Name: הדמיה חיה של ציטוסקלטון Microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של Arabidopsis לירות מריסטם Apical (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: חקור הדמיה חיה של ציטוסקלטון מיקרוטובולים במריסטמה אפיקלית של Arabidopsis תוך שימוש במניפולציה מיקרומכנית. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של תגובות מכניות בין גנוטיפים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. גידול צמחים
<ol><li>לזרוע זרעי Arabidopsis המביעים תחום מחייב microtubule התמזגו עם חלבון פלורסנט ירוק (MBD-GFP)10 על הקרקע ולשמור ביום ארוך (16 שעות יום / 8 שעות בלילה), 20 מעלות C / 6 ° C תנאים במשך שבוע אחד לנביטה.</li>
	<li>לאחר הנביטה, להעביר שתילים סירים חדשים עם שטח צמיחה מספיק כדי לאפשר צמיחה צמחית חזקה. לשמור על צמחים ביום קצר (8 שעות ביום / 16 שעות בלילה), 20 מעלות צלזיוס / 16 ° C תנאים במשך 3-5 שבועות.</li>
	<li>להעביר צמחים ליום ארוך (16 שעות ביום / 8 שעות בלילה), 20 מעלות צלזיוס / 16 מעלות צלזיוס תנאים ולשמור עד צמחים בריח (2-3 שבועות). אפשר לתנופה לגדול עד 2-5 ס"מ.</li>
</ol>2. הכנה בינונית
<ol><li>מכינים את המנות על ידי מילוי מנות פטרי קטנות (ברוחב של כ-5.5 ס"מ, בעומק של 1.5 ס"מ) לכמחצית מהעומק שלהן עם 2% א-גרוז. ניתן להשתמש בכלי ה לנתח גם להדמיה חד-ית-ממדית.</li>
	<li>הכן את מדיום הצמיחה.<ol>
<li>להכין 50 מ"ל של תמיסת ויטמין 1,000x עם 5 גרם של מיו-אינוזיטול, 0.05 גרם של חומצה nicotinic, 0.05 גרם של הידרוכלוריד פירידוקסין, 0.5 גרם של תיאמין הידרוכלוריד, ו 0.1 גרם של גלצין.</li>
		<li>הכינו את מדיום הצמיחה, המורכב מ-1/2 Murashige ו-Skoog medium, 1% סוכרוז, 1.6% אגר, ויטמינים 1x, pH = 5.8. Autoclave ולאפשר לו להתקרר.</li>
		<li>על ספסל סטרילי ונקי, מחטאים קופסאות פלסטיק תלויות (כ-5.2 ס"מ על 5.2 ס"מ על 3 ס"מ) על ידי טבילה ב-70% אתנול למשך 15 דקות.</li>
		<li>על ספסל סטרילי ונקי, ברגע שהמדיום נמצא בחום נסבל, מוסיפים N6-benzyladenine לריכוז סופי של 200 00 00 00 00 00 00 00:00:00,000 ,1/100 דפים חמים (תערובת משמרת של הצמח) ומערבבים היטב. ממלאים את הקופסאות הסטריליות לכמחצית מהעומק שלהן במדיום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. פירוק SAM
<ol><li>חותכים את התפרחת ולהסיר את ניצני הפרחים הישנים עם מפלצות חדות על ידי קילוף הפרחים בבסיס ה-peduncles עד שקשה לראות אותם בעין בלתי.</li>
	<li>יוצרים חתך באגרוז בצלחת הקטנת עם מפלצות ושותלים את בסיס התפלה לתוך הגר העבה. זה נותן תמיכה מוצקה טובה עבור ניתוח בסדר נוסף של פרחים צעירים כדי לחשוף את SAM.</li>
	<li>הסר את ניצני הפרחים הנותרים על-ידי דחיפתם כלפי מטה עם המגרסה המחליקה ביותר ומתקדמת באופן רציפים לשלבים הצעירים יותר תחת מיקרוסקופ לנתח עד שה-SAM נראה לעין. SAM חשוף בדרך כלל כאשר פרחים ישנים עד שלב 6 עד 7 מוסרים. לאחר חשיפה של SAM, הימנע מהתייבשות הדגימה על-ידי מעבר מהיר לשלב הבא.</li>
</ol>4. העברה וצמיחה של כספומטים תרבותיים
<ol><li>לשתול את המדגם טרי לנתח כמפורט בסעיף 1 לתוך מדיום הצמיחה בתיבת התרבות מלבני פלסטיק צירים עם SAM רק נחשף מעל פני השטח הבינוני. הוסף כמה טיפות של מים ילייליים לקצוות של תיבות התרבות ולסגור את המכסה כדי לשמור על הלחות בתוך הקופסה. ודא שהמים הנוספים אינם מכסים את SAM.</li>
	<li>סגור את המכסה ועטוף את התיבה בקלטת מיקרופור. מקם את תיבת הצמיחה בתנאי יום ארוך או יום רציף ב 22 °C ולגדול במשך 12-24 שעות כדי לאפשר SAM להתאושש מהליך הניתוק ולהתאים את עצמו לתנאי התרבות.</li>
</ol>5. הדמיה של SAM
<ol><li>מלא את תיבת התרבות המכילה את SAM במים סטריליים כדי לכסות את הדגימה. בדוק תחת מיקרוסקופ לנתח ולהסיר את כל בועות אוויר על ידי ריסוס בכוח מים מכוון לדגימה עם פיפטה 1 מ"ל.</li>
	<li>מניחים את תיבת התרבות על שלב מיקרוסקופ קונפוקאלי זקוף. דאג כי תיבת התרבות אינה יוצרת קשר עם מטרות המיקרוסקופ. השתמשו בעדשת טבילה מים למרחקים ארוכים של 40x או 60x של צמצם מספרי 0.8-1, האופטימלית להדמיה ללא זכוכית כיסוי.</li>
	<li>הנמיך את המטרה לתוך המים ובדוק בועות אוויר שנוצרו על העדשה הקדמית של המטרה. הסר את כל הבועות על ידי הורדת הבמה ולנגב בעדינות את העדשה עם רקמה אופטית והוספת כמות קטנה של מים לעדשה הקדמית של המטרה עם פיפטה פסטר לפני reimmersion לתוך המים.</li>
	<li>באמצעות מסנן GFP ומודול תאורת אפינפרין של המיקרוסקופ הנוקודאלי, התאם את בקר ה-XY כדי לאתר את הדגימה. כוונון מיקום עינית, לשים את SAM ישירות מתחת למקור האור ולהתמקד לאורך ציר Z עד ממוקם העל. הערה: אל תסתכל ישירות על האור האולטרה סגול.</li>
	<li>ברגע שהדגימה נמצאת, להאיר אותו באמצעות לייזר מסוגל GFP מרגש (כלומר, 488 נארם או 496 nm מקור לייזר). כוונן את הזום האופטי של המיקרוסקופ כך שכל SAM ופרמורדיה פרחונית שלב 1 יהיה בשדה התצוגה. כוונן עוד יותר את העוצמה של פלט הלייזר והשיג הגדרות כדי להבטיח יחס מיטבי של אות לרעש. הערה: העוצמה הגבוהה של הלייזר תגרום להלבנת תמונה של המדגם. לוח הצבעים מתחת וחשיפת יתר מסייע להבטיח התאמה טובה יותר של הגדרות אלה.</li>
	<li>אפשר לדגימה להתיישב במשך 2-5 דקות. רכוש ערימות Z קונפוקלי של המדגם ב 0.25 μm-0.5 μm Z מרווחי פרוסה ברזולוציה של כ 0.3 μm גודל פיקסל. ודא שזמן ההדמיה הכולל הנדרש לרכישת ערימות Z עבור מדגם אחד אינו עולה על 10 דקות מזמן טבילה הדגימה במים עד להשלמת הרכישה.</li>
	<li>מיד להסיר את המים ולהעביר את תיבת התרבות בחזרה לתא הצמיחה. שמירה על הדגימות במשך זמן רב מתחת למים תשפיע על המצב האוסמוטי של התאים.</li>
</ol>6. תדהמה מיקרומכנית של SAM
<ol><li>הגדר את תנאי ההדמיה כמתואר בסעיף 5 ורכוש ערימות של תמונות קדם-דם של ארגון המיקרו-טבולה הקליפתית.</li>
	<li>לתן את המים בצלחת התרבות. בצע את אבלציה עם מחט מזרק נקי (0.4 מ"מ x 20 מ"מ).<ol>
<li>באמצעות מיקרוסקופ לנתח, בזהירות להחזיק את המחט ולגשת לאט SAM. הערה: החזקת נשימה וטיפול במחט עם אחיזה רגועה מסייעת להימנע מרעידות.</li>
		<li>צרו קשר קצר עם כיפת SAM עם קצה המחט כדי לאשר כי אבלציה נעשתה. עדיף לבצע את אבלציה בפריפריה של SAM, המאפשר הדמיה של ההתנהגות ומעבר של microtubules קליפתיים לא מאורגנים באזור המרכזי של הכיפה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למלא מחדש את צלחת התרבות עם מים deionized סטרילי ולהוסיף idodide propidium (10 μg / מ"ל). בנוסף לניטור אות המיקרוטבול הקליפתי GFP, הדמיית הנואידיום של הנואידיד באמצעות ערוץ נפרד יכולה לסמן בבירור אזורים של תאים מבלבלים. פרופידיום iodide מואר באמצעות 561 נמיר או כל לייזר מתאים אחר עם פליטה נרשם בין 600-650 נמיר.</li>
	<li>רכוש ערימות תמונה מיד לאחר אבלציה (ראה סעיף 6) וחזור על תהליך הרכישה כל 2 שעות לתקופה של 6 שעות. מחזירים את צלחת התרבות יחד עם הדגימה לתא הדגירה לאחר כל נקודת זמן. ודאו שנשארו מים בתקשורת התרבות ועטפו את מנת התרבות בקלטת מיקרופור כדי למנוע היבש.</li>
</ol>7. הדמיה של נתונים וכמות
<ol><li>צור הקרנת פני השטח באמצעות תוכנות זמינות באופן חופשי כגון MORPHOGRAPHX11,פיג'י 12, או מאקרו SurfCut13.</li>
	<li>לבצע חילוץ של אניסטרופיה מיקרוטובול קליפתי באמצעות FibrilTool14 מאקרו בפיג'י. הערה: ניתן להשיג פרוטוקולים מפורטים לשימוש בתוכנה מהציטוטים המתאימים.</li>
</ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li>
<li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+cellulose+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li>
<li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li>
<li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li>
<li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoGraphX%3A+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864(2015).</li>
<li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li>
<li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516(2010).</li>
<li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis%3A+a+quantitative+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li>
<li>Nakayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+auxin-mediated+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of auxin-mediated growth.</a> Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).</li>
<li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li>
<li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+SurfCut%3A+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38(2019).</li>
<li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FibrilTool%2C+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li>
<li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967(2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036(2019).</li>
<li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li>
<li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

ההערכה של אירועי תמרת אותות מכניים היא קריטית לזיהוי רגולטורים מולקולריים המעורבים במסלולי התפיסה והמתמר המכנו. הפרוטוקול המתואר כאן מספק תצוגה כמותית של אירועים כאלה באמצעות תגובת microtubule קליפתי כקריאה עבור תהליך כזה ב- Arabidopsis SAMs. ההליך המתואר כאן משמש באופן שגרתי במספר מחקרים בסוגירקמות שונים 16,17,18,19. עלייה משמעותית אניסטרופיה microtubule נצפתה בטווח של 4 שעות בכל סוגי...

תאי הצמח מוקפים מטריצה חוץ תאית של פוליסכרידים ו גליקופרוטינים הדומה מכנית לחומר מרוכב מחוזק סיבים המסוגל לשנות באופן דינמי את תכונותיו המכניות1. צמיחה בתאי הצמח מונעת על ידי ספיגת מים לתוך התא, מה שופך הצטברות במקביל של כוחות מתיחה על קיר התא. בתגובה לכוחות כאלה, שינויים במצב הפיזי של קיר התא מאפשרים התרחבות תאים. תאים עם קירות ראשיים מסוגלים לעבור צמיחה מהירה לעומת קיר תא משני המכיל תאים בעיקר בשל הבדלים בהרכב הכימי של הפוליסכרידים בפנים. תאי קיר ראשיים מורכבים תאית, hemicellulose, פקטין, בנוסף גליקופרוטינים, וחסר ליגנין, רכיב כי הוא קיים בקיר התא המשני2. תאית, פולימר גלוקוז מקושר באמצעות β-1,4 אג"ח, הוא המרכיב העיקרי של קירות התא. הוא מאורגן לתוך מבנים fibrillar המסוגלים לעמוד כוחות מתיחה גבוהה חוו במהלך צמיחת התא3. בנוסף לכוחות מתיחה עומדים, חיזוק מכני לאורך כיוון מועדף תוצאתו התרחבות מונעת טורגור לאורך ציר ניצב לכיוון נטו של מיקרופיבריל תאית. הארגון של מיקרופיבריל תאית מושפע microtubule קליפתי cytoskeleton, כפי שהם מנחים את התנועה הכיוונית של תאית סינתזה מורכבים הממוקמים קרום פלזמה4. לכן, ניטור ארגון microtubule קליפתי באמצעות חלבון או צינור הקשורים microtubule התמזגו עם מולקולת פלורסנט משמש פרוקסי לתצפית על דפוסים של תאית בתאי הצמח.
התבניות של השלד ציטוסק microtubule קליפתי נמצא תחת שליטה של מורפולוגיה תא ורקמות נגזר כוחות מכניים. ארגון microtubule קליפתי אין כל ארגון מועדף לאורך זמן בתאים הממוקמים בשיאו של SAM, בעוד תאים בפריפריה ואת הגבול בין SAM האיבר המתעוררים יש יציב, מערך סופר-גולגולתי מאורגן מאוד של מיקרוטובולותקליפתיות 5. מספר גישות פותחו כדי לפגוע פיזית במצב המכני של התאים. שינויים במצב osmotic, כמו גם טיפול עם תרכובות פרמקולוגיות אנזימטיות המשפיעות על הנוקשות של קיר התא יכול לגרום לשינויים הבאים בכוחות מתיחהשחוו תא 6,7. השימוש במתקן המאפשר עלייה הדרגתית בכוחות הלחץ שחוו רקמות הוא חלופה נוספת8. יישום של כוחות צנטריפוגליים גם הופק להשפיע על הכוחות המכניים ללא כל מגע פיזי עם התאים9. עם זאת, האמצעים הנפוצים ביותר של שינוי כוחות כיווניים בקבוצת תאים לנצל את העובדה כי כל התאים האפידרמיס נמצאים תחת מתח אבלציה פיזית של תאים יבטל את לחץ turgor באופן מקומי, כמו גם לשבש הדבקה מתא לתא, ובכך לשנות את כוחות מתיחה שחוו התאים השכנים. זה מבוצע או על ידי מיקוד לייזר אולטרה סגול פעמו רב עוצמה או באמצעות מחט בסדר.
כאן אנו מפרטים על תהליך ההדמיה וההערכה של התנהגות מיקרוטובולה קליפתית עבור סטייה מכנית ב SAM.

<table><tbody><tr><td>FibrilTool</td><td></td><td></td><td>Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012</td></tr><tr><td>גליצין</td><td>Merck</td><td>1.04201.1000</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica</td><td>DM6000 CS</td><td></td></tr><tr><td>MAP4-GFP</td><td></td><td></td><td>Marc, J. et al., Plant Cell 1998</td></tr><tr><td>קלטת מיקרופור</td><td>Leukopor</td><td>02482-00</td><td></td></tr><tr><td>MorphographX</td><td></td><td></td><td>Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019</td></tr><tr><td>myo-inositol</td><td>Sigma</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>N6-benzyladenine</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>חומצה ניקוטינית</td><td>Sigma</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>קופסת צירים מפלסטיק</td><td>מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>64312</td><td></td></tr><tr><td>PPM (תערובת משמרת צמחית)</td><td>טכנולוגיית תאים צמחיים</td><td>PPM</td><td></td></tr><tr><td>פרופידיום יודיד</td><td>סיגמא</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>פירידוקסין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td>P9755</td><td></td></tr><tr><td>SURFCUT</td><td></td><td></td><td>Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019</td></tr><tr><td>תיאמין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td>T4625</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה של ציטוסקלטון microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של arabidopsis לירות מריסטם apical

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

הבנת רגולציה ברמת התא והרקמות של צמיחה ומורחוגנזה כבר בחזית המחקר הביולוגי במשך עשורים רבים. ההתקדמות בטכנולוגיות מולקולריות והדמיה אפשרה לנו לקבל תובנות כיצד אותות ביוכימיים משפיעים על אירועים מורפוגנטיים. עם זאת, זה יותר ויותר ברור כי מלבד אותות ביוכימיים, רמזים מכניים גם להשפיע על מספר היבטים של צמיחת תאים ורקמות. Arabidopsis לירות meristem apical (SAM) הוא מבנה בצורת כיפה אחראי על הדור של כל האיברים מעל פני הקרקע. הארגון של השלד ציטוסק המיקרוטובולה קליפתית כי מתווכת תצהיר תאית אפופלסטית בתאי הצמח הוא ייחודי מרחבית. הדמיה והערכה כמותית של דפוסים של מיקרוטובוליות קליפתיות נחוצים להבנת האופי הביופיזי של תאים ב SAM, כמו תאית הוא המרכיב הנוקשה ביותר של קיר התא צמח. הצורה הסטריאוטיפית של ארגון מיקרוטובולה קליפתית היא גם תוצאה של כוחות פיזיים רחבים רקמות הקיימים ב-SAM. סטייה של כוחות פיזיים אלה וניטור עוקבות של ארגון מיקרוטובולה קליפתית מאפשר זיהוי של חלבונים מועמד מעורב בתיווך תפיסה מכנו ותזוזה. כאן אנו מתארים פרוטוקול המסייע לחקור תהליכים כאלה.

איור 1 מציג תמונות הקרנה אופייניות המתקבלות מקווי MBD-GFP עם תאים במרכז הכיפה המכילים מיקרוטובולות קליפתיות לא מאורגנות, ותאים בפריפריה בעליהתפלגות היקף (איור 1A,B), בעודשתאי תחום הגבול מכילים מיקרוטובולות קליפתיות המיושרות במקביל לציר הארוך של התא. תצפיות אלה מראות הבדלים בהתפלגות המרחבית של מיקרוטובולות קליפתיות בתחומים השונים של SAM. הדמיית זמן לשגות הראה יישור מיקרוטובולה קליפתית משתנה ממערך מופרע מאוד למערך ...

כאן אנו מתארים פרוטוקול להדמיית תאים חיים של השלד המיקרו-טבובול הקליפתי ב"ירי" ומנטר את תגובתו לשינויים בכוחות הפיזיים.

הדמיה חיה של ציטוסקלטון Microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של Arabidopsis לירות מריסטם Apical

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

פרוטוקול זה עוזר לנו להבין כיצד התנהגות ציטוסקלטון Microtubule מתרחשת בצמחים. יחד עם זאת, זה גם עוזר לנו להבין כיצד רכיבים מבניים אלה המשפיעים על צורת התאים והאיברים, מגיבים לשינויים בכוחות מכניים. אמנם, שיטה זו דורשת תחכום מועט, היא מספקת חזק, כמותי לקרוא אחרי, הבדלי התגובה המכנית בין genotypes שונים ותנאים.התחל בגידול זרעי arabidopsis המבטאת תחומים מחייבים microtubule התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק באדמה, ב 20 ו 6 מעלות צלזיוס בתנאי יום ארוכים במשך שבוע. לאחר הנביטה, מעבירים את השתילים לסירים חדשים עם מרחב צמיחה מספיק כדי לאפשר צמיחה צמחית חזקה, וממקמים את הצמחים ב 20 ו 16 מעלות צלזיוס בתנאי יום קצרים. לאחר שלושה עד חמישה שבועות, מעבירים את הצמחים בחזרה לתנאי יום ארוכים באותה טמפרטורה עד שהצמחים בורחים, ומאפשרים לתפרחת לגדול עד לאורך של שניים עד חמישה סנטימטרים.עבור לירות Apical Meristem dissection, לשים את תפרחת, ולהשתמש מלקחיים חדים לקלף את הפרחים בבסיס של peduncles, עד שקשה לראות את peduncles עם עין בלתי כדי להסיר את ניצני הפרחים הישנים. השתמש במקלות כדי ליצור חריץ אגרוס בצלחת חיטוי, ולשתול את בסיס תפרחת לתוך Augur עבה. מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ נותח.החל ניצן הפרח העתיק ביותר, לדחוף עם המדפים כדי להסיר את ניצן הפרח מן הצמח. מריסטם apical לירות נחשף בדרך כלל כאשר פרחים ישנים עד שלב שש עד שבע מוסרים. ולהשתמש במקלות כדי לדחוף כל ניצן פרח למטה עד מריסטם apical לירות גלוי.ברגע שהריסתם האפורית תיחשף, תן למדגם הטרי לנתח את מדיום הצמיחה בקופסת תרבות צירי פלסטיק מלבנית מעקרת אתנול עם מריסטם אפיקל לירות רק חשוף מעל פני השטח הבינוניים. מוסיפים כמה טיפות של מים סטריליים deionized לקצוות של תיבת התרבות ולסגור את המכסה כדי לשמור על הלחות בתוך התיבה. עוטפים את הקופסה בקלטת מיקרופור, וממקמים את תיבת הגידול בתנאי יום ארוכים או רציפים ב-22 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 24 שעות.כאשר הצמח התאושש מהליך הניתוח, לכסות את המדגם עם מים סטריליים deionized ולבדוק בועות אוויר תחת מיקרוסקופ ניתוח. העבר את תיבת התרבות לשלב מיקרוסקופ קונפוקל זקוף, ובחר את עדשת טבילת המים 40 או 60X. מנמיך את המטרה לתוך המים ולבדוק בועות אוויר על העדשה הקדמית של האובייקט.כדי להסיר בועות, להוריד את הבמה בעדינות לנגב את העדשה עם רקמה אופטית. לאחר מכן השתמש פיפטה פסטר להוסיף נפח קטן של מים לעדשה הקדמית של המטרה לפני מחדש לטבול את העדשה במים. לאחר מכן, השתמש במסנן GFP ובמודול תאורת האפי-אפיון של המיקרוסקופ הקונפוקלי כדי לכוונן את בקר ה- XY כדי לאתר את הדגימה.התאמת המיקום של העין, למקם את meristem apical לירות ישירות מתחת למקור האור, ולהתמקד לאורך ציר Z עד לשיא ממוקם. השתמש בלייזר המסוגל להאיר את הדגימה, ולהתאים את הזום האופטי של המיקרוסקופ, כך שהמריסטם האפורי כולו והפרימורדיה הפרחונית בשלב הראשון נמצאים בשדה המבט. לאחר מכן, התאימו את העוצמה של פלט הלייזר ואת הגדרות הרווח כדי לקבל יחס אות אופטימלי לרעש.לאחר מתן אפשרות לדגימה להסתפק בשתיים עד חמש דקות, רכוש ערימות קונפוקל Z של המדגם במרווחי פרוסת Z של 0.25 עד 0.5 מיקרומטר, והוסיף כ- 0.3 מיקרו פיקסלים בגודל רזולוציה. בסיום הרכישה, יש לפנות מיד את המים ולהעביר את קופסת התרבות בחזרה לתא הצמיחה. עבור Micromechanical לירות Apical Meristem Perturbation, לרכוש ערימות תמונה טרום אבלציה של ארגון microtubule קליפת המוח כפי שהוכח רק, ו decaf את המים מתיבת התרבות לתוך צלחת תרבות.העבר את מריסטם apical לירות תחת מיקרוסקופ ניתוח, ולאט לאט התקרב meristem אשוחית לירות עם מחט מזרק נקי 0.4 על ידי 20 מילימטר. צרו קשר בקצרה עם הפריפריה של כיפת הכיפה עם קצה המחט כדי לאשר שהאבלציה הושלמה. ול מילוי צלחת התרבות במים סטריליים.לאחר מכן מוסיפים 10 מיקרוגרם למיליליטר של פרופידיום יודיד למנה ומיד לרכוש ערימות תמונה כפי שהוכח כל שעתיים במשך שש שעות, להחזיר את צלחת התרבות הדגירה בין כל נקודת זמן. לניתוח נתונים, ליצור תחזיות פני השטח של ערימות התמונה באמצעות תוכנה לניתוח תמונה מתאימה, ולבצע חילוץ של אניסוטרופיה microtubule קליפת המוח באמצעות מאקרו כלי Fibril בפיג'י. כאן, תמונות הקרנה טיפוסיות המתקבלות מקווי GFP של תחום איגוד microtubule עם תאים במרכז הכיפה המכילים microtubules קליפת המוח לא מאורגנת, תאים בפריפריה, בעל התפלגות היקפית ותאי תחום גבול המכיל microtubules קליפת המוח מיושר במקביל הציר הארוך של התא ניתן לראות.דימות זמן לשגות, מראה יישור microtubule קליפת המוח משתנה ממערך הפרעה מאוד למערך מאורגן יותר בתוך שש שעות של אבלציה. טנטורים יכולים להיות מובלטים על תמונות microtubule קליפת המוח, ואת המידע שחולץ יכול להיות מיוצג על ידי התוויית anisotropy הממוצע לאורך זמן. בעת התאמת כוח פלט לייזר ולקבל הגדרות, אנחנו צריכים להבטיח את זה תצפית ברורה של תריסים ולנסות למנוע overexposure, כמו מעל אותות רוויים יכול להטות את כיוון מתיחה בניתוח מאוחר יותר.מיקרוסקופ כוח אטומי יכול להתבצע גם כדי להעריך כיצד השינויים בכוחות המכניים למעשה משפיעים על המצב הפיזי של קיר התא.

live-cell-imaging-microtubule-cytoskeleton-micromechanical

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

איתות 2 + Ca מסדירה תהליכים ביולוגיים מגוונים בצמחים. כאן אנו מציגים גישות לניטור לחץ אביוטי המושרה Ca מרחב ובזמן 2 + אותות בתאי ארבידופסיס ורקמות באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים מקודד גנטי Aequorin או Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca 2 + אותות בצמחים ארבידופסיס

הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

מאמר זה מדגים כיצד תרבות תודרנית לבנה השתילים בשטח פלטפורמה דו שכבתי microfluidic מגבילה את הבסיס העיקרי ואת שערות השורש למישור אופטי יחיד. פלטפורמה זו יכולה לשמש עבור הדמיה אופטית בזמן אמת מורפולוגיה שורש בסדר גם באשר דימות ברזולוציה של באמצעים אחרים.

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

אנחנו מדווחים על שיטה פשוטה רב-תכליתי לביצוע פלורסנט לחיות-הדמיה של עלים תודרנית לבנה על פני תקופה ארוכה של זמן. אנו משתמשים צמח תודרנית הטרנסגניים לבטא גן כתב פלורסנט תחת השליטה של יזם הקשורות חסינות כדוגמה להשגת הבנה ייתכן של תגובות חיסוניות הצמח.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

פרוטוקול זה מציג כיצד לחיות התמונה ולנתח את meristems apical לירות מכל מיני צמחים שונים באמצעות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

כאן, אנו מתארים את הדור, יישום של קבוצת הטרנסגניים תודרנית לבנה קווי המאפשרת ביטוי inducible, רקמות ספציפיות את meristems הראשי שלוש, את meristem apical לירות, meristem apical את שורש ו את cambium.

Inducible, תאים ייחודיים לסוג ביטוי תודרנית לבנה בתיווך דרך LhGR טרנס-הפעלה

כאן, אנו מתארים שיפור של שיטת Semi-in vitro (SIV) לצפייה בהנחיית צינור אבקה וקליטה ב- Arabidopsis thaliana, אשר מגביר את הקבלה של הביציות. ניתן לשלב את שיטת SIV cum septum בעלת תפוקה גבוהה עם קווי סמן gametophyte וחיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית כדי לפקח על התהליך הדינמי של ההפריה.

הדמיה חיה של קליטת צינור אבקה Arabidopsis והפריה כפולה בשיטת Semi-in vitro cum septum

מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

תנועת כרומוזומים במהלך פרופאזה מיוטית היא תופעה לא מובנת היטב שהיא בסיסית להיווצרות נבגים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה, ניתוח וכימות של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית במיוציטים זכריים של Arabidopsis thaliana .

אפיון הדמיה חיה של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית זכרית ב- Arabidopsis thaliana

תהליך זה עושה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם גרעין מסומן פלואורסצנטי וקו סמן כרומטין ב-Arabidopsis thaliana כדי לתעד בו-זמנית את דינמיקת הגרעין והכרומטין בשורשי הערבידופסיס ולחקור שינויים בדינמיקה אלו בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים.

הדמיה כמותית של תאים חיים של צורת גרעין ודינמיקת כרומטין במהלך ההתפתחות ולחץ סביבתי בשורש Arabidopsis thaliana

חקור הדמיה חיה של ציטוסקלטון מיקרוטובולים במריסטמה אפיקלית של Arabidopsis תוך שימוש במניפולציה מיקרומכנית. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של תגובות מכניות בין גנוטיפים שונים.

הדמיה חיה של ציטוסקלטון Microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של Arabidopsis לירות מריסטם Apical

גלה סרטונים נוספים