוי תרכובות מולקולות קטנות המקדמות תהליך זה. פרוטוקול ההקרנה שלנו מספק פשוט, זול, קל לעקוב במערכת vivo לזיהוי סמים קידום הטרוכרומטין.זיהוי תרכובות המקדמות היווצרות הטרוכרומטין עלול להוביל לגילוי מנגנונים של סרטן המקנים וטיפול בסרטן. חסכוני זה נמדד לזיהוי תרכובות קידום הטרוכרומטין ב Drosophila יכול לשמש גם כדי לספור להיטים טופס כפי שהוא אמצעי מניעה מאגר התא הגבוה ביותר של הקרנת תאים. פרוטוקול ההקרנה שלנו יכול גם להיות שימושי עבור מסכי טייס מהיר כמו מערכת זו Drosophila TranSheet מייצרת פנוטיפ צבע עיניים מגוונים כי הוא בקורלציה הפוכה לכמות הטרוכרומטין נוכח לטוס.עוזר להדגים את ההליך יהיה קני דאו, סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה שלנו. לאחר זיהוי והכנת ספריית תרופות להקרנה באמצעות ממס מתאים, ואת הריכוז הרצוי, לחצות שלושה זבובים זכר עם שלושה או יותר זבובים נקבה בתולה בבקבוקון מזון 25 על ידי 95 מילימטר. עם תשעה מילימטרים של מדיום מזון דרוסופילה סטנדרטי.הגדר שלושה בקבוקונים משוכפלים עבור כל תרופה. הוסף בקבוקון בקרה אחד עבור המסך. ולאפשר לזבובים להטיל ביצים במשך יומיים בטמפרטורת החדר.ביום השני של הצלב, הרדמה את הזבובים עם פרץ קצר של פחמן דו חמצני. ולזרוק את זבובי ההורה בבקבוק המכיל 70% אתנול. לאחר מכן, לדלל כל תרכובת התרופה מן המניה הראשונית להשתתף ריכוז סופי מיקרו טוחן ב 33% DMSO במים.ולהוסיף 60 microliters של התרופה, או את השליטה 33% DMSO לבד, על גבי מזון לטוס. לאחר מכן ודא כי אין זבובים הורים נמצאים בתוך הבקבוקונים. ולהוסיף את פתרון התרופה לבקבוקונים המתאימים.יומיים לאחר זבובי F1 להגיח, להעביר זבובים הרדמה מבקבוקון אחד בכל פעם על כרית ניתוח נקבובי עם פחמן דו חמצני סינון דרך מתחת לנייר המסנן. תחת מיקרוסקופ לנתח, לבחון כל זבוב שלם, זיהוי כל הזכרים הטרוזיגים על ידי חוסר שלהם פנוטיפ כנף מתולתל o דומיננטי. ציון צבע העיניים של כל זכר הטרוזיגים בסולם של 1 עד 5.עם ציון אחד שהוקצה פחות מ 5% אדום מפוזר שטח הפנים הכולל של העין. הוסף ציון שני זבובים עם שטח פנים כולל של 6 עד 25% נקודה אדומה. שלושה זבובים עם שטח פנים כולל של 26 עד 50% נקודה אדומה.ארבעה זבובים עם 51 עד 75% שטח פנים כולל של עין נקודה אדומה. וחמישה זבובים עם שטח פנים כולל של יותר מ-75% נקודה אדומה. לאחר מכן לחשב את אינדקס הצבע הממוצע של כל הזכרים מכל בקבוקון הבקיע ב- triplicate.כדי לאשר כי התרכובות אכן לקדם היווצרות הטרוכרומטין, טכניקת אימות שונה, כגון כתמים מערביים, ניתן לבצע. בניסוי מייצג זה, ספריית תרופות מולקולה קטנה, אונקולוגיה להגדיר 3, אשר מורכב 97 תרופות אונקולוגיות מורשה ה-FDA, הוקרן באמצעות זן DX1 של Drosophila Melanogaster. על פי ההקרנה, מטוטרקסאט, מקודד כמו E7 בספרייה, גרם וריאציה ביותר בתוך זן Dx1.מציע כי מטוטרקסט יכול להיות התרופה המבטיחה ביותר לקידום הטרוכרומטין לטיפול ממוקד סרטן בעתיד. כדי לאשר עוד יותר כי תרכובת זו מקדמת טרנספורמציה הטרוכרומטין, נתונים כתם מערבי בוצע. הדגמת הרגולציה של הטרוכרומטין פורמטין הקשורים חלבון, H3K9 trimethylation, ואימות תוצאות ההקרנה.הצעד הקריטי הוא ניקוד צבע העיניים של כל אחד לבן 11-18 DX1 זבובים זכר הטרוזיגים בסולם של אחד עד חמישה על פי מסלול מחקר קבוע מראש. אנחנו יכולים להשתמש כתמים מערביים או immunostaining כדי לאשר את הלהיטים. הגילוי של תרכובות החשודות לקדם היווצרות הטרוכרומטין עשוי גם להוביל לגילוי של מנגנון גנטי IV של התפתחות סרטן וניסויים קליניים בחולים אנושיים.

a-screening-method-for-identification-heterochromatin-promoting-drugs

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

לאחרונה תפוקה גבוהה טכנולוגיית ריצוף גדלה מאוד הרגישות של הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הניסוי מתבקש יישומו באמצעות תאים או רקמות גזור מטוהרים. כאן אנו קובעים שיטה להשתמש בטכניקה שבב...

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

סרטון זה מתאר שיטת סינון לזיהוי זבובי דרוזופילה טרנסגניים, שהגנום שלהם שונה באמצעות CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 הוא כלי רב עוצמה לעריכת גנום שחולל מהפכה באופן שבו מדענים יכולים לתמרן את הגנום של אורגניזם. בפרוטוקול לדוגמה, נראה כיצד לזהות מוטציות שנוצרו על ידי קריספר, שבו החדרה של רצף טרנסאקטיבציה מחליפה את האקסון הראשון של הגן חסר הענף (bnl), ובכך יוצרת קו דרייבר ספציפי לגן bnl, bnl-LexA.

סינון שינויים גנומיים: שיטה לזיהוי מוטציות שנוצרו על ידי קריספר בדרוזופילה

מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, המרחיב את התועלת של מודל עובר דרוזופילה.

שיטה של ​​permeabilization של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות

מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב תסיסנית

עבודה זו מתאר פרוטוקול עבור הדור של רזולוציה גבוהה בחיי עיר ויטמינצ'יק ספריות מ מבוים בחוזקה gastrulation קדם דרוזופילה melanogaster עוברי.

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות גישה גנטית הקדמי למסך עבור מוטציות המציגות ניוון נוירוזוסופילה מלאנוגסטר. היא משלבת שיטת טיפוס, ניתוח היסטולוגיה, מיפוי גנים ורצפי דנ א בסופו של דבר לזהות גנים חדשניים הקשורים לתהליך של הגנה עצבית.

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

שיטה זו נועדה לעקוב אחר היווצרות תחומים PRC2-בתיווך כרומטין בקווי התא, ואת השיטה ניתן להתאים מערכות רבות אחרות.

שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים

פרוטוקול זה מיועד הדמיה וניתוח של הדינמיקה של כיוון התאים ואת צמיחת רקמות בתוך הבטן הדרוזולה epithelia כמו זבוב הפרי עובר מטמורפוזה. המתודולוגיה המתוארת כאן ניתנת להחלה על חקר שלבים, רקמות ומבנים תת-סלולאריים שונים בדרוזופילה או באורגניזמים אחרים במודל.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

פרוטוקול זה נועד לדמיין אגרגטים הטרוקרומטין בתאי טוריטנה Drosophila.

כתמים אימונופלואורסצנטיים להדמיה של חלבונים הקשורים הטרוכרומטין בבלוטות הרוק של דרוסופילה

ניתוח מחזור התא עם תיוג 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) ו פוספו-histone H3 (pH3) הוא הליך רב-שלבי שעשוי לדרוש אופטימיזציה נרחבת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את כל השלבים עבור הליך זה כולל ניתוח תמונה וכימות כדי להבחין בין תאים בשלבי מחזור תאים שונים.

5-אתניל-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 פרוטוקול תיוג כפול לניתוח התקדמות מחזור התא בתאי גזע עצביים Drosophila

כאן, אנו מציגים פרוטוקול תיוג גנים אנדוגני פשוט עבור דרוזופילה, המשתמש בטכניקה מבוססת PCR לזיהוי ללא סמנים של שינויים גנטיים מוצלחים, מה שמקל על פיתוח קווי דפיקה יציבים.

אסטרטגיה מבוססת CRISPR בצעד אחד לתיוג גנים אנדוגניים בדרוזופילה מלנוגסטר

למד שיטת הקרנה לזיהוי תרכובות המקדמות הטרוכרומטין בדרוזוהילה באמצעות פנוטיפי צבע עין משתנים. פרוטוקול זה מספק מערכת פשוטה ויעילה לזיהוי תרופות לטיפול בסרטן.

שיטת הקרנה לזיהוי הטרוכרומטין-קידום תרופות באמצעות דרוזוהילה

גלה סרטונים נוספים