Name: הקלטה רב-יחידה חוץ-תאית מעצב הריח של טאוסט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: חקור רישום רב-יחידה חוץ-תאית מעצב הריח של טאוסט לבחינת רגישות חוש הריח בדגים ימיים. שיטה זו מודדת קלט חושי טהור לפני עיבוד במערכת העצבים המרכזית ומתאימה למינים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדת המחברים נתמכת על ידי Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), פורטוגל, פרויקטים PTDC/BIA-BMA/30262/2017 ו- UID/Multi/04326/2019 ותכנית חוזה DL57/2016/CP1361/CT041 ל-ZV.

תחזוקה וניסויים של בעלי חיים בוצעו במתקנים ניסיוניים מאושרים ועקבו אחר החקיקה הלאומית הפורטוגזית (DL 113/2013) תחת רישיון 'קבוצה-1' על ידי המנהל הכללי הווטרינרי, משרד החקלאות, פיתוח כפרי ודיג של פורטוגל. מכיוון שפרוטוקול זה כרוך בטיפול בבעלי חיים, יש לאשר אותו על ידי הגוף המקומי ו/או הלאומי המסדיר את רווחתם של בעלי חיים המשמשים בניסויים מדעיים, בנוסף על החוקרים לקבל את ההכשרה והרישיונות המתאימים לביצוע הליכים כאלה.
1. הכנת גירוי
הערה: לרוב הדגים יש מערכת חוש הריח רגישה מאוד, ולכן יש לנקוט בזהירות רבה בעת הכנת גירויי הריח לשימוש בניסוי. כלי הזכוכית המשמשים כדי לפצות את הגירויים יש לשטוף 5% אקונומיקה (נתרן hypochlorite), שטף ביסודיות עם מי ברז מי מי מיבש. מיד לפני השימוש לשטוף את כלי הזכוכית ביסודיות עם מי ים (אותם מים המשמשים כדי להפוך את דילול הגירוי). תדאג ששום אחד מהמים האלה לא יבוא במגע עם עור חשוף.
<ol><li>לעשות 100 מ"ל של 10-2 M L-גלוטמין, L-leucine ו L-serine; לאחסן 1 מיליון aliquots של כל אחד ב -20 °C עד לשימוש.</li>
	<li>ביום הניסוי, היכונו מאותם aliquots, 10-3 M עד 10-7 M פתרונות (בשלבים של דילול x10) באמצעות שליטה ומי ים CO2 גבוהים. הערה: L-serine(10-3 M) ישמש כפקד חיובי, או כסטנדרט. מים המשמשים כדי לפצות את דילול הגירויים, וטופלו בדיוק באותו אופן כמו הגירויים אבל ללא תוספת של כל ריח, ישמש שליטה שלילית או ריק.</li>
</ol>2. הכנת שליטה ומי CO2 גבוהים

<ol><li>הכן את מי הבקרה על ידי איסוף 1 L של מי ים מסוננים פחם.<ol>
<li>באמצעות בדיקת pH, בדוק את ה-pH; זה צריך להיות בסביבות 8.2. אם לא, בועה עם אוויר אטמוספרי עד pH זה מגיע.</li>
		<li>באמצעות טיטרטור אלקליות למדוד את האלקליות של המים.</li>
		<li>למדוד את טמפרטורת המים ואת המלוהות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן מים CO2 גבוה על ידי סינון 1 L של מי ים, ולאחרמכן בועה CO 2 עד pH הרצוי הוא הגיע.<ol>
<li>באמצעות בדיקת pH, בדוק את ה-pH; זה צריך להיות בסביבות 7.7.</li>
		<li>באמצעות טיטרטור אלקליות, למדוד את האלקליות של המים.</li>
		<li>למדוד את טמפרטורת המים ואת המלוהות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבועלחץ CO 2 הן שליטה ומים CO2 גבוה באמצעות תוכנה שנועדה לחשב פרמטרים CO2 במים (למשל, CO2Calcתוכנה 13).<ol>
<li>בחלון הקלט להוסיף את הערכים של pH מים, טמפרטורה, ממליחות ואלקליות מוחלטת(איור 1).</li>
		<li>בחר את הקבועים, היחידות וקנה המידות (ראה את הערכים המומלצים באות 2).</li>
		<li>לחץ על תהליך הלחצן כדי לקבוע לחץ CO2. הערה: איור 3 מציג דוגמה של גליון תוצאות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הכנת הדגים
הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש ב- 200-400 גרם.
<ol><li>להמם את דגי byimmersion במי ים טבעיים aerated המכיל MS222 (אתיל-3-aminobenzoate מלח מתנסולפונט). כאשר התגובה צביטה זנב נעצר, להזריק לתוך שריר האגף את החוסם הנוירו-שרירי גלאמין triethiodide (10מ"ג·ק"ג -1 בתמיסת מלח פיזיולוגית). הערה: ריכוז ההרדמה בשימוש משתנה בין מינים; עבור 200-400 גרם, השתמש ב- 200 מ"ג· L-1 אגירה עם 400 מ ג· L-1 NaHCO3.</li>
	<li>מניחים את הדג המהרסם על תמיכה מרופדת. הצורה והגודל המדויקים תלויים במין המודל; עבור seabream (200-400 גרם), השתמש בתמיכה מרופדת בצורת V, מצורה בבית.</li>
	<li>מניחים צינור סיליקון (קוטר = 10 מ"מ) בפה, לחבר את הצינור למשאבה צוללת במאגר של חומרי הרדמה, מי ים aerated, ומשאבת מים מעל הזימים ב ~ 100 mL·min-1· ק"ג-1. הערה: גודל צינור הסיליקון המשמש יהיה תלוי בגודל הדג.</li>
	<li>הכנס את סיכת ההשתה לשריר האגף וחבר אותה לשלב הראש של המגבר).</li>
	<li>מכסים את הדג במטלית לחה (או מגבת נייר) כשראשו חשוף בלבד, ומוודאים שהכיסוי אינו מסב את יציאת המים מהזימים. הערה: העיניים יכולות להיות מכוסות בחתיכות נייר/בד לחים או פלסטיק שחור.</li>
	<li>מקם את הצינור של מערכת אספקת הגירויים, כלומר, צינור הזכוכית המחובר לאספקת מי ים ברקע, לתוך נחיר. הערה: ניתן להשתמש בצינורות מיקרו-המטוקריט (אורך = 75 מ"מ, מזהה = 1.15 מ"מ, OD = 1.55 מ"מ); אלה יכולים להסתגר לנקודה עדינה יותר על מושך אלקטרודה לשימוש עם דגים קטנים יותר. חשוב לוודא כי אפיתל חוש הריח נשמר רטוב במהלך הניתוח (מתואר להלן).</li>
	<li>לחשוף את עצבי הריח על ידי הסרת העור והעצם של הגולגולת בין העיניים (עצבי הריח בדרך כלל לרוץ יחד בין העיניים) בעזרת שיניים (אידיאלי) או תחביב (למשל, דרמל) מקדחה או מלטש תכשיטן (עם מקדח שיניים חתיכות) תחת מיקרוסקופ לנתח (בתוך כלוב פאראדיי).<ol>
<li>בבריאם הימי, הסר את החלק של הגולגולת מיד מעל העיניים, עם מסור עגול, מהחלק הקדמי לעיניים רק לחלק האחורי אליהם. לאחר מכן, באמצעות מקדח, להסיר את העצם בין העיניים; עצבי הריח נמצאים בין העיניים.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר עצם מספיק נוקה, להסיר את רקמת השומן והחיבור מעל העצבים באמצעות ממחשוף פיין; לדאוג לא לפגוע בעצבים או לנקב כל כלי דם. הערה: הניסיון יסייע למקד את הפירוק; קטן יותר, ההכנה תהיה יציבה יותר. עם זאת, יש לנקות רקמה מספקת; עבור חסרי ניסיון, כאשר נורות חוש הריח הם פשוט גלויים, ברור קצת יותר קדמי לחשוף את החלק של העצבים כפי שהם מצטרפים הנורות כדי לאפשר את המיקום הנכון של האלקטרודות.</li>
	<li>נקה את האלקטרודות לפני השימוש על-ידי חיבורן לקוטב שלילי של מקור DC 3V (לדוגמה, שתי סוללות AA בסדרה) והצבת הקצה בתמיסת מלח פיזיולוגית (או מדוללת מי ים 1:3 במים מתוקים) עבור 20-30 שניות; זרם קבוע של בועות קטנות יש לראות מגיע מהקצה.</li>
	<li>לאחר חשיפה של עצבי הריח, הכנס את אלקטרודות ההקלטה (המוחזקות על מיקרו-מניפולטורים) בתנוחה המעניקה תגובה מקסימלית לתקן (לדוגמה,10-3 M L-serine) ותגובה מינימלית לריק. השתמש אלקטרודות טונגסטן מצופה פרילן(טבלת חומרים)מחובר לשלב הראש של preamplifier זרם מתחליפים (AC). הערה: ב seabream, התגובות החזקות ביותר חומצות אמינו נראים בדרך כלל עם אלקטרודות ממוקם בצד הצדדי של העצב, קרוב למקום שבו הוא מצטרף הנורה חוש הריח. זה עשוי להחזיק נכון עבור מינים אחרים, כמו הארגון ההנומרי של הנורה דומה באופן נרחב בקרב מינים. עם זאת, ניסיון הוא תמיד המורה הטוב ביותר.</li>
</ol>4. הקלטה אלקטרופיזיולוגית
הערה: כמו ברוב האלקטרופיזיולוגיה, הקלטה מרובת יחידות צריכה להתקיימה בתוך כלוב פאראדיי. עם זאת, הקלטה extracellular אינה דורשת בדרך כלל טבלה נגד רטט; רוב התנועה תגיע מהדגים. אף על פי כן, שולחן חזק ויציב נדרש עם משטח מתכת כדי לאבטח את הבסיסים המגנטיים של דוכני מיקרו מניפולטור.
<ol><li>הקימו מערכת אספקת תמריצים שתאפשר מעבר מהיר ממים נקיים ברקע למים המכילים גירויים, למשל, באמצעות שסתום שלישי המופעל באמצעות סולנואידים. חבר את השקע המשותף לצינור הנושא מים לרוזט הריח, והניח קו אחד במאגר מי ים והשני בתמיסת הבדיקה. הערה: כאשר השסתום מוחלף (על-ידי העברת זרם DC), זרימת המים עוברת ממים ברקע לזה המכיל את ריח ההריח. הגירוי צריך להינתן מספיק זמן כדי לראות שיא ברור בתגובה המשולבת, ואחריו תקופה של לינה; הזמן המשמש בפרוטוקול הנוכחי הוא 4 s, אך ייתכן שיהיה צורך בזמן ארוך יותר בהתאם למין.</li>
	<li>חבר את מנהל ההתקן של השסתום לגורם המפעיל של ממיר אנלוגי-דיגיטלי (לדוגמה, Digidata); כאשר השסתום מוחלף מרקע לקו המכיל גירוי, כך יתחיל הקלטת הנתונים. הגדר את התוכנה כך שתתחיל להקליט באירוע הגורם המפעיל והמשך לתקופה מוגדרת מראש (לדוגמה, 10 שניות). הערה: עשר שניות אמורות להספיק, אך ניתן לקצר או להאריך זאת, בהתאם לשאלה הניסיונית.</li>
	<li>בדוק את היציבות של ההכנה על ידי בדיקה (הקלטה ומדידת משרעת התגובה המשולבת) שוב ושוב עם תקן,10 -3 M L-serine במקרה זה, ומאפשר 1 דקות לעבור בין גירויים רצופים. הערה: בהתאם במידה מסוימת על מינים ריח, התגובות צריך משרעת בתוך 10% אחד את השני (ככלל אצבע), וצריך להיות התחלה מהירה, לעלות לפעילות מקסימלית, ולחזור לקו הבסיס לאחר הגירוי חסר(איור 4).</li>
	<li>להקליט את התגובות עצבי הריח חומצות אמינו בשליטה מי ים (מהנמוך ביותר לריכוז הגבוה ביותר) ולאפשר 1 דקות לעבור בין גירויים רצופים. הערה: ייתכן כי, עבור מינים מסוימים ו / או כמה ריחנים, יותר זמן הוא הכרחי. אבל עבור חומצות אמינו וsinobream, 1 דקות זה מספיק.</li>
	<li>ריהיה תיעוד התגובהל-10-3 M serine ולפתרון שליטה על מים ריקים.</li>
	<li>שנה את מי הרקע משליטה במי ים כדי מי ים CO2 גבוהים, על ידי הצבת קו הרקע לתוך הבקבוק עם מי ים CO2 גבוהים. הערה: מומלץ להכניס צינור המטוקריט אחר (או שווה ערך) לסוף הגירוי וקווי הרקע כדי להימנע מלגעת במים ולהבטיח שסוף הצינור יישאר במים.</li>
	<li>לפני בדיקת התגובה שלעצב הריח לחומצות אמינו במי ים CO2 גבוהים, תנאי האפיתל חוש הריח עם מים CO 2 גבוה על ידי ביצוע מי CO2 גבוה מעל אפיתל חוש הריח במשך כמה דקות. הערה: הניסיון הראה כי, עבור seabream, 5 דקות זה מספיק.</li>
	<li>להקליט את התגובות עצב הריח חומצות אמינו במי ים CO2 גבוה (מהנמוך ביותר לריכוז הגבוה ביותר).</li>
	<li>ריהיה זה שתגובה לפתרון מיםדו-קומתי 2 גבוה.</li>
	<li>ריהיה תיעוד התגובהל-10-3 M serine ולפתרון שליטה על מים ריקים. הערה: יש לסנן את אות הגלם (פעילות עצבית) (מעבר נמוך סביב 2,000-5,000 הרץ, מעבר גבוה 50-300 הרץ) ולעבור ממיר אנלוגי-דיגיטלי(טבלת חומרים). לכמת קל יותר של פעילות עצבית, ניתן לשלב את האות הגולמי גם באמצעות אינטגרטור דולף(טבלת חומרים)ולעבור לממיר האנלוגי-דיגיטלי, ומשם, אותות גולמיים ומשולבים למחשב שבו פועלת התוכנה המתאימה (לדוגמה, Axoscope).</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>להפחית את משרעת התגובה המשולבת ריק (ב mV) מן המשרעת של התגובות המשולבות לכל הגירויים.</li>
	<li>לנרמל את התגובות לגירויים על ידי חלוקת משרעת התגובה הקודמת לתקן (10-3 M serine); פעולה זו מפחיתה את השונות בין-ו-תוך-דגים.</li>
	<li>חשב את סף הזיהוי על-ידי רגרסיה ליניארית של עקומות תגובת הריכוז (על חלקה חצי לוגריתמית), על פי יומן הנוסחאות(N + 1.5) =יומן C + B, כאשר C הוא ריכוז הטוחנות, N הוא משרעת תגובה מנורמלת, ו- b הם קבועים 7,14. הערה: סף הזיהוי הוא הערך עבור x שבו y = 0.1761 (כלומר, יומן 1.5; N = 0); הריכוז שמעליו תראה תגובה (כלומר, הדג יכול להריח את זה). כמה ריחנים לעורר עקומות ריכוז-תגובה סיגמואידית כאשר התוויית חצי לוגריתמי (למשל,סידן 15,16; במקרה זה, הנתונים מנורמלים ניתן להיות מותאם ללווים היל שלושה פרמטרים אשר ייתן משרעת התגובה המרבית EC50 (כלומר, [odorant] זה נותן תגובה חצי מקסימלית; גם מידה של רגישות).</li>
	<li>השווה את סף הזיהוי ו/או את משרעת התגובה המרבית ואתה-EC 50 של גירויים שנבדקו במים בקרה ואלה שנבדקו במים CO2 גבוהים.</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

המחקר הנוכחי מתאר את השימוש בהקלטה רב-יחידה (חוץ-תאית) מעצב הריח של הים (S. aurata), ריד ימי בעל חשיבות רבה בתחומת המים. עם זאת, גישה ניסיונית זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על דגים אחרים; הניתוח והמיקום המדויק של אלקטרודות יהיו תלויים בבירור באנטומיה של מערכת הריח, והבחירה והריכוז של חומר הרדמה עשויים להיות תלויים במין הנוחקר. לדוגמה, עצב הריח של דג הזהב(Carassius auratus)קצר; במקרה זה, הקלטת EEG מנורת הריח יהיה קל יותר. הבחירה של ריחן עשוי גם תלוי, במידה מסוימת, על המין. המחקר הנוכחי השתמש בחומצות אמינו. ככל המחברים מודעים, כל מיני דגים נחקרו עד כה יש רגישות חוש הריח חומצות אמינו1,,18. רגישות זו הייתה מעורבת תהליכים מגוונים כגון מיקום מזון, תקשורת כימית והכרה של מיהלידה 19,,20,,21,,22,,23. עם זאת, הרגישויות של מינים שונים הן, באופן כללי, די דומות ולא תלויות באורח חיים או בבית גידול. הם גם מולקולות מוגדרות היטב והם זמינים בזול ובקלות. סיבות אלה הופכות אותם אידיאליים מבחן גירויים עבור מחקרים על olfaction בדגים, במיוחד אלה החוקרים את ההשפעות של הפרעות אנתרופוגנית (למשל, חומציות או זיהום), שבו ניתן להשוות בקלות את התוצאות על פנימינים 24.
בהתאם למין המדובר, ההכנות להקלטה מרובת יחידות יכולות להישאר יציבות למשך מספר שעות; משרעת התגובה לתקן הפנימי(10-3 M L-serine במחקר הנוכחי) לא צריכה להשתנות ביותר מ-10% בין בדיקות רצופות. כל סטייה משמעותית מכלל אצבע זה יכולה להיווות: (1) תנועה של הדג, ולכן עקירה של האלקטרודות ו/או צינור האף; (2) זיהום המים, למשל, על ידי יצירת קשר עם ידיו של הנסוי (במיוחד אם ריכוזים נמוכים יותר של ריח נתון נותנים תגובות גדולות יותר מאשר ריכוזים גבוהים יותר); או (3) הידרדרות בבריאות ההכנה). במקרה (i), יש לבדוק את הדגים על כך שעברו דירה; אם כן, למקם אותו מחדש, ולהוסיף הרדמה יותר למים ו / או לתת מנה נוספת של triethiodide גלמין. אפשר 5 דקות ובדוק שוב את הסטנדרט. אם התגובה עדיין קטנה יותר, למקם מחדש את האלקטרודות ו/או צינור האף עד שתירשם תגובה גדולה מספיק. במקרה (ii), פשוט ליצור מחדש סדרת דילול טרי של ריח, באמצעות כלי זכוכית נקיים ומים. במקרה (ג),יש לבדוק כי זרימת המים מעל הזימים של הדגים מספיקה, כי המים זורמים מעל הזימים (כלומר, יציאה דרך האופרקולה, ולא הפה), והמים הם aerated היטב. מינים שונים של דגים יש העדפות טמפרטורה שונות באופן נרחב; להבטיח כי הטמפרטורה במעבדה (ובקשר עם המים במגע עם הדג) קרובה ככל האפשר לטמפרטורה בה נשמרים הדגים. ודאו גם שהדגים אינם לחוצים, והימנעו מהעברתם (אפילו מטנק אחד למכל) לפחות שבוע לפני ההקלטה. רעש חשמלי הוא, כמובן, ההתלהמה של חייו של אלקטרופיזיולוג; עם זאת, המאמר הנוכחי אינו המדיום המתאים כדי לדון כיצד להתגבר / להפחית את זה. אף על פי כן, 'מדריך Axon' (זמין בחופשיות כקובץ PDF להורדה מאתר האינטרנט של היצרן) הוא מקור של ייעוץ מעשי על מזעור רעש. ברגע שתגובה גדולה ויציבה מתעוררת על ידי הגירוי הסטנדרטי, וסדרת ריכוז נותנת עלייה תלויה ריכוז במשרעת, עם תגובה מינימלית ריק, הקלטה תגובות לגירויים מבחן יכול להתחיל. חלק מהמחברים נותנים את אותו גירוי שלוש פעמים, ומחשבים את ממוצע החשבון לניתוח נתונים עוקב. עם זאת, אלה הם שכפולים טכניים, וגישה זו תגדיל את הזמן שהפעלה של הקלטה אורכת פי שלושה. המחברים הנוכחיים מעדיפים לבדוק פעם אחת ריח נתון, אבל תמיד חלק עקומת תגובת הריכוז. זה לא רק מאפשר את החישוב של סף הגילוי או EC50 (כמתואר), אלא גם מבטיח כי ריכוזים קרובים לאלה שהדגים יחוו בסביבה הטבעית שלו נבדקים (זה לא תמיד ידוע). יתר על כן, כל תגובות חריגות, בשל זיהום למשל, קל יותר לזהות; לאחר מכן ניתן לחזור על אלה באמצעות מדגם טרי במידת הצורך.
הקלטה מרובת יחידות מעצב הריח עשויה להיות פולשנית, אך היא רגישה יותר מה-EOG כאשר היא מוקלטת במיים 7, מכיוון שהיא אינה תלויה במלויתות חיצונית. לכן ניתן להשתמש בו כדי להעריך את רגישות חוש הריח לאודורנטים, כגון סידן ונתרן, שינויים בריכוזים אשר ישפיעו גם על מוליכות וכתוצאה מכך מתחיםשנרשמו 15. כהערכה של מספר ORNs להגיב ריח נתון (כלומר, פוטנציאל פעולה נסיעה לאורך אקסונים ORN מן האפיתל חוש הריח לנורה), הוא מייצג אות גלם, לא מעובד (עיבוד ראשוני של קלט ריח מתחיל בנורות). לכן, זהו פרמטר טוב יותר כדי להעריך את ההשפעות הישירות של מזהמים, כגון מתכות כבדות, ושינויים סביבתיים, כגון pH, על מערכת הריח מאשר EOG או EEG24,25. הקלטה מנורת הריח במי ים עם PCO2 גבוה (ולכן pH נמוך) עשוי להיות מושפע על ידי ההשפעות המרכזיות של pH על עיבוד עצבי; "גאבאקולטן התיאוריה" שלחומציות האוקיינוס 26, לפיה הפחתה pH מים גורמת הפצה מחדש של CL- ו HCO3- יון ב CSF וכתוצאה מכך שינוי של הפעלה GABAergic ממעכב (hyperpolarizing) כדי לעורר (depolarizing). יתר על כן, במחקרים כאלה, חשוב להעריך את ההשפעות של חומציות או מזהמים באמצעות ריכוזי ריח דומה לאלה הדגים עשוי להיתקל בסביבתו הטבעית. עבור חומצות אמינו, זה בננו לטווח micromolar27,,28,29; קרוב לסף הגילוי של תרכובות אלה בדגים1,,18. הערכת סף הגילוי עבור ריח נתון יכולה לתת מושג כלשהו על החשיבות ו/או התפקיד הביולוגי של רגישות הריח. לדוגמה, למפרי הים (Petromyzon marinus) יש רגישות גבוהה לרגישות חוש הריח לחומצות מרה ספציפיות ששוחררו על ידי זחלים עד לסף של 10-13 M30; רגישות זו מאפשרת למבוגרים לאתר ולזהות שטחי השרצה מתאימים, ולכן לפעול כפירומון נודד למרחקים ארוכים. באופן דומה, למפרי ים נקבה בשלה יש רגישות חוש הריח גבוהה זרעון (סף 10-14 M), פוליאמין שוחרר במילט על ידי זכרים, אשר לאחר מכן מושך אותם לקיני של זכרים זרע31. דגים אחרים יש גם רגישות חושהריח פוליאמינים 32,33,34,35, אבל לא עם סף נמוך מספיק של זיהוי כדי לתמוך בתפקיד פרומונים דומה; במקום זאת, מוצעת הימנעות מדגים רקובים. אף על פי כן, עם רגישויות חוש הריח גבוה כזה, ניתן לדמיין כי ירידה קלה ברגישות (כלומר, עלייה בסף), גם כאשר משרעת התגובה אינה מופחתת באופן דרמטי, עלול לגרום לבעיות חמורות עבורדגים 24.
כאשר התוויה חצי לוגריתמית, עקומות תגובת ריכוז לאודורנטים יכולות להיות אקספוננציאליות, ליניאריות או סיגמואידיות18. במקרה של חומצות אמינו, עקומות ריכוז-תגובה חצי לוגריתמיות כאלה הן ליניאריות (כלומר, לוגריתמי), סיגמואיד אופונקציות כוח 7. כי אין רוויה של התגובה נראה (כלומר, אין רמה בעקומות תגובת ריכוז, אפילו בריכוזים סופרה-סביבתיים) הוא כנראה בשל מספר קולטנים המחייבים חומצות אמינו בודדות, בהתאם לריכוז שלהם, ולא כל חומצת אמינו מחייב קולטן ספציפי; ככל שהריכוז של חומצת אמינו נתונה עולה, קולטנים יותר מסוגלים לקשור אותו ולכן להגיב. אף על פי כן, דגים יכולים להבחין ביןתערובותשל חומצותאמינו 36,37,38,39; זאת, ככל הנראה בשל דפוסי פעילות קומבנטוריים המעוררים בנורותהריח 12,40; האקסונים של כל ORNs המביעים את אותו חלבון קולטן לסיים באותו glomeruli בנורותחוש הריח 41,42,וחומצת אמינו אחת יכולה להפעיל יותר מglomerulus אחד.
עם זאת, ריחנים ספציפיים מאוד, כגון פרומונים, עשויים לעורר סיגמואיד או מעין סיגמואיד ריכוז-תגובהעקומות 43,44. ההסקנה, אם כי לא נבדק אמפירית, היא כי תגובות חוש הריח האלה הן בשל קולטנים ספציפיים מאוד אשר לאגד את מולקולת הפרומון ועוד מעט אחר. לכן, מעל ריכוז נתון, כל הקולטנים תפוסים, ועליות נוספות לא יעוררו תגובות נוספות ב-ORNs אחרים. לכן, ניתן לחשב נתונים אלה להתווה של שלושה פרמטרים של Hill, ותגובה מקסימלית, EC50 ו-Hill co-efficient,ניתן לחשב 15,45,46. זה יכול לתת מידע רב ערך, כגון זיקה לכאורה ומספר קולטן לכאורה, כי עקומות תגובת ריכוז ליניארי או מעריכי לא יכול לתת.

דגים מסתמכים במידה רבה על olfaction עבור היבטים רבים של חייהם כולל מציאת מזון, הימנעות טורפים, הערכת בניזוג פוטנציאליים הגירה, בין היתר 1,,2,,3. לכן, הערכת רגישות חוש הריח בדגים (מה הם מריחים? עד כמה הם רגישים לתרכובות אלה?) חיוני כדי להבין תהליכים אלה באופן מלא. יתר על כן, השפעות אנתרופוגנית על הסביבה, כגון חומציות האוקיינוס וזיהום, עשויות להיות השפעות עמוקות על מערכת הריח, אפילו ברמות sublethal, כי זה בהכרח במגע אינטימי עם המים שמסביב4. ב-vivo electrophysiology היא הגישה הניסיונית של בחירה להעריך את רגישות חוש הריח בדגים. שלוש טכניקות עיקריות זמינות: אלקטרו-olfactogram (EOG), אלקטרו-אנצפלוגרם (EEG) הוקלט מנורת הריח, והקלטה מרובת יחידות מעצבהריח 5.
EOG הוא הנפוץ ביותר של אלה שלושה6. זהו פוטנציאל שדה זרם ישיר (DC) נרשם מעל אפיתל חוש הריח והוא האמין להיות פוטנציאל גנרטור מסוכם של נוירונים קולטן ריח (ORNs) מגיב ריח נתון. עם זאת, כפי שהוא נרשם במים, ולא בתוך הדג, משרעת התגובה תלויה לא רק באות שנוצר על ידי הדגים, אלא גם ב מוליכות המים שמסביב; כך המשרעת תהיה נמוכה יותר בהו מוליכות (או ההתנגדות נמוכה יותר). משמעות הדבר היא כי EOG היא שיטה פחות רגישה במי ים מאשר מים מתוקים7.
EEG הוקלט מנורת הריח הוא גם בשימוש נרחב בחקירת הריח בדגים. עם זאת, הנורה חוש הריח הוא מרכז עיבוד סדר ראשון עבור קלט חוש הריח8; הוא מאורגן מאוד לתוך glomeruli, וכתוצאה מכך התגובה שהוקלטה תלויה במידה רבה במיקום של אלקטרודות ההקלטה. לדוגמה, הקלט מ- ORNs המזהה חומצות אמינו מעובד על ידי glomeruli באזור לחוץ של נורות חוש הריח, ואילו כי מכימיקלים נגזרים conspecific מופנה לאזור מדיאלי9,10,11,12. קלט פרומונים עשוי להיות מופנה glomeruli מקומי מאוד בתוך הנורה חוש הריח. בהתאם גם לאנטומיה של המין המדובר, מיקום ההקלטה האידיאלי עבור ריח נתון לא יכול להיות נגיש בקלות.
הקלטה מרובת יחידות מעצב הריח עוקפת את הבעיות העיקריות עם EOG ו- EEG המתואר לעיל. כפי שהוא מתעד פעולות פוטנציאל עובר את האקסונים של ORNs מהאפיתל לנורה, זה אות חושי ראשי. ומזמן שהיא מוקלטת בתוך הדג, משרעת התגובה אינה תלויה במליתיות חיצונית. אף על פי כן, כמובן שיש לו כמה חסרונות. ראשית, בהתאם לאנטומיה של המין, נדרש ניתוח נרחב יותר כדי לחשוף את עצב הריח מאשר עבור EOG. שנית, מכיוון שהאות קטן יותר מה-EOG, הוא דורש ציוד מעט יותר מתוחכם, ולכן יקר. תיאור כללי של גישות ניסיוניות אחרות ניתן על ידי ג'ון קפריו5. מטרת מאמר זה היא לפרט כיצד לתעד תגובות רב-יחידות חוץ-תאיות מעצב הריח של הים (Sparus aurata) ב vivo כדי חומצת אמינו odorants כדוגמה של טכניקה זו, ואיך לזהות, להתגבר, כמה מהבעיות הנפוצות יותר נתקל בניסוי כזה.

<table><tbody><tr><td>מגבר מקדים AC</td><td>Digitimer Ltd (וולווין גארדן סיטי, בריטניה)</td> <td>מגבר מקדים NL104</td><td>Neurolog שתוכנן במיוחד עבור סוג זה של הקלטה.</td></tr><tr><td>Digidata</td><td>Molecular Devices, LLC. (סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>ממיר אנלוגי-דיגיטלי</td> <td>1440A</td>.</tr><tr><td>EMG Integrator</td><td>Digitimer Ltd (וולווין גארדן סיטי, בריטניה)</td><td>NL703</td><td>Leaky 'אינטגרטור חשמלי לשילוב פעילות גולמית של העצב.</td></tr><tr><td>כלוב פאראדיי</td><td>מיוצר בבית</td><td></td><td>כדי להפחית רעש חשמלי.</td></tr><tr><td>Filter</td><td>Digitimer Ltd (וולווין גארדן סיטי, בריטניה)</td> מודול סינון <td>NL125/6</td><td>להקלטה אלקטרופיזיולוגית.</td></tr><tr><td>גלמין טריאתיודיד</td><td>סיגמא-אולדריץ' (פורטוגל)</td><td>G8134</td><td>חוסם עצבי-שרירי</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ' (פורטוגל)</td><td>G3126</td><td>חומצת אמינו המשמשת כריח</td></tr><tr><td>L-לאוצין</td><td>סיגמא-אולדריץ' (פורטוגל)</td><td>L80000</td><td>חומצת אמינו המשמשת כריח</td></tr><tr><td>L-סרין</td><td>סיגמא-אולדריץ' (פורטוגל)</td><td>S4500</td><td>חומצת אמינו המשמשת כריח מתכתי</td></tr><tr><td> לוחית בסיס</td><td>כל</td><td></td><td>מספק בסיס למיקרו-מניפולטורים.</td></tr><tr><td>צינורות מיקרו-המטוקריט</td><td>כל</td><td></td><td>כדי למקם אספקת מים לאפיתל הריח</td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטורים</td><td>Narishige International Ltd (לונדון, בריטניה)</td><td>M-152</td><td>אלקטרודות מיקום</td></tr><tr><td>MS222 (מלח אתיל-3-אמינובנזואט מתאן סולפונט)</td><td>סיגמא-אולדריץ' (פורטוגל)</td><td>E10505</td> בדיקת pH <td>הרדמה</td></tr><tr><td></td><td>מכשירי Hanna (P&oacute; voa de Varzim, פורטוגל)HI12302</td><td></td> <td>בדיקה למדידת pH של מים.</td></tr><tr><td>מכשירי רפרקטומטר</td><td>Hanna (P&oacute; voa de Varzim, פורטוגל)HI96822</td><td></td> <td>רפרקטומטר למדידת מליחות מים</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ' (פורטוגל)</td><td>746398</td><td>לתמיסת</td></tr><tr><td>מלח שסתומי סולנואיד</td><td>The Lee Co. (אסקס, קונטיקט, ארה"ב)LFAA1201618H</td><td></td> <td>למעבר בין מי רקע לתמיסות גירוי (כבר לא זמין)</td></tr><tr><td>סטריאו-מיקרוסקופ</td><td>Zeiss, Leica, Olympus</td><td>כל דגם מתאים.</td><td>לדיסקציה ומיקום אלקטרודות.</td></tr><tr><td>טיטרטור</td><td>האנה מכשירים (P&oacute; voa de Varzim, פורטוגל)HI84531</td><td></td> <td>טיטרטור למדידת בסיסיות, pH וטמפרטורה של מים.</td></tr><tr><td>מיקרו-אלקטרודות טונגסטן 0.1 M&Omega;</td><td>World Precision Instruments (היצ'ין, בריטניה)TM31A10</td><td></td> <td>אלקטרודות חוץ-תאיות.</td></tr><tr><td>נהג שסתומים</td><td>מיוצר במקור</td><td></td><td>12 V DC להפעלת שסתומי סולנואיד.</td></tr><tr><td>משאבת מים (טבולה)</td><td>כל</td><td></td><td>כדי לספק מים המכילים חומר הרדמה לזימים של הדגים.</td></tr></tbody></table>

הקלטה רב-יחידה חוץ-תאית מעצב הריח של טאוסט

Extracellular Multi-Unit Recording from the Olfactory Nerve of Teleosts

מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי חומציות האוקיינוס משפיעה על התנהגות מונעת חוש הריח בדגים. ייתכן שהיכן כי הבעיה נובעת בחלקה מירידה ברגישות הריח במים PCO2/pH נמוכים. כדי להעריך את ההשפעות של חומציות האוקיינוס, או רגישות חוש הריח בדגים ימיים באופן כללי, אנו מציעים כי הקלטה רב-יחידה חוץ תאית מעצב הריח היא שיטת הבחירה. למרות שהיא פולשנית, היא רגישה, חזקה, רחזורית ובלתי תלויה במליחותיות חיצונית (בניגוד לאלקטרו-אולפקטוגרם [EOG], למשל). יתר על כן, הוא מתעד קלט חושי ראשי לתוך CNS, לפני כל עיבוד מרכזי. אנו מראים כי שיטה זו יכולה להראות ירידה ברגישות ריח כי הוא גם זמני ותלוי ריח, באמצעות מגוון של חומצות אמינו כדי לבנות עקומות תגובת ריכוז ולחשב את סף הזיהוי.

תגובה אופיינית לשליטה החיובית(10-3 M L-serine; איור 4A) ופקד שלילי (ריק; איור 4ב') התיעוד מעצב הריח של ים מוצג באות 4. בנוכחות הגירוי (פס אופקי שחור; בחלל הריח, במגע עם האפיתל הריח), שים לב לעלייה המהירה בפעילות (המשתקפת בהסטה כלפי מעלה של האות המשולב) לשיא בתוך כשנייה אחת של תחילת הגירוי, ולאחר מכן תקופת לינה (בעוד הגירוי עדיין קיים), וחזרה לפעילות בסיסית לאחר סיום הגירוי. המשרעת המוחלטת של התגובה תלויה מאוד במיקום אלקטרודה; אם נרשמת תגובת משרעת נמוכה, נסה לשנות את תנוחות האלקטרודה. עלייה איטית יותר לפעילות שיא עשויה להיות בשל הצינור הנושא את המים המכילים גירוי לאפיתל חוש הריח הממוקם רחוק מדי מן האפיתל; נסה להזיז את צינור האף קרוב יותר (אך לא לגעת) האפיתל. שים לב כי, לעומת זאת, הריק מעורר תגובה מועטה או ללא תגובה. תגובה חיובית משמעותית (כלומר, עלייה בפעילות) לריק עשויה להצביע על זיהום המים המשמשים לדילול הגירויים; ביצוע דילול טרי עם מים נקיים (וכלי זכוכית) צריך לפתור את זה. אם לא, ייתכן שיהיה צורך בניקוי יסודי יותר של מערכת המים (כולל מסנני פחם מופעלים). תגובה שלילית (כלומר, ירידה בפעילות) עשויה להצביע על שינוי קל בקצב הזרימה בעת החלפת השסתום עקב חסימה בשסתום, לדוגמה.
עקומת תגובת ריכוז טיפוסית (מתווה חצי לוגריתמי), במקרה זה L-leucine (10-7 M עד 10-3 M),-7 מוצגת באות 5A. שים לב כי הגדלת ריכוזי האודורנט לעורר עליות גדולות יותר ויותר בפעילות, ולכן, במשרעת של התגובות המשולבות. עלילה של הנתונים המנורמלים, והרגרסיה ליניארית המתאימה שלהם, מוצגת באיון 5ב'. ניתן לחשב את סף הזיהוי המשוער מהערך של x כאשר y = 0.1761 (כלומר, log1.5; איפה N = 0). במקרה זה, ערך זה הוא -7.48; כל כך, הסף המחושב עבור L-leucine בדג זה הוא 10-7.48 M. ניתן להעריך באופן דומה את המעריך α מתוך רגרסיה ליניארית של הנתונים מנורמלים על מגרש יומן רישום; יומןN = αlog [odorant] + קבוע. הגורם אז נותן את העלייה בריכוז ריח נדרש כדי להגדיל את משרעת התגובה על ידי יחידת יומן אחת; כל כך, זוהי הערכה של התלולות של עקומת תגובת הריכוז17. בדוגמה זו, α = 0.277 ו- ơ = 3.61; לכן, כדי להגדיל את משרעת התגובה פי עשרה (כלומר, יחידת יומן אחת; log10 = 1), ריכוז הגירוי צריך להיות מוגבר על ידי 103.61-fold (פי 4,074).
עקומת ריכוז-תגובה סיגמואידית טיפוסית (איור 6א')כאשר התווייתו חצי לוגריתמית, במקרה זה ל-L-גלוטמין, מוצגת באות 6ב'. עלייה דומה תלוי ריכוז משרעת תגובה נראה; עם זאת, בריכוזים גבוהים יותר, עלייה זו הופכת פחות כך משרעת התגובה מגיע המקסימום (Nמקסימום). הדבר מאפשר את התאם הנתונים למשוואה של שלושה פרמטרים של Hill: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60962/60962eq1.jpg">
בדרך זו, EC50 (ריכוז ריח שבו 50% תגובה מקסימלית הוא עורר) ואת הגבעה שיתוף יעיל (מדד של התלוליות של המדרון של החלק ליניארי של עקומת סיגמואיד) ניתן לחשב.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig1.jpg"> איור 1: צילום מסך של תוכנה המציג את חלון הקלט מהתוכנית CO2Calc. מסומנים (תיבות אדומות) הם השדות הדרושים לחישוב פרמטר פחמתי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig2.jpg"> איור 2: צילום מסך של תוכנה המציג את חלון הקלט עבור הקבועים, היחידות וקנה המידות המתאימים. הערכים המוצגים מומלצים לתנאים שבהם בוצעו הניסויים המתוארים; הם עשויים להשתנות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig3.jpg"> איור 3: צילום מסך של תוכנה המציג את חלון התוצאות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig4.jpg"> איור 4: תגובות מרובות יחידות אופייניות שהוקלטו באופן חוץ-תאי מעצב הריח של seabream ב vivo בתגובה10-3 M L-serine (A) ריקה (B). עקבות עליון להראות את התגובות המשולבות ועקבות נמוכים להראות את האות גלם (עצב). גירויים הוחלו על אפיתל חוש הריח (פסים אופקיים). שימו לב לעלייה המהירה בפעילות במהלך החשיפה של 1 ס', שיא בפעילות, ולאחריה תקופת לינה (בעוד האודורנט עדיין נמסר לאפיתל) וחזרה לרמות הבסיס לאחר הפסקת אספקת האודורנט. עלייה קטנה או לא בפעילות נראית בעקבות גירוי עם מים שטופלו באותו אופן כמו דילול ריח, למעט הוספת כל ריח (ריק). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig5.jpg"> איור 5: עקומת תגובת ריכוז טיפוסית עבור L-leucine נרשם באופן extracellular מעצב הריח ב vivo. (א)כמו הריכוז של L-leucine מוחל על אפיתל חוש הריח (פסים אופקיים) גדל מ 10-7 M כדי 10-3 M, עלייה במקביל בפעילות נראית בעצב. עקבות עליון להראות את התגובות המשולבות ועקבות נמוכים להראות את האות גלם (עצב). (ב)רגרסיה ליניארית (R2 = 0.97) של נתונים מנורמלים התוווו באופן חצי לוגריתמי כדי לחשב את סף הזיהוי כערך עבור יומן רישום[L-leucine] כאשר יומן(N + 1.5) = 0.1761 (כלומר, כאשר N = 0). בדוגמה זו, ערך זה הוא -7.48; הסף המשוער של זיהוי L-leucine בדג זה הוא ולכן 10-7.48 M. אנא לחץ כאן <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig5large.jpg" target="_blank">כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig6.jpg"> איור 6: עקומת ריכוז-תגובה אופיינית עבור L-גלוטמין נרשם באופן חוץ-תאי מעצב הריח ב vivo. (א)כמו הריכוז של L-גלוטמין מוחל על אפיתל חוש הריח (פסים אופקיים) גדל מ 10-7 M כדי 10-3 M, עלייה במקביל בפעילות נראית בעצב. עקבות עליון להראות את התגובות המשולבות ועקבות נמוכים להראות את האות גלם (עצב). (ב)התוויה חצי לוגריתמית של נתונים מנורמלים המותאם למשוואת היל בעלת שלושה פרמטרים (R2 = 0.99). בדוגמה זו, ECמחושב 50 = 3.11 μM, ואת היל שיתוף יעיל = 0.565). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig6large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

הקלטה רב-יחידה חוץ-תאית מעצב הריח היא שיטה רגישה, איתנה ותו לאופתית להערכת רגישות חוש הריח בדגים ימיים. הוא מתעד קלט חושי ראשי והוא אינו תלוי במליתיות חיצונית.

Recent studies have shown that ocean acidification affects olfactory-driven behavior in fish. This may be due in part to a reduction in olfactory ...

זוהי השיטה החזקה והרגישה ביותר להערכת רגישות חוש הריח בדגים ימיים כפי שהוא מתעד אות חושי גרידא לפני כל עיבוד על ידי מערכת העצבים המרכזית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הרגישות שלה, כי זה יכול להיות מועבר בקלות למין אחר מסביבה אחרת עצמאית של מליחות חיצונית. כדי להכין את מי הבקרה, לאסוף ליטר אחד של מי ים מסוננים פחם ולהשתמש בדיקה pH כדי לבדוק את ה- pH.ה- pH צריך להיות בסביבות 8.2. אם לא, בועה מי הים עם אוויר אטמוספרי עד pH של 8.2 הוא הגיע. לאחר מכן, השתמש titrator אלקליניות כדי למדוד את האלקליניות של המים, ולאחר מכן למדוד את טמפרטורת המים ואת המליחות.כדי להכין מים דו תחמוצת הפחמן גבוה, לסנן ליטר אחד של מי ים באמצעות מסנני פחם פעיל חלקיקים לפני מבעבע עם פחמן דו חמצני עד pH הרצוי הוא הגיע. השתמש בדיקה pH כדי לבדוק את ה- pH, אשר צריך להיות סביב 7.7, ולאחר מכן להשתמש titrator אלקליניות כדי למדוד את האלקליניות של המים ולמדוד את טמפרטורת המים ואת המליחות. כדי לקבוע את לחץ הפחמן הדו-חמצני הן בשליטה והן במים דו-חמצניים גבוהים, פתח תוכנה שנועדה לחשב פרמטרים של פחמן דו-חמצני במים ולהוסיף את מליחות המים, הטמפרטורה, הלחץ, האלקליות הכוללת וערכי ה- pH לחלון הקלט.לאחר מכן בחרו את הקבועים, המאזניים והיחידות ולחצו על התהליך כדי לקבוע את לחץ הפחמן הדו-חמצני. לאחר אישור רמה מתאימה של הרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטת הזנב, מניחים את הדגים שעברו הרדמה על כרית תמיכה המותאמת אישית לדגם ומנחים צינור סיליקון בגודל מתאים לתוך פי הדג. הצינור מחובר למשאבה תת-קרקעית ומאגר של חומר הרדמה המכיל מי ים ומים נשאבים מעל הזימים בקצב של כ-100 מיליליטר לדקה לקילוגרם.לאחר מכן, הכנס סיכת אדמה לתוך שריר האגף וחבר את הסיכה לשלב הראש של המגבר. מכסים את הדגים בבד לח כשיחוק הראש חשוף וממקמים את הצינור עם מערכת העברת הגירויים בתוך הנחיריים. כדי לחשוף את עצבי הריח, השתמש במקדחה ובמיקרוסקופ לנתח כדי להסיר את העור והעצם של הגולגולת בין העיניים.בעת שימוש בדם ים, השתמש במסור עגול כדי להסיר את החלק של הגולגולת מיד מעל העיניים רק האחורי לעיניים ולהשתמש במקדחה כדי להסיר את העצם בין העיניים. לאחר שמספיק עצם נוקתה, השתמש במטסים עדין כדי להסיר את השומן ואת רקמת החיבור overlying את עצבי הריח מבלי לפגוע בעצבים או בכלי הדם. נקה את האלקטרודות לפני השימוש על ידי חיבורן לקוטב השלילי של מקור DC של שלושה וולט והצבת הקצה בתמיסת מלח פיזיולוגית למשך 20 עד 30 שניות.זרם קבוע של בועות קטנות צריך להיראות מגיע מהטיפ. חבר אלקטרודות טונגסטן מצופות פרילן לשלב הראש של קדם-אמפליפייר זרם AC לסירוגין. לאחר שנחשפו עצבי הריח, השתמש במיקרו-מניפולטורים כדי להכניס את האלקטרודות לעצב הריח המתאים במצב שנותן תגובה מקסימלית לסטנדרט ותגובה מינימלית לריק.אם הניתוח עבר בצורה חלקה, הצעד הקריטי הוא להפוך את האלקטרודות למיקום הנכון. פעולה זו יכולה להימשך זמן רב וכוללת מידה מסוימת של ניסוי וטעייה. כדי להשיג קריאות אלקטרופיזיולוגיות, השתמשו בשסתום תלת-כיווני המופעל סולנואיד כדי להקים מערכת אספקת גירויים כדי לאפשר מעבר מהיר ממי רקע נקיים לגירוי המכיל מים ולחבר את השקע המשותף לצינור הנושא מים לרוזט הריח.מניחים קו אחד במי ים ברקע והשני בתסתר הבדיקה. חבר את מנהל ההתקן של השסתום לגורם המפעיל של ממיר דיגיטלי אנלוגי וקבע את תצורת התוכנה כך שתתחיל להקליט באירוע ההדק ולהמשיך לתקופה קבועה מראש. כדי לבדוק את יציבות ההכנה, להקליט שוב ושוב ולמדוד את משרעת התגובה המשולבת שוב ושוב עם התקן המאפשר דקה אחת לפסום בין גירויים רצופים.לאחר מכן, להקליט את תגובות עצב הריח חומצות אמינו במי ים שליטה, ולאפשר דקה אחת לרווח בין גירויים רצופים, ולאחר מכן להקליט את התגובה פעם אחת 10 סרין טוחן שלישי שלילי בתמצית ריקה מים בקרה. ואז לתעד את התגובות עצב הריח לחומצות אמינו במי ים פחמן דו חמצני גבוה. התגובה לתופת ריקה גבוהה של פחמן דו חמצני ותגובה של פעם 10 לסרין השלישית השלילית בתסתר ריק מים.כאן מוצגות תגובות אופייניות לגירויי שליטה חיוביים ושליליים המתועדים מעצב הריח של בריאת ים. בתוך כשנייה אחת של יישום גירוי, עלייה מהירה בפעילות ניתן לראות ואחריו תקופה של לינה בעוד הגירוי עדיין נוכח וחזרה לפעילות בסיסית לאחר סיום הגירוי. לעומת זאת, גירוי ריק מעורר תגובה מועטה או ללא תגובה.בעקומת תגובת ריכוז טיפוסית זו, ניתן לראות כי הגדלת ריכוזים של ריח יכולה לעורר עליות גדולות יותר ויותר בפעילות ולכן משרעת של התגובות המשולבות. התוויית הנתונים המנורמלים וההתמדה הליניארית מאפשרת להעריך את סף הגילוי לתגובות הריכוז של כל בעל חיים או קבוצת בעלי חיים. עקומות תגובת ריכוז סיגמואידאלי ניתן להתוות חצי לוגריתמי, המאפשר חישוב של ריכוז ריח המעורר תגובה מקסימלית 50%.חשוב לשמור על הדגים בריאים ככל האפשר. לדוגמה, ודא כי הזימים מושקיים כראוי, כי אפיתל הריח נשמר רטוב במהלך ההקלטה. אחת המטרות שלנו היא להתחקות אחר המסלולים העצביים במוח למקום שבו מועבר המידע החושי.

extracellular-multi-unit-recording-from-olfactory-nerve

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

מערך Multielectrode (MEA) הקלטות לספק שיטה ללימוד את הפעילות החשמלית של אוכלוסיות גדולות של נוירונים. כאן, אנו מציגים את הפרטים של הכנה MEA להקליט האפיתל עכבר vomeronasal ובמקביל מגרה את הרקמות.

מערך Multielectrode הקלטות של האפיתל Vomeronasal

ההקלטה (EOG) electroolfactogram היא דרך אינפורמטיבי, קל לנהל, אמין להערכת תפקוד הריח ברמה של אפיתל הריח. פרוטוקול זה מתאר הגדרת הקלטה, רקמות העכבר הכנה, איסוף נתונים, ניתוח נתונים בסיסיים.

ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

נוירונים קולטניים ריח (ORNs) להמיר אותות ריח ראשון לתוך קולט נוכחיים מעורר בתור פוטנציאל פעולה שמועברים לנוירונים מסדר השנייה בנורת חוש הריח. כאן אנו מתארים את טכניקת יניקת פיפטה כדי להקליט את הקולטן odorant מושרה פוטנציאלי פעולה הנוכחי ומORNs העכבר בו זמנית.

תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

תחבורה מדרדר של צבע פלואורסצנטי מתייגת תת אוכלוסייה של תאי עצב המבוססים על הקרנת אנטומי. אקסונים שכותרתו יכול להיות ממוקדים מבחינה...

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

סרטון זה מדגים הקלטה אלקטרופיזיולוגית של נוירונים חושי ריח (OSNs) בעכברים באמצעות טכניקת מהדק טלאי מחורר. אפיתל הריח, המכיל OSN עם קולטני ריח מתויגים פלואורופור, מבודד מעכבר ומאובטח בתא הקלטה. פיפטת הקלטה מהודקת לידית הדנדריטית של OSN, וניסטטין בתוך הפיפטה מנקב את הממברנה כדי ליצור קישוריות חשמלית עם התא. לבסוף, פיפטה נוספת משמשת להעברת ממריץ ריח, והפעילות האלקטרופיזיולוגית של התא המתוקן נרשמת.

רישום טלאי מהדק מחורר של נוירונים חושי ריח בעכברים

אנחנו מדגימים וריאציות של טכניקה רבת יחידת ההקלטה התאית לאפיין תגובות ריח מעורר בשלושת השלבים הראשונים של מסלול ההרחה חסר חוליות. טכניקות אלה יכולים בקלות להיות מותאמות לבחינת פעילות הרכב במערכות עצביות אחרות גם כן.

שיטות הקלטה בעל מספר יחידות לאפיין את הפעילות עצבית בארבה (<em&gt; Schistocerca אמריקנה</em&gt;) מעגלי ריח

הקלטות ארוכות טווח תאיים בו זמנית משני neuropiles המוח שונה או שני קטעים אנטומיים שונים הוקמו בדבורי דבש. הקלטות אלה מאפשרות החקירה של היבטים זמניים של עיבוד עצבי על פני אזורים שונים במוח בנוירון הבודד, כמו גם ברמת ההרכב בבעלי חיים מתנהגים.

הקלטות ארוכות טווח בו זמנית בשני שלבים עצביים עיבוד במתנהגים דבורי דבש

אנו מתארים פרוטוקול לתיוג in vivo של נוירונים חושי ריח על ידי אלקטרופורציה ולאחר מכן סריקת לייזר קונפוקלית או מיקרוסקופ רב-פוטוני כדי להמחיש את המורפולוגיה העצבית והתפתחותה לאורך זמן.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה In vivo

ניתוח התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים חושי ריח עדיין מתמודד עם מגבלות טכניות. כאן אנו מתעדים אותם באמצעות מהדק טלאי מחורר בהכנה שלמה של אפיתל הריח בעכברים ממוקדי גנים. טכניקה זו מאפשרת לאפיין את תכונות הממברנה ותגובות לליגנדים ספציפיים של נוירונים המבטאים קולטני ריח מוגדרים.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

כאן אנו מתארים פרוטוקול למדידה וניתוח של תגובות טמפרטורה בפקעת הריח של Xenopus laevis. נוירונים של קולטני ריח ותאים מיטרליים מוכתמים באופן דיפרנציאלי, ולאחר מכן נרשמים שינויים בסידן, המשקפים רגישות של כמה רשתות עצביות בנורה לירידות טמפרטורה הנגרמות באף.

הקלטת פעילות עצבית הנגרמת טמפרטורה באמצעות ניטור שינויי סידן נורה חוש הריח של<em&gt; Laevis Xenopus</em

ראשנים של צפרדע רפואית להציע פלטפורמה ייחודית לחקור את תפקוד מערכת העצבים ויוו. אנו מתארים מתודולוגיות להערכה של עיבוד מידע חוש הריח חי צפרדע רפואית הזחלים בתנאים נורמליים לגידול או לאחר פגיעה.

הערכה תפקודית של חוש הריח מסלולים ב ראשנים של צפרדע רפואית חי

חקור רישום רב-יחידה חוץ-תאית מעצב הריח של טאוסט לבחינת רגישות חוש הריח בדגים ימיים. שיטה זו מודדת קלט חושי טהור לפני עיבוד במערכת העצבים המרכזית ומתאימה למינים שונים.

הקלטה רב-יחידה חוץ-תאית מעצב הריח של טאוסט

גלה סרטונים נוספים