ניתוח של פגמים לב מולדים בעוברי עכבר באמצעות שיטות היסטולוגית איכותית וכמותית

פרוטוקול זה מתקנן טכניקות חדשות לניתוח רקמות כך שהן יכולות להיות בשימוש נרחב יותר על ידי קבוצות אחרות אשר גם ללמוד מומים מולדים בלב. מכיוון שלטכניקות ניתוח איכותיות וכמותיות יש את היתרונות והחסרונות שלהן, מתודולוגיה זו משתמשת הן כדי לענות על הטווח הרחב ביותר של שאלות ניסיוניות. טכניקות אלה יכולות להיות השפעה חיובית על שיטות אבחון קרדיולוגיה.

לדוגמה, פתולוגים יכולים ליישם את טכניקות ניתוח רקמת הלב המיקרוסקופית שלנו לקראת אבחון מחלות לב אנושיות מדגימות ביופסיה. פרוטוקול זה יכול לשמש לקרדיולוגיה התפתחותית או למחקר קרדיולוגי כללי. עם זאת, שיטות אלה מספקות גם טכניקות שימושיות שונות שניתן ליישם כלפי כל ניתוח רקמות.

כדי לאסוף יום עוברי 15 עד 15.5 לבבות, לאבטח את הגפיים של סכר בהריון ולהתחיל סביב השופכה עד עצם החזה, בזהירות לעשות חתך בצורת I לאורך פלג הגוף העליון. באמצעות מדפים בתנועה סקופ, בעדינות להרים את הרחם מתוך חלל הבטן תופס את הרקמות השטחיות של הרחם לפי הצורך עם מטחנים עדין כדי לסייע בחילוץ. השתמש במספריים כדי לשחרר את הרחם מהבטן.

לאחר השריית הרחם ב- PBS קר כקרח, הצמד את האיבר לתוך צלחת ניתוח. בעזרת מספריים, חותכים את הרחם לחלקים בודדים שכל אחד מהם מכיל עובר נפרד. באמצעות שני זוגות של מדפים עדין, בעדינות לקלף את העוברים מתוך רקמת הרחם ולמקום אותם לצלחת פטרי חדשה המכילה ארבע מעלות צלזיוס PBS-EDTA.

כדי לאסוף את הלבבות, מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ לנתח ולהשתמש בשני זוגות של מטלפים עדין כדי למקם את העובר לתוך המיקום supine. לאחר ייצוב הגישה לחזה, השתמש בנקודה החדה של זוג מלקחיים עדין שני כדי לבצע חתך לאורך עצם החזה של העובר המשתרע בין עצם הבריח לטבור. ביצוע חתכים עדין מאוד שטחי תוך כדי עבודה הדרגתית לכיוון החלק הפנימי של חלל החזה, לפתוח את הבטן של העובר.

כאשר הלב רק הופך גלוי, להשתמש בזוג מדפים כדי לסחוט את פלג הגוף העליון מעט מתפנק לכלוב הצלעות לקלף את הצלעות פתוחות. באמצעות הצדדים של זוג אחד של מדפים, בעדינות לתפוס את כלי הדם ריאתי מבלי להפריד את הרקמה ולמשוך את הלב מתוך החלל. נקו את הלב ב-PBS-EDTA טרי למשך שעה עד שתי דקות לפני תיקון הרקמה ב-4% Paraformaldehyde למשך 45 עד 60 דקות.

לאחר מכן, לשטוף את הלב שלוש פעמים במשך 5 עד 10 דקות לשטוף PBS בתוספת גליצין. לפני אחסון הלבבות ב PBS בארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין את הלב להקפאה, מניחים את הדגימות לתוך צינור של 30% סוכרוז ו PBS בארבע מעלות צלזיוס במשך 24 עד 40 שעות.

כאשר הלבבות שקעו לתחתית הצינור, השתמש פיפיטור עם קצה שונה להעביר בזהירות כל לב אל חתיכת מנגב חינם מוך. לאחר ייבוש אוויר קצר, מניחים כל דגימה בתבניות טמפרטורת חיתוך אופטימליות בודדות בכיוון הרצוי לחיתוך. לטביע את הרקמות במדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלי ללא בועות.

לאחר מכן, לאחסן את התבניות ב 20 מעלות צלזיוס עד כמה ימים לפני הקפאת הרקמות ב 80 מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות לפני cryosectioning. כדי להשיג קטעי קריוסטט של הדגימות, השתמש בינוני חיתוך טמפרטורה אופטימלית טרי כדי לחבר את בלוק הרקמה של עניין צ'אק של cryostat ולאפשר למדיום להקפיא עד שהוא לבן אטום. הכנס להב חדש והתאם את המרחק בין בלוק הרקמה ללהב כדי לאפשר השגת מקטעים.

חותכים את הבלוק בפרוסות 10 מיקרומטר עד להגעת נקודת העניין. כאשר ניתן לצפות ברקמה, השתמש במברשת צבע שטוחה קטנה כדי למשוך בעדינות את הפרוסה כנגד הדוכן בהיתוך מתמשך. לאחר הרקמה נחתכה לחלוטין דרך, להשתמש במברשת הפרטים כדי לטפוח את הפרוסה שטוחה על הבמה.

החזק את החלק במקומו למשך כ- 20 עד 30 שניות לפני הסרת המברשת המפורטת וסיום הפרוסה. השתמשו בשתי מברשות הצבע כדי לשטח בעדינות את הפרוסה על הבמה המונעת גלגול ולהחזיק את קטע הרקמה על הבמה. לאחר 20 עד 30 שניות, הפוך את המקטע ושטח אותו שוב על הבמה לפני הצבת שקופית טעונה אלקטרוסטטית קרוב מספיק כדי לפרוסה להימשך לדבוק בשקופית מבלי לגעת בשקופית לבמה.

כדי להעריך את מקטעי רקמת הלב לנוכחות של מומים נפוצים בלב, באמצעות מיקרוסקופ המצויד במצלמה, השג תמונות בהגדלות של פי 5 עד 10X ו- 40X. לניתוח דחיסת שריר לב, פתח רקמה מעניינת בתוכנה מתאימה לניתוח תמונה והגדר את התמונה ל- 8 סיביות. כדי לקבוע את סף התמונה, לחצו על 'תמונה', 'התאם' ו'סף' והזיזו את הסרף העליון להתאמת הסף עד שנבחרו רק הפיקסלים לרקע.

לאחר מכן, השתמש בכלי בחירות מצולע כדי לצייר אזור עניין סביב הרקמה ולאחר מכן לחץ על נתח, הגדר מדידות, שטח וגבלה לסף. לחצו על 'נתח' ו'מדוד' כדי למדוד את אזור הפיקסלים המסומן כדי לקבל את ערך אזור הרווח השלילי. למדידת האזור של אזור הריבית כולו, לחצו על 'נתח', 'קבע מידות' ו'בטלו את הסימון באפשרות 'הגבל לסף'.

לאחר מכן, בחר נתח ולמדוד כדי למדוד את כל האזור של אזור העניין שנבחר. כדי לחשב את אזור רקמת השריר, הפחת את אזור החלל השלילי מאזור אזור העניין. ואז לחלק את האזור של רקמת השריר על ידי האזור של אזור העניין כדי לחשב את דחיסת השריר X.The הכתם של פרוסות רקמה מלבבות עובריים שנקטפו, מספק ניגוד מספיק כדי להפוך את קצוות הרקמה, אבל הוא לא כל כך כהה כמו כדי להפוך את תכונות התא בלתי ניתן להבחנה.

בניתוח מייצג זה, דחיסת השרירים נצפתה להיות מופחתת באופן משמעותי בלבבות הניסוי ביחס לעוברים שהתפתחו בתנאים שאינם ניסיוניים. דגימות אלה הן בעלות ערך ודורשות זמן רב ליצירתן. במהלך necropsies ואת ניתוח קריוסטט במיוחד, הקפד להיות מכוון על כל פעולה שאתה מבצע.

שימור הרקמות בפרפורמלדהיד שומר על פעילות האנטיגן המאפשרת שימוש בדגימות לבדיקות כמו כתמי Aminofluorescein המסייעים בזיהוי גורמים פתולוגיים שנמצאו במהלך הערכת המורפולוגיה. במעבדה שלנו, השגנו ייצוג כמותי של טיפולים ניסיוניים שיכולים לעזור לנו לזהות את מידת הטיפולים השונים המשפיעים על הדגימות שלנו. Paraformaldehyde יכול לתקן כל רקמה שהוא נוגע.

יש לדאוג תמיד ללבוש כפפות כדי למזער את העור החשוף ולעבוד ברדס הסרט בכל פעם עובד עם זה כימי.