Name: טיהור של פיברותקיעות ותאי Schwann מפני חושים ומוטוריים עצבים בחוץ גופית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: למד שיטה לטיהור פיברובלסטים ותאי Schwann מעצבים תחושתיים ומוטוריים בחוץ גופית. הפרוטוקול מספק טוהר של מעל 90% ומאפשר מחקר ביולוגי של התחדשות עצבים ומחלות מערכת העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (גרנט No. 2017YFA0104703), הקרן הלאומית הטבעית של סין (גרנט No. 31500927).

מחקר זה נעשה בהתאם להנחיות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת נאנטונג. כל ההליכים כולל הנבדקים בעלי חיים אושרו מבחינה אתית על ידי ועדת המינהל של בעלי חיים ניסיוניים, מחוז ג'יאנגסו, סין.
1. בידוד ותרבות של מנוע ומעצבי עצבים חושי וה scs
<ol><li>שימוש בן שבעה ימים בג-דאולי (SD) חולדות (n = 4) שסופקו על ידי מרכז החיות הניסיוני של אוניברסיטת נאנטונג של סין. מניחים את החולדות במיכל המכיל 5% isofלאנה עבור 2-3 דקות, לאפשר לבעלי חיים לנשום לאט ואין להם פעילות עצמאית, ולאחר מכן חיטוי באמצעות 75% אתנול לפני עריפת ראש.</li>
	<li>להשתמש במספריים לחתוך את העור האחורי עבור כ 3 ס מ ולהסיר את עמוד השדרה. פתח את תעלת החוליות בזהירות כדי לחשוף את חוט השדרה.</li>
	<li>לשמור על חוט השדרה ב 60 mm צלחת פטרי עם 2-3 mL של הקרח קר D-הנקס מאוזנת תמיסת מלח (HBSS).</li>
	<li>בהתבסס על המבנה האנטומי, בלו את השורש הגחוני (העצב המוטורי) ולאחר מכן את השורש העצמי (העצב החושי) תחת מיקרוסקופ מבתר. לאחר מכן, למקם אותם בתוך הקרח קר D-הנקס מאוזנת תמיסת מלח (HBSS).</li>
	<li>לאחר הסרת HBSS, פורסים את העצבים לחתיכות 3-5 מ"מ עם מספריים ולעכל עם 1 מ ל של 0.25% (w/v) טריפסין ב 37 ° צ' עבור 18-20 דקות. לאחר מכן, תוספת עם 3-4 mL של DMEM המכיל 10% סרום של שור עוברי (FBS) כדי לעצור את העיכול.</li>
	<li>פיפטה את התערובת למעלה ולמטה בעדינות כ 10 פעמים ו צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות. לאחר מכן, למחוק את supernatant ולהשעות את הזרז ב 2-3 mL של DMEM בתוספת של 10% FBS.</li>
	<li>לסנן את ההשעיה התא באמצעות מסנן רשת שינוי 400, ולאחר מכן לחסן את התאים ב 60 מ"מ צלחת פטרי ותרבות ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO2. לאחר 4-5 ימים של culturing, לבודד את המעבר 0 (p0) פיברותקיעות ו ה scs לאחר שהגיעו 90% המפגש.</li>
	<li>בידוד ותרבות של ה scs (איור 1)<ol>
<li>שטוף את התאים פעם אחת באמצעות 1x PBS. הוסף 1 מ ל של 0.25% (w/v) טריפסין (37 ° צ') לכל 60 מ"מ צלחת פטרי כדי לעכל את התאים עבור 8-10 s בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 3 מ ל DMEM בתוספת עם 10% FBS להפסיק את העיכול.</li>
		<li>לפוצץ בעדינות את התערובת כדי לנתק את ה scs עם פיפטה. לאחר מכן לאסוף ו צנטריפוגה את ה scs ב 800 x g עבור 5 דקות.</li>
		<li>להיפטר supernatant ולהשעות את הזרז ב 3 מ ל של DMEM עם 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2 μM forskolin ו 10 ng/mL HRG, ולאחר מכן לאחר מכן לאחר התאים בתוך מצופה 60 mm צלחת פטרי. לאחר culturing ב 37 ° c עבור 30-45 דקות, הפיברותקיעות (כמה מספר של פיברותקיעות מתעכלים עם ה scs) לצרף לחלק התחתון של המנה.</li>
		<li>העבר את הסופרנטאנט (כולל ה scs) למנה נוספת פולי-L-ליזין (PLL) ולתרבות בינונית ב-37 ° c במשך יומיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בידוד ותרבות של פיברותקיעות (איור 1)<ol>
<li>לאחר הסרת הה scs (כפי שמוצג בשלב 1.8), רוחצים את הגידולים הנותרים במנות עם PBS 1 x ולאחר מכן מוסיפים 1 מ ל 0.25% (w/v) טריפסין כדי לעכל את הפיברומות עבור 2 דקות ב-37 ° c.</li>
		<li>הוסף את Dמאמ בתוספת של 10% FBS כדי לסיים את העיכול. לפוצץ את הפיברופיצוצים באמצעות פיפטה, ולאחר מכן לאסוף ו צנטריפוגה אותם ב 800 x g עבור 5 דקות.</li>
		<li>להיפטר supernatant, להשעות את הזרז עם 2 מ ל של DMEM המכיל 10% FBS, ולאחר מכן לחסן את התאים בצלחת פטרי 60 מ"מ מצופה. הפיברופיצוצים לאחר culturing עבור 30-45 דקות ב 37 ° c להצמיד לתחתית המנה. מחק את הסופרנטנט (כולל כמה מספרים של ה scs). לאחר מכן להוסיף 3 מ ל של DMEM בתוספת של 10% FBS לתוך הצלחת והתרבות הפיברומותקיעות ב 37 ° c עבור 2 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מעבר את התאים p1 עד שהם הגיעו 90% המפגש. לאחר מכן טהרו אותם מעיכול משלים ומדבקות דיפרנציאליות כמתואר בסעיפים 1.8 ו-1.9.</li>
	<li>לעכל את הפיברותקיעות p2 ו ה scs לאחר culturing עבור 2 ימים, ולאחר מכן לאסוף את התאים, ספירה והאיחסן ב 1 x 105 מספרים/גם על מגלשות pll-מצופה (ICC).</li>
</ol>2. ICC לזיהוי טוהר התא
<ol><li>תרבות התאים 24 שעות ב 37 ° c ולבצע מכתים ICC לאחר העיכול הדיפרנציאלי והדבקות הדיפרנציאליות של המנוע והה scs.</li>
	<li>לשטוף את המנוע ואת הפיברותקיעות חושים ו ה scs עם 1x PBS ולתקן אותם ב-200 μL/טוב של 4% פאראפורמלדהיד (pH 7.4) עבור 18 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לחסום את המדגם ה scs עם מאגר חוסם (0.1% טריטון X-100 ב 0.01 M PBS המכיל 5% הסרום עז) ולחסום את המדגם לדוגמה עם מאגר חוסם (0.01 M PBS המכיל 5% סרום עז) עבור 45 דקות ב 37 ° c לאחר שטיפת אותם עם PBS שלוש שלושה.</li>
	<li>הסר את מאגר חסימת, ו דגירה עם הנוגדנים העיקריים הבאים: העכבר חד שבטיים anti-CD90 נוגדן (סמן מסוים עבור הפיברותקיעות) (1:1000) לטיפול ב ובעכבר נגד S100 נוגדן (סמן ספציפי עבור ה scs) (1:400) עבור ה scs ב 4 ° c לילה.</li>
	<li>להשליך את הנוגדנים העיקריים, לשטוף עם PBS שלוש, ו דגירה עם נוגדנים משניים הבאים: אלקסה Fluor 594 עז נגד עכבר IgG (1:400) עבור פיברופיצוצים ו 488-עז מצומדת נגד עכבר IgG (1:400) עבור ה scs בטמפרטורת החדר עבור 1.5 h.</li>
	<li>לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS, ואת הכתם את גרעיני עם 5 μg/mL Hoechst 33342 לצבוע עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את המדגם עם 1x PBS שלוש ולטעון אותם באמצעות מדיום ההרכבה (20 μL/שקופית) על שקופית הזכוכית.</li>
	<li>קח את תצלומי התא על ידי מיקרוסקופ מוקד סריקת לייזר בשלושה שדות אקראיים עבור כל באר. הערך את המספר הכולל של תאים גרעינים ו-CD90-חיוביים, תאים S100-חיוביים ולאחר מכן חשב את אחוז התאים CD90-חיוביים ותאים S100-חיוביים, בהתאמה. לבצע את הצביעת בטרילקאט.</li>
</ol>3. הזרמת ציטונסה (FCA) לזיהוי של טוהר התא
<ol><li>הערכת הטוהר של הה scs המוטוריים והחושים, כפי שתואר בעבר על ידי FCA16. בקצרה, לעכל את מנוע p2 ופיברומופיצוצים חישה ו ה scs עם 0.25% (w/v) טריפסין, להשעות מחדש את כדורי התא, דגירה אותם במדיום קיבעון בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.</li>
	<li>מודיית את התאים עם בינונית חדירות ובדיקה באמצעות העכבר מונובטיים anti-CD90 נוגדן (0.1 μg/106 תאים, 200 μl) עבור הטיפול והנוגדן נגד S100 העכבר (1:400, 200 μl) עבור ה scs בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות, בהתאמה.</li>
	<li>מעכלה את התאים עם 488 עז מצומדת נגד העכבר IgG עבור 30 דקות. השתמש בקליבר FACS כדי לבצע את הזרימה cy, ולנתח את הנתונים באמצעות התוכנה Cell Quest.</li>
	<li>מארג התאים רק עם 488-עז מצומדת נגד העכבר IgG (קבוצת פיברופיצוצים) ועכבר IgG1 קפא [מוברג-21] (FITC)-בקרת Isotype (קבוצת ה scs), המשמשת כשליטה שלילית.</li>
</ol>4. אנליזה סטטיסטית
<ol><li>הציגו את כל הנתונים כאמצעי ± SEM. הערכת הבדלים סטטיסטיים בנתונים על-ידי בדיקה לא משויכתבאמצעות השימוש ב-גראפד פריזמה 6.0. הגדר משמעות סטטיסטית ב- p< 0.05. . בצעו את כל הפעולות בטריפליטה</li>
</ol>

<ol><li>Stierli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+homeostasis+and+regeneration+of+peripheral+nerve+is+distinct+from+the+CNS+and+independent+of+a+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28The+Company+of+Biologists%29%22%5BJournal%5D)">The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population.</a> Development (The Company of Biologists). , (2018).</li>
<li>Schubert, T., Friede, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoneurial+fibroblasts+in+myelin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).</li>
<li>Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibroblast+impact+on+Schwann+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).</li>
<li>Lavdas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+engineered+to+express+the+cell+adhesion+molecule+L1+accelerate+myelination+and+motor+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).</li>
<li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143 (1), 145-155 (2010).</li>
<li>Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Controls+the+Long-Term+Survival+and+Phenotype+of+Repair+Schwann+Cells+during+Nerve+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration.</a> Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).</li>
<li>Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+neuron-glial+cell+interaction+and+pathogenesis+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).</li>
<li>Hoke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+express+motor+and+sensory+phenotypes+that+regulate+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).</li>
<li>Brushart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+phenotype+is+regulated+by+axon+modality+and+central-peripheral+location%2C+and+persists+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experiment+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro.</a> Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).</li>
<li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Gene+Expression+in+Primary+Cultured+Sensory+and+Motor+Nerve+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 1016(2018).</li>
<li>Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeinstein%2C+DE+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22">Current Protocols in Neuroscience</a>. , (2001).</li>
<li>Palomo Irigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Purification+of+Primary+Rodent+Schwann+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).</li>
<li>Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide+promotes+Schwann+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation.</a> Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).</li>
<li>Pannunzio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+selecting+Schwann+cells+from+adult+mouse+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve.</a> Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).</li>
<li>Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+Schwann+cells+based+on+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting.</a> Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).</li>
<li>He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+in+the+biological+characteristics+between+primary+cultured+sensory+and+motor+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells.</a> Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).</li>
<li>Weiss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+transcriptomics+of+peripheral+nerve+tissue+and+cells+unravel+new+aspects+of+the+human+Schwann+cell+repair+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype.</a> Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

שתי אוכלוסיות התאים המרכזיות של עצבי היקפי כללו ה scs ופיברופיצוצים. הפיברותקיעות בעיקר תרבותית ו ה scs יכול במדויק לסייע במידול הפיזיולוגיה של הפיברותקיעות ו ה scs במהלך פיתוח עצבי היקפי והתחדשות. המחקר הראה כי P7 בתאי עצב מבוססי עכברוש הכיל כ 85% של S100-חיוביים ה scs, 13% של OX7-חיוביים הפיברופיצוצים ורק 1.5% של OX42-חיובי מקרופאגים13. למרות שמספר הפיברוכדורים הוא פחות מ-ה scs, שיעור ההתפשטות הראשוני של הפיברותקיעות מהיר יותר מזו של ה scs. לכן, Ara-C הוא סוכן antimitotic הנפוץ ביותר עבור הסרת פ...

במערכת העצבים ההיקפית, סיבי העצב מורכב בעיקר axons, התאים Schwann (ה scs), ופיברופיצוצים, וכן מכיל מספר קטן של מקרופאגים, תאי מיקרוכלי-דם אנדותל, ותאים חיסוניים1. ה scs לעטוף את האקסונים ביחס 1:1 ומוקפים בשכבת רקמת חיבור הנקראת endoneתוריון. לאחר מכן, האקטונים מאוחדים יחד כדי ליצור קבוצות שנקראות פססיקלס, וכל פסלול עטוף בשכבת רקמת חיבור המכונה הנקבים. בסופו של דבר, סיבי העצב עטוף בשכבת רקמת חיבור, אשר נקראת בתור הקולטן. ב-endoneurium כל אוכלוסיית התאים מורכבת מ-48% ה scs, וחלק ניכר מהתאים הנותרים כרוך בפיברותקיעות2. יתר על כן, הפיברובדורים הם מרכיבים חשובים של כל תאי העצב, כולל הפריאנארייון, הנקבים, והאניוניון3. מחקרים רבים ציינו כי ה scs ו פיברותקיעות לשחק תפקיד מכריע בתהליך התחדשות לאחר פציעות4עצביםהיקפית 4,5,6. לאחר רוחבי של עצב היקפי, הperineurial פיברופיצוצים להסדיר מיון התא באמצעות המסלול האפור-B/EphB2 איתות בין ה scs ופיברותקיעות, עוד המנחה את לצמיחה מחודשת סיבי באמצעות פצעים5. עצבי היקפי להפריש החלבון tenascin-C חלבונים ולשפר את הגירה של ה scs במהלך התחדשות העצב באמצעות β1-אינטגרציה איתות מסלול7. עם זאת, הה scs והפיברוטים המשמשים במחקרים שלעיל נגזרו מעצב הירך, הכולל הן חושים ועצבים מוטוריים.
במערכת העצבים ההיקפית, העצבים הסנסוריים (עצבי הגוף) מבצעים איתות חושי מן הקולטנים למערכת העצבים המרכזית (CN), בעוד העצבים המוטוריים (efferent עצבים) מבצעים אותות מתוך ה-CN אל השרירים. מחקרים קודמים הראו כי ה scs express מוטורית ופנוטיפים מוטוריים וחושים ומפרישות neurotrophic גורמים כדי לתמוך התחדשות היקפית עצביים8,9. על פי מחקר שנערך לאחרונה, פיברופיצוצים גם לבטא פנוטיפים מוטוריים וחושים שונים ולהשפיע על הגירה של ה scs10. כך, החקירה של הבדלים בין המנוע העצבי החושי פיברותקיעות/ה scs מאפשר לנו ללמוד את המנגנונים המורכבים הבסיסיים הבסיסית של התחדשות העצב ההיקפית הסגולי.
כיום, ישנן דרכים רבות כדי לטהר ה scs ופיברופיצוצים, כולל היישום של antimitotic סוכנים, נוגדן-תיווך cytolysis11,12, הimmunopanning סדרתי13 ו-למינציה ב-טקטי תשתית14. עם זאת, כל השיטות הנ ל להסיר את הפיברוכדורים ולשמר רק את ה scs. ה scs מאוד מטוהרים ופיברותקיעות ניתן להשיג על ידי הזרמת cy, לנסות מיון טכנולוגיה15, אבל זה זמן רב ויקר טכניקה. מכאן, במחקר זה, העיכול הדיפרנציאלי פשוטה ושיטת הדבקות הדיפרנציאליות לטיהור ובידוד החושים והעצבים המוטוריים והה scs פותחה על מנת להשיג מספר רב של פיברותקיעות וה scs במהירות רבה יותר.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594 עיזים נגד עכבר IgG(H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11005</td><td>דילול: 1:400</td></tr><tr><td>CoraLite488-מצומד Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)</td><td>Proteintech</td><td>SA00013-1</td><td>דילול: 1:400</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Cell Quest software</td><td>Becton Dickinson Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של D-Hank</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח</td><td>אולימפוס</td><td>SZ2-ILST</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099-141C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield הרכבה בינונית</td><td>Abcam</td><td>ab104135</td><td></td></tr><tr><td>מדיום קיבוע / מדיום פרמביליזציה</td><td>Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., Ltd</td><td>GAS005</td><td></td></tr><tr><td>זרימה ציטומטריה</td><td>Becton Dickinson Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - בקרת איזוטיפ</td><td>Abcam</td><td>ab106163</td><td>דילול: 1:400</td></tr><tr><td>נוגדן חד שבטי נגד CD90 עכבר Abcam</td><td></td><td>ab225</td><td>דילול: 1:1000 עבור ICC, 0.1 ומיקרו; g עבור תאי 106 עבור</td></tr><tr><td>נוגדן Flow Cyt Mouse anti-S100</td><td>Abcam</td><td>ab212816</td><td>דילול: 1:400</td></tr><tr><td>פוליליזין (PLL)</td> <td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF תחום חלבון</td><td>R& D Systems</td><td>396-HB-050</td><td></td></tr><tr><td>0.25% (w/v) trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור של פיברותקיעות ותאי schwann מפני חושים ומוטוריים עצבים בחוץ גופית

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

התאים העיקריים במערכת העצבים ההיקפית הם התאים של Schwann (ה scs) והפיברותקיעות. שני תאים אלה בבירור לבטא את הפנוטיפים חושי ומוטוריים מעורבים דפוסים שונים של ביטוי גנים neurotrophic factor ותהליכים ביולוגיים אחרים, המשפיעים על התחדשות העצב. המחקר הנוכחי הקים פרוטוקול כדי לקבל מאוד מטוהרים חושי החולדה ה scs מנוע ופיברותקיעות במהירות רבה יותר. השורש הגחוני (העצב המוטורי) והשורש הגבי (העצב החושי) של עכברי התרבות הבין-מלאכותית (שבעה ימים) היו מוטטים והתאים היו מתורבתים במשך 4-5 ימים, ואחריו בידוד של מנועי החישה והה scs על-ידי שילוב העיכול הדיפרנציאלי ושיטות הדבקות הדיפרנציאליות התוצאות של מנתח האימונוציטוכימיה והזרימה cyה scs try הראו כי הטוהר של החושים וה מוטוריים ופיברותקיעות היו > 90%. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבל מספר רב של החושים מוטוריים פיברותקיעות/ה scs במהירות רבה יותר, לתרום לחקר של התחדשות החושים ומוטורית.

התבוננות מיקרוסקופית קלה הה scs והפיברופיצוצים הם שתי אוכלוסיות התאים העיקריות המתקבלות בתרבות התא העיקרי מרקמות העצבים. לאחר החיסון במשך 1 שעות, רוב התאים הדבקו בתחתית המנה, והמבנה התאי השתנה מעגול לאליפסה. לאחר culturing עבור 24 שעות, ה scs הציג מורפולוגיה דו-קוטבית או tripolar האורך של אלה נע בין 100 אל 200 μm. לאחר 48 h, צבירה והתפשטות של תאים אירעו, שבו תאים רבים היו צבורים בקצה לקצה, כתף אל כתף, מערבולת או סידור הגדר כמו. הגידולים האחרים הגדולים יותר מה scs הציגו...

כאן, אנו מציגים שיטה כדי לטהר את התאים הסרטניים ואת תאי Schwann מפני חושים ועצבים מוטוריים בתוך מבחנה.

טיהור של פיברותקיעות ותאי Schwann מפני חושים ומוטוריים עצבים בחוץ גופית

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להשיג מספר רב של חיישן ואת פיברובלסט המנוע ותאי שוואן במהירות. התאים המתקבלים באמצעות הודעה זו יכולים לשמש בחקר התחדשות העצבים ומחלות מערכת העצבים. אנו מראים שהדגמה יכולה לייצג את הניסוי כדי לשלוט טוב יותר בזמן של צעד עיכול דיפרנציאלי ולהפוך את הצעדים הניסיוניים לקלים יותר להבנה.כדי להתפוצץ להשתמש במספריים כדי לבצע חתך של שלושה סנטימטרים, בעור הגב. הסר את עמוד השדרה. פתח בזהירות את תעלת החוליות כדי לחשוף את חוט השדרה.תחרה חוט השדרה בצלחת פטרי 60 מילימטר, עם שלושה עד ארבעה מיליליטר של קר קרח D הנקס פתרון מלח מאוזן תחת מיקרוסקופ ניתוח, בלו שורש הגחון ואת השורש הגבי. מניחים אותם בתווית מלח מאוזנת D קר כקרח. לאחר הסרת HBSS, לחתוך את העצבים לחתיכות שלושה עד חמישה מילימטר, עם מספריים.מוסיפים מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין ומעבירים את חתיכות העצבים לחמישה צינורות צנטריפוגה מיליליטר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 עד 20 דקות. לאחר מכן, כדי לעצור את העיכול, להוסיף ב 3-4 מיליליטר של DMEM המכיל 10% נסיוב חזיר עוברי.פיפטה את התערובת למעלה ולמטה בעדינות על 10 פעמים. צנטריפוגה ב 800 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר צנטריפוגה להשליך את העל טבעי.ולהשעות מחדש את המשקעים בשניים עד שלושה מיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS. לסנן את ההשעיה התא באמצעות מסנן רשת 400, ולאחר מכן להשתמש ההש

purification-fibroblasts-schwann-cells-from-sensory-motor-nerves

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים הליך לבידוד נוירונים של גנגליון שורש גבי (DRG) מעוברי חולדות וטיפוחם יחד עם מבשרי תאי Schwann ליצירת תאי Schwann בוגרים. ה-DRGs המבודדים מעובדים כדי לבודד תאי עצב ותאי גלייה. התאים המבודדים מתורבתים כדי לטהר את תאי העצב, אשר לאחר מכן מתורבתים יחד עם תאים דמויי תאי Schwann (SCLCs) במדיום של תרבית משותפת. אינטראקציה עם נוירוני DRG מובילה להבשלה של SCLCs לתוך תאי Schwann.

בידוד של נוירוני DRG והתרבות משותפת עם מבשרי תאי Schwann ליצירת תאי Schwann

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד וטיפוח תאי Schwann מרקמות דרמיס אנושיות. הדרמיס האנושי מכיל סוגי תאים שונים, כולל פיברובלסטים ותאי שוואן. לאחר הבידוד, התאים מטופלים עם סוכן antimitotic כדי לחסל פיברובלסטים מתרבים, וכתוצאה מכך תרבית טהורה של תאי Schwann.

בידוד ותרבית של תאי שוואן ראשוניים מדרמיס אנושי

סרטון זה מתאר את הבידוד והטיפוח של תאי Schwann משורשי עמוד השדרה של עכבר. תאים מבודדים עוברים תרבית במדיה ספציפית. תאי Schwann מבודדים באמצעות עיכול דיפרנציאלי והיצמדות. לאחר מכן הם מועברים לכיסויים חוץ-תאיים מצופים מטריצה לצורך התקשרות והתפשטות.

בידוד תאי Schwann משורשי עמוד השדרה של העכבר

סרטון זה מדגים את מודל ההתרבות של צמח גנגליון שורש גבי ותאי Schwann. בתנאי קוטורטור, חומצה אסקורבית מקדמת התמיינות של תאי Schwann לצורות myelinating. תאי Myelinating Schwann עוטפים את האקסונים מספר פעמים כדי ליצור מעטפת מיאלין, החיונית לתפקוד העצבים.

גידול משותף של צמח גנגליון שורש גבי עם תאי Schwann למיאלינציה של נוירונים

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי Schwann מסיבי עצב סיאטיים של עכבר.

הפרדה מגנטית של תאי Schwann מעצבים סיאטיים של עכבר

מקור: Han, J., et.al. ויסות צמיחת תאי שוואן על ידי שדה חשמלי פועם ננו-שניות להתחדשות עצבים היקפיים במבחנה. J. Vis. Exp. (2024)סרטון זה מדגים את היישום של טכניקת השדה החשמלי הפועם של ננו-שניות (nsPEF) כדי לווסת את צמיחת תאי שוואן (SC). הפולסים החשמליים המהירים גורמים לננו-נקבוביות חולפות בממברנות SC, מה שמקל על זרימת סידן המפעילה מסלולי איתות המניעים התפשטות SC, דה-דיפרנציאציה והפרשת גורמים נוירוטרופיים. תגובות תאיות אלו משפרות את התמיכה האקסונלית, הישרדות עצבית ומיאלינציה פוטנציאלית, ומדגישות...

ויסות צמיחת תאי שוואן במבחנה באמצעות טכניקת שדה חשמלי פועם ננו-שניות

מאמר זה מתאר מערכת תרבית עצבית שניתן להשתמש בה כדי להשיג כמויות גדולות של דגימות אקסונליות טהורות לאנליזות ביוכימיות ואימונוציטוכימיות. טכניקה זו תאפשר הבנה משופרת של פיזיולוגיה אקסונלית נורמלית ומסלולי איתות המובילים לניוון עצבי.

הפקה ובידוד של אקסונים מסנסורי ביוכימית ניתוח באמצעות מסננים נקבוביים

תאים מוחיים סטרומליים (MSC) עם פוטנציאל עצבי קיימים בתוך מוח העצם. הפרוטוקול שלנו מעשיר אוכלוסייה זו של תאים באמצעות תנאים מוקדמים היפוקסי ולאחר מכן מפנה אותם להפוך לתאי Schwann בוגרת.

Hypoxic Preonditioning של תאים יליד מארו נגזר כמקור לדור של תאים שוואן בוגרת

המחקר של ריפוי פצעים הקשורים לפגיעה בשרירים-שלד דורש לעתים קרובות הערכה של אינטראקציות במבחנה בין תאי שוואן (SCs), קרטינוציטים ופיברובלסטים. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, התרבות והאפיון של תאים ראשוניים אלה מהעורלה האנושית.

בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית

במערכת ההתרבות המשותפת של גרעיני השורש הגבי ותאי Schwann, ניתן ללמוד מיאלינציה של מערכת העצבים ההיקפית. מודל זה מספק הזדמנויות ניסיוניות לצפות ולכמת את המיאלינציה ההיקפית ולחקור את ההשפעות של תרכובות ריבית על מעטפת המיאלין.

מיאלינציה חוץ גופית של אקסונים היקפיים בתרבות משותפת של שורשי חולדה, גנגליון גבי, צמחים ותאי שוואן

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפעלת שדה חשמלי פולס ננו-שנייה (nsPEF) כדי לעורר תאי Schwann במבחנה. יכולת הסינתזה וההפרשה של גורמים רלוונטיים ושינויים בהתנהגות התא אימתו את הגירוי המוצלח באמצעות nsPEF. המחקר נותן מבט חיובי על שיטת התחדשות העצבים ההיקפית.

ויסות צמיחת תאי Schwann על ידי שדה חשמלי פועם ננו-שנייה להתחדשות עצבית היקפית במבחנה

למד שיטה לטיהור פיברובלסטים ותאי Schwann מעצבים תחושתיים ומוטוריים בחוץ גופית. הפרוטוקול מספק טוהר של מעל 90% ומאפשר מחקר ביולוגי של התחדשות עצבים ומחלות מערכת העצבים.

טיהור של פיברותקיעות ותאי Schwann מפני חושים ומוטוריים עצבים בחוץ גופית

גלה סרטונים נוספים