Name: ניתוח של פגמים לב מולדים בעוברי עכבר באמצעות שיטות היסטולוגית איכותית וכמותית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: חקור שיטות היסטולוגיה איכותיות וכמותיות לניתוח פגמים לב מולדים בעוברי עכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקר בקרדיולוגיה התפתחותית ומשפר שיטות אבחון קליניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מעבדת אגירי נתמכת על ידי הלב הלאומי, הריאות, ומכון הדם של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס K01HL135464 ועל ידי איגוד הלב האמריקני תחת מספר הפרס 19IPLOI34660342.

<ol><li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+human+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li>
<li>Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+Heart+Disease%3A+Causes%2C+Diagnosis%2C+Symptoms%2C+and+Treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).</li>
<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li>
<li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+congenital+heart+disease%3A+The+glass+half+empty%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Genetics of congenital heart disease: The glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li>
<li>Pelech, A. N., Broeckel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+etiologies+of+congenital+heart+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Toward the etiologies of congenital heart diseases.</a> Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).</li>
<li>Zaidi, S., Brueckner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+Genomics+of+Congenital+Heart+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).</li>
<li>Kenny, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+in+the+single+ventricle+population%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation in the single ventricle population.</a> Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).</li>
<li>Navaratnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-Induced+Systemic+Venous+Hypertension+in+the+Fontan+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation.</a> The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).</li>
<li>De Leval, M. R., Deanfield, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+decades+of+Fontan+palliation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Four decades of Fontan palliation.</a> Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).</li>
<li>Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+structure-function+relations+in+health+and+disease%3A+part+II.+Clinical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardio-Thoracic+Surgery+%3A+Official+Journal+of+the+European+Association+for+Cardio-thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).</li>
<li>Jenkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninherited+risk+factors+and+congenital+cardiovascular+defects%3A+Current+knowledge+-+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association+Council+on+Cardiovascular+Disease+in+the+Young%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young.</a> Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).</li>
<li>Botto, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+rate+of+selected+congenital+heart+defects+with+better+maternal+diet+quality+%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood+-+Fetal+and+Neonatal+Edition%22%5BJournal%5D)">Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study.</a> Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).</li>
<li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Folic+Acid+Supplementation+and+the+Risk+of+Congenital+Heart+Defects+in+Offspring+%3A+A+Meta-Analysis+of+Epidemiological+Observational+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies.</a> Scientific Reports. 17 (5), 8506(2015).</li>
<li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signalling+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+retinoic+acid+levels+and+the+development+of+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015(2016).</li>
<li>Kurian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+long+noncoding+RNAs+underlying+vertebrate+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development.</a> Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).</li>
<li>Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+toward+heart+regeneration%3A+Stem+cells+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).</li>
<li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+or+breaking+the+heart%3A+from+lineage+determination+to+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.</a> Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).</li>
<li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).</li>
<li>Baldock, R., Bard, J., Davidson, D. Stage Definition. , https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998).</li>
<li>Newbern, J., et al. Mouse and human phenotypes indicate a critical conserved role for ERK2 signaling in neural crest development. , http://www.pnas.org/cgi/content/full (2008).</li>
<li>Carleton College. Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center. , https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017).</li>
<li>Reinking, L. Examples of Image Analysis Using ImageJ. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007).</li>
<li>MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+ejection+fraction+is+determined+by+both+global+myocardial+strain+and+wall+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22IJC+Heart+and+Vasculature%22%5BJournal%5D)">Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness.</a> IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).</li>
<li>Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+Ventricular+Noncompaction+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+in+the+Child+and+Young+Adult%3A+From+Bench+to+Bedside%22%5BJournal%5D)">Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy.</a> Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , Elsevier. 269-290 (2018).</li>
<li>Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+left+ventricular+trabeculae+using+cardiovascular+magnetic+resonance+for+the+diagnosis+of+left+ventricular+non-compaction%3A+evaluation+of+trabecular+volume+and+refined+semi-quantitative+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria.</a> Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24(2016).</li>
</ol>

למחברים אין כל גילוי לדווח.

פרוטוקול זה בוחן את הטכניקות המעורבות בניתוח של התפתחות הלב בלבבות עובריים. חלק מהמגבלות של שיטה זו הן המיומנות הפיזית הנדרשת עבור טכניקות ההכנה, שעשויות לדרוש תרגול, ומיומנות עם דימות מיקרוסקופ. אם הפרוסות המתקבלות בקריוסטט מלוכלכות, המטאוקסילין והאאוזין כתמים לא יהיו ברורים, או אם התמונות הננקטות במיקרוסקופ יש תאורה ירודה, אז השיטה המשמשת עם ImageJ לא יעבוד. מגבלה של תכונת הסף של תוכנת ImageJ היא שהיא בוחרת פיקסלים הממוקמים בקצה אחד של סף התלוי בערך הפיקסל. לכן, כל הפיקסלים הקיימים בצד הלא נכון של הסף ייכללו או לא ייכל...

Chds הם הסוג הנפוץ ביותר של פגם הלידה בבני אדם הם הגורם המוביל של לידה מוות פגמים הקשורים1,2,3,4,5,6. למרות כ 90% של הילדים היילוד לשרוד CHD, הוא משויך לעתים קרובות עם תחלואה משמעותית התערבויות רפואיות במהלך השנים, הטלת נטל כבד על חיי החולים ומערכת הבריאות7,8,9,10. מחוץ לגורמים גנטיים גרידא, הגורמים ל-CHD מובנים בצורה עלובה4. לא מזוהה גורם לחשבון של ~ 56-66% של כל המקרים CHD על פי איגוד הלב האמריקני ומקורות אחרים2,3,4,11. גורמים ידועים כוללים מוטציות גנטיות, CNVs, דה נובו נוקלאוטיד יחיד משתנים, ו aneuploidy. הוא חשד כי גורמים סביבתיים ותזונתיים הם גם מקורות חשובים לתרום CHD, כפי שהוצע על ידי מחקרים אפידמיולוגיים קישור אורח חיים אימהי2,12, מחסור כלכלי, ומרוץ13, ועל ידי מחקר לתוך גורמים תזונתיים כגון חומצה פולית11,14 ואת חומצה retinoic השומנים הביואקטיבית15,16. חקירת מנגנונים וגורמים של מומים וכלי דם אחרים חשוב לפתח אסטרטגיות מניעה ואפשרויות הטיפול הרומן1,4,17,18,19.
העכבר המתפתח הוא דגם אבן פינה ללימוד CHD ביונקים. עם זאת, חלק מהשיטות והניתוחים המועסקים, כגון ניתוח שמירה על מורפולוגיה של הלב, אנליזה של שלבים התפתחותיים וזיהוי של פגמים משויכים ב-CHD, יכולים להרתיע מדענים החדשים לניתוח לבבות מורתיים. מטרת השיטות המתוארות בפרוטוקול זה היא להציע קווים מנחים איכותיים וכמותיים לתהליכים אלה. כך, בפרוטוקול זה אנו מסבירים כיצד לבצע מצות מתוזמן כדי לייצר עוברים בשלב ההריון הרצוי, לנתח נשים הרות להתאוששות לב שלמה (כולל רקמות הקשורות כגון מערכת הזרימה), קיבעון לב והכנה ל קריוסטט התגובה, בסיסי שיטות היסטולוגיה, ניתוחים כמותיים של מומים לב נפוצות, ניתוח איכותני של compaction שריר הלב, הקודמן משותף פנוטיפים לסוגים מסוימים של CHD.

<table><tbody><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים</td> <td>פישר סיינטיפיק</td> <td># 1495970C</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J עכברי</td><td>ג'קסון מעבדות</td><td>C57BL/6J - מלאי 000664</td><td></td></tr><tr><td>צנצנות מכתים קופלין (x6)</td><td>VWR Scientific</td><td># 25457-006</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים 24X50 מ"מ #1.5</td><td>VWR Scientific</td><td># 48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat - Leica CM3050S</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח צלחות(ים)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td># 50930381</td><td></td></tr><tr><td>דומונט #5 - מלקחיים עדינים (x2)</td><td>כלים מדעיים עדינים</td> <td># 11254-20</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Eosin Y</td><td>Millipore Sigma</td><td># HT110116-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול אתילי (טהור, 200 הוכחה)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td># BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td># E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Millipore Sigma</td><td># 03989-100ML</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td> <td># 14060-10</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו פלורסנט Leica M165 FC</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Millipore Sigma</td><td># 410225-250G</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים Graefe</td><td>Fine Science Tools</td> <td># 11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 8 תוכנה</td><td>Graphpad ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנה</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td># 06666A</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ההמטוקסילין של מאייר</td><td>Millipore Sigma</td><td># MHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>קצה(ים) מיקרופיפטה - p200</td><td>Fisher Scientific</td><td># 02707448</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת</td> <td>Microsoft ExcelMicrosoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>VWR Scientific</td><td># 102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Olympus CkX53 מיקרוסקופ</td> מברשות צבע <td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(לפחות 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>VWR Scientific</td><td># 0215014601</td><td>להפוך לתמיסה של 4% (מומסת ב-PBS)</td></tr><tr><td>פיפטה פסטר (ים)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td># 13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 70011044</td><td>לדלל מ-10x ל-1x לפני השימוש</td></tr><tr><td>ב-Scale</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS1602TS</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS105</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל #3</td><td>VWR Scientific</td><td># 10161-918</td><td></td></tr><tr><td>להבי אזמל</td><td>VWR Scientific</td><td># 21909-612</td><td></td></tr><tr><td>עובש מרובע</td><td>VWR Scientific</td><td># 100500-224</td><td>לתבניות OCT</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Millipore Sigma</td><td># S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td># 1255015</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיות</td><td>כלים מדעיים עדינים</td> <td># 14002-14</td><td></td></tr><tr><td>להבי מיקרוטום חד פעמיים Tissue-Tek Accu-Edge</td><td>VWR Scientific</td><td># 25608-964</td><td></td></tr><tr><td>סולם נסיעות</td><td>Acculab</td><td>VIC 5101</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Millipore Sigma</td><td>214736-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של פגמים לב מולדים בעוברי עכבר באמצעות שיטות היסטולוגית איכותית וכמותית

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

מומים לב מולדים (CHD) הם הסוג הנפוץ ביותר של פגם מולד בבני אדם, המשפיעים על 1% של כל לידות חי. עם זאת, הסיבות הבסיסיות ל-CHD עדיין מובנות בצורה עלובה. העכבר המתפתח מהווה מודל חשוב למחקר של CHD, מכיוון תוכניות התפתחותיות לב בין עכברים ובני אדם הם שמרו במידה רבה. הפרוטוקול מתאר בפרוטרוט כיצד לייצר עוברי העכבר של שלב ההיריון הרצוי, שיטות לבידוד ולשמר את הלב עבור עיבוד במורד הזרם, שיטות כמותיים כדי לזהות סוגים נפוצים של CHD על ידי היסטולוגיה (g., במחיצה הבין-חדרית פגמים, פרפור מומים בעלי גביע, כמותי מסוג דוטוס, ושיטות כמותית למדידת הפנוטיפים השכיחים של השרירים. שיטות אלה לבטא את כל השלבים המעורבים הכנה לדוגמה, איסוף, וניתוח, המאפשר למדענים למדוד בצורה נכונה מחקר CHD.

מדד השריר שרירים הושווה בין לבבות המתפתחים בשתי סביבות שונות, שליטה וקבוצה ניסיונית. פרוטוקולים אלה שימשו כדי לנתח את הדחיסה של רקמת שריר רקמות, אשר התיר ניתוח סטטיסטי. דחיסת שרירים הוכח להצטמצם באופן משמעותי בלבבות הניסיוניים ביחס לעוברים שפותחו בתנאים שאינם ניסיוניים.
העוברים נזרקו אם תזמון ההתבוננות לא היה מדויק. למרות שהצמיחה הננסיים של העוברים יכולה להיות תוצאה של הטיפול בניסוי, ויש מגוון בהתקדמות התפתחותית, הרבייה הייתה מל...

בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליכים באיכות ובכמת לנתח פנוטיפים התפתחותיים בעכברים הקשורים למומים מולדים לב.

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

פרוטוקול זה מתקנן טכניקות חדשות לניתוח רקמות כך שהן יכולות להיות בשימוש נרחב יותר על ידי קבוצות אחרות אשר גם ללמוד מומים מולדים בלב. מכיוון שלטכניקות ניתוח איכותיות וכמותיות יש את היתרונות והחסרונות שלהן, מתודולוגיה זו משתמשת הן כדי לענות על הטווח הרחב ביותר של שאלות ניסיוניות. טכניקות אלה יכולות להיות השפעה חיובית על שיטות אבחון קרדיולוגיה.לדוגמה, פתולוגים יכולים ליישם את טכניקות ניתוח רקמת הלב המיקרוסקופית שלנו לקראת אבחון מחלות לב אנושיות מדגימות ביופסיה. פרוטוקול זה יכול לשמש לקרדיולוגיה התפתחותית או למחקר קרדיולוגי כללי. עם זאת, שיטות אלה מספקות גם טכניקות שימושיות שונות שניתן ליישם כלפי כל ניתוח רקמות.כדי לאסוף יום עוברי 15 עד 15.5 לבבות, לאבטח את הגפיים של סכר בהריון ולהתחיל סביב השופכה עד עצם החזה, בזהירות לעשות חתך בצורת I לאורך פלג הגוף העליון. באמצעות מדפים בתנועה סקופ, בעדינות להרים את הרחם מתוך חלל הבטן תופס את הרקמות השטחיות של הרחם לפי הצורך עם מטחנים עדין כדי לסייע בחילוץ. השתמש במספריים כדי לשחרר את הרחם מהבטן.לאחר השריית הרחם ב- PBS קר כקרח, הצמד את האיבר לתוך צלחת ניתוח. בעזרת מספריים, חותכים את הרחם לחלקים בודדים שכל אחד מהם מכיל עובר נפרד. באמצעות שני זוגות של מדפים עדין, בעדינות לקלף את העוברים מתוך רקמת הרחם ולמקום אותם לצלחת פטרי חדשה המכילה ארבע מעלות צלזיוס PBS-EDTA.כדי לאסוף את הלבבות, מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ לנתח ולהשתמש בשני זוגות של מטלפים עדין כדי למקם את העובר לתוך המיקום supine. לאחר ייצוב הגישה לחזה, השתמש בנקודה החדה של זוג מלקחיים עדין שני כדי לבצע חתך לאורך עצם החזה של העובר המשתרע בין עצם הבריח לטבור. ביצוע חתכים עדין מאוד שטחי תוך כדי עבודה הדרגתית לכיוון החלק הפנימי של חלל החזה, לפתוח את הבטן של העובר.כאשר הלב רק הופך גלוי, להשתמש בזוג מדפים כדי לסחוט את פלג הגוף העליון מעט מתפנק לכלוב הצלעות לקלף את הצלעות פתוחות. באמצעות הצדדים של זוג אחד של מדפים, בעדינות לתפוס את כלי הדם ריאתי מבלי להפריד את הרקמה ולמשוך את הלב מתוך החלל. נקו את הלב ב-PBS-EDTA טרי למשך שעה עד שתי דקות לפני תיקון הרקמה ב-4% Paraformaldehyde למשך 45 עד 60 דקות.לאחר מכן, לשטוף את הלב שלוש פעמים במשך 5 עד 10 דקות לשטוף PBS בתוספת גליצין. לפני אחסון הלבבות ב PBS בארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין את הלב להקפאה, מניחים את הדגימות לתוך צינור של 30% סוכרוז ו PBS בארבע מעלות צלזיוס במשך 24 עד 40 שעות.כאשר הלבבות שקעו לתחתית הצינור, השתמש פיפיטור עם קצה שונה להעביר בזהירות כל לב אל חתיכת מנגב חינם מוך. לאחר ייבוש אוויר קצר, מניחים כל דגימה בתבניות טמפרטורת חיתוך אופטימליות בודדות בכיוון הרצוי לחיתוך. לטביע את הרקמות במדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלי ללא בועות.לאחר מכן, לאחסן את התבניות ב 20 מעלות צלזיוס עד כמה ימים לפני הקפאת הרקמות ב 80 מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות לפני cryosectioning. כדי להשיג קטעי קריוסטט של הדגימות, השתמש בינוני חיתוך טמפרטורה אופטימלית טרי כדי לחבר את בלוק הרקמה של עניין צ'אק של cryostat ולאפשר למדיום להקפיא עד שהוא לבן אטום. הכנס להב חדש והתאם את המרחק בין בלוק הרקמה ללהב כדי לאפשר השגת מקטעים.חותכים את הבלוק בפרוסות 10 מיקרומטר עד להגעת נקודת העניין. כאשר ניתן לצפות ברקמה, השתמש במברשת צבע שטוחה קטנה כדי למשוך בעדינות את הפרוסה כנגד הדוכן בהיתוך מתמשך. לאחר הרקמה נחתכה לחלוטין דרך, להשתמש במברשת הפרטים כדי לטפוח את הפרוסה שטוחה על הבמה.החזק את החלק במקומו למשך כ- 20 עד 30 שניות לפני הסרת המברשת המפורטת וסיום הפרוסה. השתמשו בשתי מברשות הצבע כדי לשטח בעדינות את הפרוסה על הבמה המונעת גלגול ולהחזיק את קטע הרקמה על הבמה. לאחר 20 עד 30 שניות, הפוך את המקטע ושטח אותו שוב על הבמה לפני הצבת שקופית טעונה אלקטרוסטטית קרוב מספיק כדי לפרוסה להימשך לדבוק בשקופית מבלי לגעת בשקופית לבמה.כדי להעריך את מקטעי רקמת הלב לנוכחות של מומים נפוצים בלב, באמצעות מיקרוסקופ המצויד במצלמה, השג תמונות בהגדלות של פי 5 עד 10X ו- 40X. לניתוח דחיסת שריר לב, פתח רקמה מעניינת בתוכנה מתאימה לניתוח תמונה והגדר את התמונה ל- 8 סיביות. כדי לקבוע את סף התמונה, לחצו על 'תמונה', 'התאם' ו'סף' והזיזו את הסרף העליון להתאמת הסף עד שנבחרו רק הפיקסלים לרקע.לאחר מכן, השתמש בכלי בחירות מצולע כדי לצייר אזור עניין סביב הרקמה ולאחר מכן לחץ על נתח, הגדר מדידות, שטח וגבלה לסף. לחצו על 'נתח' ו'מדוד' כדי למדוד את אזור הפיקסלים המסומן כדי לקבל את ערך אזור הרווח השלילי. למדידת האזור של אזור הריבית כולו, לחצו על 'נתח', 'קבע מידות' ו'בטלו את הסימון באפשרות 'הגבל לסף'.לאחר מכן, בחר נתח ולמדוד כדי למדוד את כל האזור של אזור העניין שנבחר. כדי לחשב את אזור רקמת השריר, הפחת את אזור החלל השלילי מאזור אזור העניין. ואז לחלק את האזור של רקמת השריר על ידי האזור של אזור העניין כדי לחשב את דחיסת השריר X.The הכתם של פרוסות רקמה מלבבות עובריים שנקטפו, מספק ניגוד מספיק כדי להפוך את קצוות הרקמה, אבל הוא לא כל כך כהה כמו כדי להפוך את תכונות התא בלתי ניתן להבחנה.בניתוח מייצג זה, דחיסת השרירים נצפתה להיות מופחתת באופן משמעותי בלבבות הניסוי ביחס לעוברים שהתפתחו בתנאים שאינם ניסיוניים. דגימות אלה הן בעלות ערך ודורשות זמן רב ליצירתן. במהלך necropsies ואת ניתוח קריוסטט במיוחד, הקפד להיות מכוון על כל פעולה שאתה מבצע.שימור הרקמות בפרפורמלדהיד שומר על פעילות האנטיגן המאפשרת שימוש בדגימות לבדיקות כמו כתמי Aminofluorescein המסייעים בזיהוי גורמים פתולוגיים שנמצאו במהלך הערכת המורפולוגיה. במעבדה שלנו, השגנו ייצוג כמותי של טיפולים ניסיוניים שיכולים לעזור לנו לזהות את מידת הטיפולים השונים המשפיעים על הדגימות שלנו. Paraformaldehyde יכול לתקן כל רקמה שהוא נוגע.יש לדאוג תמיד ללבוש כפפות כדי למזער את העור החשוף ולעבוד ברדס הסרט בכל פעם עובד עם זה כימי.

analysis-congenital-heart-defects-mouse-embryos-using-qualitative

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מוות עובר ולידה הוא תכונה נפוצה כאשר לומדים שינויים גנטיים המשפיעים על התפתחות לב. הדמית אולטרסאונד בתדר גבוה השתפרה רזולוצית 2-D ויכולה לספק מידע מצוין על התפתחות מוקדמת ולב היא שיטה אידיאלית כדי לזהות את ההשפעה על מבנה ותפקוד לב לפני המוות.

אקו העוברי Murine

אולטרסאונד בתדירות גבוה במיוחד הוא כלי הדמיה חיה רב עוצמה כדי לבחון מומים לב בבעלי חיים קטנים. noninvasiveness שלו מאפשר שמירה על המצב הפיזיולוגי של עוברים. בזאת, אנו מציגים את השימוש באולטרסאונד M-mode כדי למדוד את קצב הלב של עוברים בE18.5 ברחם.

במדידת רחם של קצב לב בעכבר על ידי אקו M-המצב פולשנית

מוטציות המובילות למומי לב מולדים מפיקות תועלת מחקירה in vivo של מבנה הלב במהלך ההתפתחות, אך מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה בלב העוברי של העכבר הם מאתגרים מבחינה טכנית. כאן אנו מציגים שיטת אימונופלואורסצנציה וניתוח תמונה חזקה להערכת מבנים ספציפיים לקרדיומיוציטים בלב העכבר המתפתח.

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

בדיקה echocardiographic משמש לעתים קרובות בעכברים. מכשירי אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה יקר פותחו למטרה זו. פרוטוקול זה מתאר הליך echocardiographic סבירים בשילוב עם morphometric היסטולוגית ניתוחים כדי לקבוע מורפולוגיה לב.

בבדיקה היסטולוגית ו echocardiographic של מורפולוגיה לב העכבר

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כל הר immunofluorescence וניתוח מבוססת תמונה כמותית volumetric העובר העכבר בשלב מוקדם. אנו מציגים טכניקה זו כמו בגישה רב-עוצמה איכותית באופן כמותי להעריך מבנים לב במהלך הפיתוח, ואני מציע כי ייתכן נרחב יכולת הסתגלות למערכות איברים אחרים.

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

אולטראסאונד בתדירות גבוהה הדמיה של העכבר עוברית השתפרה דימות ברזולוציה, יכול לספק אפיון פולשני מדויק של התפתחות הלב, פגמים מבניים. פרוטוקול המתוארים במסמך זה מיועדת לביצוע בזמן אמת עוברי עכברים אקוקרדיוגרפיה ויוו.

הדמיה באמצעות מערכת סאונד בתדירות גבוהה (30 / 45MHZ) וכלי דם עוברי העכבר

אנו מציגים את הפרוטוקולים לבחון התפתחות הלב העכבר באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלם על העכבר עוברי גזור מן חדרית ספציפי MLC-2v-tdTomato כתב טוק-אין עכברים. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע בכל שלב של היווצרות חדרית במהלך התפתחות הלב העכבר מבלי מהגידולים שיטות מעבדה הומנית.

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

מאמר זה מפרט את שיטות האבחון של מחלת לב מולדת (CHD) באמצעות אקוקרדיוגרפיה עוברית, נקרופסיה, ולכידת תמונה פלואורסצנטית אפיסקופית (EFIC) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי אפיסקופי (ECM) ואחריו שחזור תלת ממדי (3D).

צינור לאפיון מומי לב מבניים בעכבר העוברי

כאן אנו מדווחים על תיוג כפול של תאי ציצה עצביים וכלי דם באמצעות השתלת צינור עצביGFP אפרוחים בשילוב עם הזרקת DiI תוך וסקולרית. טכניקה ניסיונית זו מאפשרת לנו לדמיין וללמוד בו זמנית את ההתפתחות של מערכת העצבים (האנטרית) הנגזרת מ- NCC ומערכת כלי הדם, במהלך אורגנוגנזה.

תיוג כפול של תאי ציצה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות שתל צינור עצביGFP אפרוח והזרקת צבע DiI Carbocyanine

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להזריק סוכני אולטרסאונד ניגוד microbubble לחיים, עוברים עכברי שלב מאוחר-הריון מבודד. שיטה זו מאפשרת הלימוד של פרמטרים זלוף ושל סמנים מולקולריים של כלי דם בתוך העובר באמצעות הדמיה אולטרסאונד בתדר גבוה חומר ניגוד.

הדמיה ניגודיות בעכבר עוברים באמצעות תדר גבוהים אולטראסאונד

חקור שיטות היסטולוגיה איכותיות וכמותיות לניתוח פגמים לב מולדים בעוברי עכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקר בקרדיולוגיה התפתחותית ומשפר שיטות אבחון קליניות.

ניתוח של פגמים לב מולדים בעוברי עכבר באמצעות שיטות היסטולוגית איכותית וכמותית

גלה סרטונים נוספים