Name: מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: למדו שיטת אבלציה בלייזר 405 ננומטר במיקרוסקופ קונפוקל לחקר התחדשות תאי Interneuromast בזברה Danio rerio. הפרוטוקול מאפשר מעקב מדויק אחר תהליכי התחדשות תאי קולטנים ותובנות לטיפולים בבעיות שמיעה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי NIH R15 מענק 1R15DC015352-01A1 ופייס אוניברסיטת מקורות מימון פנימיים. קווי הדגים היו באדיבות ולדימירקורז' 14, קייטיקנדט 15,16,והמעבדה של א. ג'יימס האדספט. ברצוננו להודות לא. ג'יימס האדספת' וחברי קבוצתו על המשוב על ניסויים אלה, ועמיתים באוניברסיטת פייס על תמיכתם. ניתוח רגרסיה לוגיסטית ב-RStudio נעזר במיוחד על ידי עמיתנו מתיו איילו-למנס.

<ol><li>Denans, N., Baek, S., Piotrowski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+Sensory+Organs+to+Define+the+Path+for+Hair+Cell+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparing Sensory Organs to Define the Path for Hair Cell Regeneration.</a> Annual Review Cell & Developmental Biology. 35, 567-589 (2019).</li>
<li>Ghysen, A., Dambly-Chaudiere, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lateral+line+microcosmos%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The lateral line microcosmos.</a> Genes & Development. 21 (17), 2118-2130 (2007).</li>
<li>Lush, M. E., Piotrowski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+hair+cell+regeneration+in+the+zebrafish+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Sensory hair cell regeneration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Dyn. 243 (10), 1187-1202 (2014).</li>
<li>Ledent, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+development+of+the+posterior+lateral+line+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Postembryonic development of the posterior lateral line in zebrafish.</a> Development. 129 (3), 597-604 (2002).</li>
<li>Nunez, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+development+of+the+posterior+lateral+line+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+and+Development%22%5BJournal%5D)">Postembryonic development of the posterior lateral line in the zebrafish.</a> Evolution and Development. 11 (4), 391-404 (2009).</li>
<li>Grant, K. A., Raible, D. W., Piotrowski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+latent+sensory+hair+cell+precursors+by+glia+in+the+zebrafish+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of latent sensory hair cell precursors by glia in the zebrafish lateral line.</a> Neuron. 45 (1), 69-80 (2005).</li>
<li>Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supernumerary+neuromasts+in+the+posterior+lateral+line+of+zebrafish+lacking+peripheral+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Supernumerary neuromasts in the posterior lateral line of zebrafish lacking peripheral glia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 102 (5), 1496-1501 (2005).</li>
<li>Lush, M. E., Piotrowski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB+expressing+Schwann+cells+control+lateral+line+progenitor+cells+via+non-cell-autonomous+regulation+of+Wnt%2Fbeta-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">ErbB expressing Schwann cells control lateral line progenitor cells via non-cell-autonomous regulation of Wnt/beta-catenin.</a> eLife. 3, 01832(2014).</li>
<li>Hernandez, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublethal+concentrations+of+waterborne+copper+induce+cellular+stress+and+cell+death+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Sublethal concentrations of waterborne copper induce cellular stress and cell death in zebrafish embryos and larvae.</a> Biological Research. 44 (1), 7-15 (2011).</li>
<li>Moya-Diaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroablation%3A+a+method+for+neurectomy+and+localized+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroablation: a method for neurectomy and localized tissue injury.</a> BMC Developmental Biology. 14, 7(2014).</li>
<li>Sanchez, M., Ceci, M. L., Gutierrez, D., Anguita-Salinas, C., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensory+organ+regeneration+in+zebrafish+depends+on+a+population+of+multipotent+progenitor+cells+kept+latent+by+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanosensory organ regeneration in zebrafish depends on a population of multipotent progenitor cells kept latent by Schwann cells.</a> BMC Biology. 14, 27(2016).</li>
<li>Viader-Llargues, O., Lupperger, V., Pola-Morell, L., Marr, C., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell-lineage+tracing+and+machine+learning+reveal+patterns+of+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Live cell-lineage tracing and machine learning reveal patterns of organ regeneration.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+Cell+Stress+and+Death+Using+Conventional+UV+Laser+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54983(2017).</li>
<li>Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+to+identify+developmentally+regulated+zebrafish+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo.</a> Developmental Dynamics. 231 (2), 449-459 (2004).</li>
<li>Kindt, K. S., Finch, G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinocilia+mediate+mechanosensitivity+in+developing+zebrafish+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinocilia mediate mechanosensitivity in developing zebrafish hair cells.</a> Developmental Cell. 23 (2), 329-341 (2012).</li>
<li>Toro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+Modulates+the+Activity+of+Sensory+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Dopamine Modulates the Activity of Sensory Hair Cells.</a> Journal of Neurosciences. 35 (50), 16494-16503 (2015).</li>
<li>Dalle Nogare, D., Chitnis, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+understanding+morphogenesis+and+migration+of+the+zebrafish+posterior+Lateral+Line+primordium%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">A framework for understanding morphogenesis and migration of the zebrafish posterior Lateral Line primordium.</a> Mechanisms of Development. 148, 69-78 (2017).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול מתאר שיטה רב-תכליתית לאבלציה של תאי לייזר שניתן לבצע על כל מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזר אולטרה סגול כמעט (אורך גל של 405 00 00 00 00 00 00 00 00:00). פרוטוקול זה מטפל במגבלות של שיטות שהועסקו בעבר כגון אלקטרובלציה (אשר גורמת נזק נרחב יותר11)ופעמו אבלציה UV-לייזר (אשר דורש ציוד מיוחד נוסף12). הדמיה קונפוקלית לפני ולאחר אבלציה מספקת משוב מהיר בנוגע להצלחת הניסוי. מיקרוסקופית זמן לאחר מכן מציעה אחסון פשוט להתחדשות בסוג תא קריטי לפיתוח מערכת חושית.
יש חשיבות חיונית למסך מראש עבור דגי זברה טרנסגניים המביעים GFP בחוזקה בנוירומאסט ו- INMCs. זחלים עם פלואורסצנה בהירה ואפילו מרווח של neuromasts נגזר primI הם מועמדים אידיאליים לאבלציה לייזר. אפילו בדגים אלה, מדי פעם יש INMCs עמעום שעשויים בתחילה לברוח זיהוי. תאים אלה יכולים להישאר מאחור לאחר אבלציה לייזר, מניעת היווצרות של פער אמיתי בין INMCs. הרווח הדיגיטלי צריך להיות מותאם כדי לחשוף תאים עמעום אלה במהלך הדמיית טרום אבלציה כך שהם יכולים גם להיות ממוקד עם לייזר 405 nm (שלב 8.2).
באופן דומה, מיקוד לייזר לפעמים לא לגמרי להרוס תא; במקום זאת, זה יהיה להלבין את הפלואורסץ, וכתוצאה מכך כישלון ליצור פער אמיתי. תאים אלה בדרך כלל להגדיל פלואורסצנית במהלך מיקרוסקופית timelapse. קבל התאמה בשלב ההדמיה שלאחר אבלציה יחד עם הדמיית T-PMT (איור 2) מסייעים להבטיח שכל התאים המיועדים הוסרו ביעילות. לעתים קרובות נדרשים שניים או שלושה אבלות תאים בודדות כדי להפיק רווח במחרוזת INMC. מוות של תאים יכול להתגלות על ידי blebbing או מראה פרטניים בתאים המיועדים; למרות, זה עשוי לדרוש תקופת המתנה קצרה לאחר מיקוד לייזר (ובמקרים מסוימים, דמויות אפופטוטיות או נמק לכאורה נצפו זמן קצר לאחר מכן).
מגבלה של הליך זה היא שזה עשוי לדרוש ניסויים ניסיוניים מרובים לפני תנאי לייזר ממוטבים והתחדשות INMC הוא מוצלח. כוח הלייזר וזמן ההתעכבות הכולל של הלייזר עשויים לדרוש התאמה קלה עבור דגימות שונות. נמצא כי יישום לייזר מוגזם יכול לפגוע ביכולת של הקו לדרכך כדי לתקן את עצמו. זה כולל גם 1) חשיפת יתר של תאים בודדים להקרן לייזר, ככל הנראה גרימת נזק נוסף לרקמות שמסביב, כמו גם 2) אבלציה של תאים רבים מדי במחרוזת, המוביל לפער גדול יותר. על המשתמשים להשיג איזון בין תאים מ מקרינים מספיק כדי להבטיח את השמדתם ולא להגזים יתר על על כן בתאים, דבר שיכול להאט או למנוע התחדשות. עם ההגדרות המתאימות, נמצא כי INMCs ניתן להסיר ללא נזק גלוי לעצב הקו האחורי לצדדית, המציין כי נזק משני ממוזער עם פרוטוקול זה בניגוד electroablation11. בשום מקרים לא היו neuromasts חדשים יוצרים בפער שנצפה, ככל הנראה בגלל עצב הקו לחוץ נשאר שלם ותאי גליה הבסיסיים להישאר לעכב את ההתפשטות של INMCs6,7,8,11.
הוכח כי שיטה זו של אבלציה לייזר confocal עשוי להיות מיושם על סוגי תאים אחרים, כמו גם, במיוחד אלה הממוקמים באופן שטחי בתוך החיה כולל תאי שיער חושיים(איור 4). פרוטוקול דומה עשוי לשמש כדי לבלבל תאי עור כדי לבחון תיקון הפצע או נוירונים עבור מחקרי התחדשות סקסוניים, כפי שתואר קודםלכן 13. הוא צפוי כי טכניקה זו תהפוך תוספת שימושית רפרטואר ניסיוני של מעבדות בעלי מיקרוסקופ confocal אבל אין ציוד מיוחד אחר עבור אבלציה לייזר.

בליבה של ליקוי שמיעה מתקדם ביותר טמון ההרס של תאי שיער חושיים, אשר מתמרים גירויים שמיעתיים חיצוניים לתוך דחפים עצביים לגילוי על ידי המוח. מוות תאי שיער שבלולי גורם לליקוי שמיעה קבוע, כמו יונקים בוגרים חסר את היכולת לחדש תאים אלה בעקבות נזק. לעומת זאת, בעלי חוליות שאינם יונקים כגון דגי זברה יכולים לחדש תאי שיער שאבדו לטראומה אקוסטית או לעלבון אוטוקסי. הקו המכנוזנסי של דגי הזברה הוא מערכת איברים פשוטה וקלות שניתן להשתמש בה כדי ללמוד התחדשות תאישיער 1,2,3.
הקו לחוץ מורכב מטלאים חושיים קטנים הנקראים neuromasts, המחוברים במהלך הפיתוח על ידי מחרוזת של תאים מוארך המכונה תאים interneuromast (INMCs). בהתחשב ביכולת ההתפשטות שלהם כתאי גזע לכאורה המהוים איברים המכילים תאי שיער חדשים, ההתנהגות של INMCs היא עניין רבלקהילה 4,5. חלק גדול מהמחקר הנוגע ל-INMCs איפיין דיכוי של התפשטותם על ידי תאי שוון סמוכים העוטפים את עצב הקו לרוחב, ככל הנראה באמצעות מעכב של איתות Wnt/β-catenin. שש,שבע,שמונה. בעוד הרגולציה של התפשטות INMC והבידול לתוך neuromasts חדש תואר היטב, המנגנונים השולטים INMC לגדול מחדש לאחר אבלציה לא הובך. פרוטוקול זה משמש כאמצעי לבלילת INMCs בודדים וניתוח התנהגות ההתחדשות שלהם לאחר מכן.
מגוון שיטות להשמדת תאי שיער, תאים תומכים, ו neuromasts שלם פורסמו, יחד עם מתודולוגיות לניטור התאוששות. אבלציה כימית עובד היטב עבור תאי שיער, אבל מינונים של כימיקלים רעילים כגון CuSO4 חייב להיות מוגבר באופן משמעותי כדי להסיר סוגים אחרים של תאי קולחוץ 9. בעוד אלקטרובלציה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא אמצעי יעיל ופשוט להשמדת INMCs כדי ללמוד התחדשות, קשה למקד באופן צר, ולכן, עשוי לייצר נזק משני משמעותי. כתוצאה מכך, הדבר יכול להסוות היבטים של התנהגויות ספציפיות ל- INMC10,11. פרוטוקולי אבלציה לייזר הועסקו, אבל הם דורשים את השימוש בציוד מיוחד לא בהכרח קיים במעבדה הממוצעת או במתקן הדמיה (כלומר, לייזרים UV פעמורבי עוצמה 12). השיטה המתוארת כאן יכולה להתבצע עם כל מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר לבוש עם לייזר נפוץ 405 nm, משמש בדרך כלל עבור DAPI הדמיה ופלואורופורים כחולים אחרים. יתרון של שיטה זו הוא כי הדמיה confocal יכול להתבצע מיד לפני ואחרי נזק לתא מבלי לעסוק בכל מערכות בקרת לייזר נוספות או העברה למיקרוסקופ אחר מצויד לייזר פעמו.
שיטה דומה תוארה עבור נוירונים מבלבלים בחוט השדרה של דגי הזברה13. עם זאת, השיטה הקודמת דורשת מודול FRAP עבור אבלציה של תאים, שאינה דרישה עבור פרוטוקול זה. יתר על כן, בהתחשב במאפיינים הייחודיים של סוגי תאים שונים (כלומר, בהירות של פלואורסקנציה טרנסג'נדרית, עומק בתוך הגוף, וצורת התא), סביר להניח כי יהיה צורך בשינויים משמעותיים בהתאם לסוג התא המשמש. הפרוטוקול המפורט כאן סביר יותר להיות יעיל עבור תאים שטחיים יותר, כפי נתמך על ידי הדגמה של אבלציה תא שיער חושי באותה שיטה. כמו כן מתואר הוא התחדשות תוואי כדי להעריך את שיעורי ההתאוששות INMC לאחר אבלציה, אשר לא היה תכונה של המחקר הנ"ל.
פרוטוקול אבלציה תא מבוסס לייזר מפורט בכאן לוכד את היכולת ההתחדשות של INMCs באמצעות אופטימיזציה של תנאי לייזר, הדמיה לפני ולאחר אבלציה, ומיקרוסקופית זמן לשגות. אלמנטים אלה מתאחדים כדי להציג באופן מקיף את ההתארגנות מחדש של INMC ואת סגירת הפער בשלמותה. בעוד פרוטוקול זה משמש כאן כדי להרוס INMCs, זה עשוי להיות מיושם על עבודה אחרת הדורשת הערכה אמינה ויעילה של אבלציה סלולרית. זוהי גם טכנולוגיה נגישה, שכן ניתן לתנהל על כל מיקרוסקופ קונפוקאלי המצויד בלייזר 405 אף-מ"ר.

<table><tbody><tr><td>12 בארות PTFE מודפס שקופיות אלקטרונים</td><td>מיקרוסקופיה מדעי</td><td>63425-05</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"מ תמיסת מלאי טריקאין</td><td>סיגמא</td><td>E10521</td><td>15 מ"מ טריקאין במים אוסמוזה הפוכה</td></tr><tr><td>1X E3 + 600 ומיקרו; M Tricaine</td><td></td><td></td><td>מדולל 15 מ"מ מלאי טריקאין 25X במדיה 1X E3</td></tr><tr><td>1X מדיה</td><td></td><td></td> E3 <td>מדלל 60X E3 מדיה ל-1X במי אוסמוזה הפוכה (16.7 מ"ל/ליטר)</td></tr><tr><td>60 X E3</td><td>מדיה כל הרכיבים שנרכשו מ-Sigma-Aldrich</td><td></td><td>34.4 גרם Nacl, 1.52 גרם Kcl, 5.8 גרם CaCl2.2H2O, 9.8 גרם MgSO4.7H20 ב-1 ליטר מים אוסמוזה הפוכה</td></tr><tr><td>Bx60 מיקרוסקופ מורכב עם פלואורסצנציה של מנורת קשת כספית מיקרוסקופ</td> קונפוקלי <td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 700 מצויד בלייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו-555 או 561 ננומטר</td> Carl <td>Zeiss Microscopy, LLC</td><td></td><td>לייזר 5 mW 405 ננומטר שימש לאבלציה; אבלציות והדמיה בוצעו באמצעות אובייקט 63x Plan-Apochromat עם NA של 1.40</td></tr><tr><td>FIJI/ImageJ תוכנת עיבוד תמונה</td><td>תורמים</td><td></td> מרובים <td>להורדה ב https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>ניתוח מחט שונה לסכין שיער</td><td>Fisher Scientific</td><td>19010</td><td>ריס הודבק על קצה מחט ניתוח עם ידית עץ</td></tr><tr><td>תוכנת Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corp.</td><td></td><td>גיליונות גוגל הם אלטרנטיבה ללא עלות לכלי זכוכית</td></tr><tr><td>תחתונים של מיקרוסופט אקסל 35 מ"מ עם כיסוי מס' 1.5, חלון 20 מ"מ</td><td>Mattek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>צלחת פטרי 35 מ"מ, חלון זכוכית 20 מ"מ</td></tr><tr><td>Immersol 518F שמן טבילה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל נמוך אגרוז</td><td>סיגמא מדעי החיים</td><td>A9414-256</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג נטוול הכנס עם 74 אום פוליאסטר רשת, 24 מ"מ הכנס</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3479-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio תוכנה</td><td>Rstudio PBC</td><td></td><td>להורדה ב</td></tr> <tr><td>https://rstudio.com/ SMX-168-BL סטריאו מיקרוסקופ</td><td>מוטיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>העברה פיפטה</td><td>פישר מדעי</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>ZEN תוכנה</td><td>קארל זייס מיקרוסקופיה, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מיקרוסקופ confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים interneuromast דגי זברה

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

תאי שיער הם תאים מכנו-חושיים המתווכים את חוש השמיעה. תאים אלה אינם מתחדשים לאחר נזק בבני אדם, אך הם מתחדשים באופן טבעי בעלי חוליות שאינם יונקים כגון דגי זברה. מערכת הקו הניגב של דגי הזברה היא מודל שימושי לאפיון התחדשות תאי שיער חושיים. הקו לחוץ מורכב של איברים המכילים תא שיער הנקראים neuromasts, אשר מקושרים יחד על ידי מחרוזת של תאים interneuromast (INMCs). INMCs לפעול כתאי הצבי המביאים להובלת neuromasts חדש במהלך הפיתוח. INMCs יכולים לתקן פערים במערכת הקו החוץ-תאלי שנוצר על-ידי מוות של תאים. שיטה מתוארת כאן עבור אבלציה INMC סלקטיבית באמצעות מיקרוסקופ קונבנציונלי סורק לייזר confocal ודגים טרנסגניים המבטאים חלבון פלורסנט ירוק INMCs. מיקרוסקופית זמן לשגות משמש לאחר מכן כדי לפקח על התחדשות INMC ולקבוע את קצב סגירת הפער. זה מייצג פרוטוקול נגיש עבור אבלציה תא שאינו דורש ציוד מיוחד, כגון לייזר אולטרה סגול פעמו רב עוצמה. פרוטוקול אבלציה עשוי לשרת תחומי עניין רחבים יותר, כפי שהוא יכול להיות שימושי עבור אבלציה של סוגי תאים נוספים, שימוש בהסטת כלים שכבר זמינה למשתמשים רבים. טכניקה זו תאפשר עוד יותר את האפיון של התחדשות INMC בתנאים שונים ומרקעים גנטיים שונים, אשר יקדמו את ההבנה של התחדשות תאי האבות החושיים.

על מנת לנפח INMCs והתחדשות שיא, זחלי דגי זברה המביעים GFP מוקרנים של הקו הטרנסגני ET20 הורצו ב 2- או 3 ימים לאחר הפריה עבור אבלציה כמתואר בשלב 5.4. ניתן להרכיב מספר דגים בו-זמנית כך שניתן יהיה ללכד מספר מעידות זמן בניסוי אחד. האזור של הקו לציבי הממוקם בין primIL3 ו primIL4 neuromasts זוהה, ותמונות טרום אבלציה צולמו כמתואר בשלבים 6.5-6.7 (איור 1א,ב).
שלושה גופים תא היו ממוקדים עבור אבלציה לייזר כדי ליצור פער במחרוזת INMC של כ 40 μm. סריקה לאחר אבלציה עם רווח גבוה והדמיה לאחר מכן אישרה כי לא נותרו גופות תאים באזור המפוברק, והותירה פער בין התחזיות המותארות של ה-INMCs הסמוכים(איור 1C). מוות תא הוכח עוד יותר על ידי בחינת ערוץ T-PMT לאחר אבלציה. תאים פגומים וגוססים סומנו על ידי גרעינים נפוחים וצורה לא סדירה, כמו גם מראהפרטני (איור 2,מתואר). במקרים מסוימים, הדמיית זמן לשגות גם חשפה את הגיוס של תאים אמוואידים גדולים שהיו מקרופאגיםסבירים (איור 2,כוכבית). אזורים כהים המקיפים את ה-INMCs המפוברקים הצביעו על פוטו-בליך בתאי periderm הצפולים. תאים אלה לא נראו פגומים או נהרסו על ידי קרני לייזר בניסויים אלה; במקום זאת, הפלואורסץ שלהם צומצם זמנית. מיקרוסקופית זמן לשגות מגלה כי תאים אלה בדרך כלל להתאושש לאחר אבלציה ולא לשנות צורה או אחרת מופיע פגום (תוצאות שלא פורסם, Volpe ואח ').
כדי לתמוך במפרט של הרס INMC, אבלציות בוצעו ET20 כפול-transgenic וזחלי Tg (neuroD:tdTomato) שבו עצב הקו לחוץ (אשר פועל רק מיקרונים מתחת לתאים interneuromast) מסומן עם חלבון פלורסנט אדום. אבלציות של מספר תאים שיצרו פערים גדולים במחרוזת INMC הייתה השפעה מועטה או לא על עצב הקו לחוץ המבוסס על פלואורסצנציה אדומה (איור 3). גמישות הטכניקה עבור תאים מקומיים שטחית הוכח על ידי הרס סלקטיבי של תאי שיער חושיים בודדים בתוך neuromasts של הקו לרוחב. באמצעות למעשה אותו פרוטוקול מפורט לעיל (סעיפים 7 ו 8), תאי שיער יחיד בזחלי Tg transgenic (myo6b:βactin-GFP) נהרסו ללא נזק לכאורה לתאים סמוכים(איור 4). תאי השיער המפוברקים לא התאוששו פלואורסץ לאחר מיקרוסקופ זמן לשגות, ואת הגרעינים שלהם היו באופן ניכר גרגרי ומותק לאחר חשיפהלייזר (איור 4B). בדומה לאבלטים של INMC, מקרופאגים לכאורה גויסו לעתים קרובות לאתר החשיפה ללייזר (תוצאות שלא תפורסם, Volpe ואח').
לאחר אבלציה לייזר ולכידת תמונה לאחר אבלציה, גודל הפער נמדד באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה בחופשיות. כלי המידה הדגים גדלי פער הנעים בין מיקרונים ספורים ל-100 מיקרון בלבד, בהתאם לרוחב של INMCs בודדים ולתאים הרבים שנבחרו לאבלציה(איור 5). מיקרוסקופית Timelapse הועסקה כדי להקליט התנהגויות INMC במהלך התחדשות. ב-50 ניסויים, 15 פערים (30%) נסגרו על ידי התחדשות בתוך תקופה של 24 שעות. ברוב המקרים, INMCs שהצליחו להתאושש עשו זאת בתוך השעות הראשונות של ההדמיה. השחזור הוגדר כנקודות הזמן שבה הקרנות מתאי שכנים באו במגע, אשר התרחשה 16 שעות לאחר אבלציה עבור פער של כ 40 μm(סרט 1). ערימות Z נבדקו בקפידה כדי להבטיח כי מגע תא-תא התרחש בתוך מטוס z יחיד, הימנעות חפצים אפשריים עקב z-הקרנה. ניתוח רגרסיה לוגיסטית גילה כי ההסתברות לסגירת פערים קשורה לגודל הפער (p = 0.0453), כאשר פערים קטנים יותר נוטים יותר להחלים. פער של 55.5 μm הניב הסתברות סגירה של 50% (איור 5).
ב-70% מהמקרים, INMCs לא הצליחו לסגור לחלוטין את הפער שנוצר על ידי אבלציה. עם זאת, גם במקרים אלה הצלחנו לעקוב אחר היווצרות של תחזיות ארוכות מ- INMCs השכנים, אשר דומים בכמה פעמים הרחבת קונוסים צמיחה עצבית(סרט 2). לכן, ניסויים אלה יכולים גם לספק תובנה על ההתנהגויות של INMCs לאחר נזק.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig01.jpg"> איור 1: אבלציה סלקטיבית של תאים interneuromast על ידי הקרן לייזר. (A)תאים Interneuromast בין neuromasts primIL3 ו primIL4 נבחרו עבור אבלציה. תאים אלה מציגים צורת ציר אופיינית עם הקרנות מוארך חופפים גופים סלולריים סמוכים. (ב)הדמיית טרום אבלציה זיהתה גופים תאיים שיכולים להיות מבלבלים כדי לייצר פער. (ג)הדמיה שלאחר אבלציה מאשרת אבלציה מוצלחת כפי שצוין על ידי היעדר גופים סלולריים באזור הפער. קנה מידה של פסים = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig02.jpg"> איור 2: הדמיה לאחר אבלציה מדגימה מוות של תאים בתגובה לחשיפה בלייזר בתאי interneuromast עם תווית GFP. הדמיית פוטו-מוליריה קלה משודרת (T-PMT) מצביעה על נוכחות של תא נמק בעל מראה פרטני (מוקפף) כמו גם גיוס תאים בעלי צורה לא סדירה שסביר להניח שהם מקרופאגים (*). מיזוג ערוצי GFP ו- T-PMT מאשר כי מוות של תאים ופעילות מקרופאג' התרחשה באתר של אבלציה. קנה מידה של פסים = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig03.jpg"> איור 3: ספציפיות של אבלציה interneuromast. (A)תאי GFP בעלי תווית מוקדמת (ירוק) ועצב קו רוחבי עם תווית TdTomato (אדום) ב- Tg(ET20; זחל. גופות תאים בסמיכות לעצב הקו הלילי היו ממוקדים לאבלציה. (ב)הדמיה שלאחר אבלציה מדגימה אבלציה של גופים סלולריים ממוקדים עם עצב קו רוחטי שלם. קנה מידה של פסים = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig04.jpg"> איור 4: אבלציה של תאי שיער חושיים באמצעות מיקרוסקופית קונפוקלית. (א) הדמיה טרום אבלציה זיהה GFP מסומן תא שיער חושי (*) המיועד אבלציה ב Tg כפול טרנסגניים (ET20; myo6b:βactin-GFP) זברה. הדמיית צינור פוטומולטיפלייר אור משודר (T-PMT) חושפת מורפולוגיה רגילה של תאי שיער, עם חתך רוחב עגול. (ב)הדמיית אבלציה מאשרת אבלציה מוצלחת של תא השיער המיועד. תמונת T-PMT מצביעה על אי-סדירות בצורת תא השיער וגרעיניות מוגברת לאחר חשיפה ללייזר, מה שמצביע על מוות בתאים ולא על פוטו-בליי. קנה מידה של פסים = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig05.jpg"> איור 5: רגרסיה לוגיסטית מדגמנת את ההסתברות לסגירת פער כפונקציה של רוחב רווח (ב- μm). ציון של 0 מייצג סגירת פערים מלאה, בעוד שציון של 1 מייצג סגירת פער לא שלמה. התוצאות מצביעות על כך שההשפעה של רוחב הפער על היכולת של תאים interneuromast לסגור את הפערים המתאימים היא משמעותית סטטיסטית (p = 0.0453, n = 24 סה"כ; n = 12 פערים סגורים, n = 12 פערים סגורים לחלוטין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
סרט 1: מיקרוסקופית זמן לשגות מדגים סגירת פער (~ 40 μm) לאחר 16 שעות. התמונות צולמו כל 15 דקות, והקרנה בעוצמה מקסימלית של z נעשתה עבור כל נקודות הזמן. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60966/Suppl_Movie_1.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
סרט 2: מיקרוסקופיה של פער INMC שלא נסגר. התחזיות המותחות וההסתעפות של ה- INMCs הנותרים מוצגות. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60966/Suppl_Movie_2.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>

אבלציה בלייזר היא טכנולוגיה ישימה לחקר התחדשות במערכות ביולוגיות. הפרוטוקול המוצג מתאר שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי לסריקת לייזר לאבלציה בלייזר והדמיית זמן-לשגות של התחדשות תאים interneuromast בקו רוחבי של דגי הזברה.

מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

באמצעות פרוטוקול זה, כל מעבדה שיש לה מיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי המצויד בלייזר 405 ננומטר יכולה לבצע אבלציות לייזר של תאי שיער ולפקח על התחדשותם. שלא כמו אלקטרו-אבלציה, טכניקה זו מגבילה נזקים לתאים הסובבים והיא נגישה יותר מהגדרת לייזר UV רבת עוצמה. הדמיה קונפוקלי יכול להתבצע גם מיד לפני ואחרי אבלציה.טכניקה זו מאפשרת לנו להבין טוב יותר את ההתנהגות הרגנרטיבית של אבי החושים, אשר עשוי לסייע בפיתוח טיפולים לאובדן שמיעה אנושי. להרכבה, פיפטה הראשונה שלוש עד ארבע זחלים הרדמה לתוך טיפה קטנה של פתרון טריקאין E3 למרכז המנה 35 מילימטר, עם 14 מילימטר מספר 1.5 לכסות להחליק התחתון. הסר את הפתרון העודף, כך הזחלים להישאר טיפה קטנה רק גדול מספיק כדי להכיל אותם.ומ מניחים את המנה על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו משקפת. לתפעל את הזום ולהתמקד כך שכל הזחלים נמצאים בשדה התצוגה ולהשתמש פיפטה העברה להוסיף שכבה דקה של פתרון אגרו על להחליק את הכיסוי. הסר את האגרוס העודף עד שהנוזל פשוט ממלא את הטוב בתחתית המנה, דואג לא להשראה לזחלים.ולהשתמש בסכין שיער כדי לכוון במהירות את הזחלים בתסרון האגרו עם הצד rostral פונה שמאלה. לחץ בעדינות על הזחלים כלפי מטה כנגד הזכוכית, כך שהזחלים שוכבים בפרופיל כאשר הצדדים הימניים שלהם פונים כלפי מטה. לאחר כ-60 שניות, האגרוס יתחיל להתגבש והזחלים לא יוכלו להיות מוכוון מחדש.לאחר חמש דקות, השתמש פיפטה העברה כדי למלא את המנה באמצע הדרך עם E3 בתוספת טריקאין 1X. כדי לאתר מטרות פוטנציאליות, הפעל את הכוח למערכת המיקרוסקופיה הקונפוקית לסריקת לייזר ואתחל את הלייזר באמצעות תוכנת ההדמיה המשולבת. בחרו את מטרת טבילת השמן 63X Plan-Apochromat והחלו שמן טבילה על העדשה.אבטחו את המנה בהכנסת שלב עגולה עם ההיבט הרוזלי של הזחלים הפונים שמאלה. באמצעות שדה בהיר או תאורת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית, בחר אחד הזחלים המותקנים להדמיה ולהשתמש ידית המיקוד כדי להביא את העור בצד של הדג הקרוב ביותר לכיסוי להחליק לתוך המוקד. עבור לתאורה אפיפלורסנטית בערוץ GFP ואתר את הקו האחורי לצדדים על ידי ביטוי GFP לאורך מיוספטום אופקי.טבעות של תאים פלואורסצנטיים מעידות על תאי המעטפת הנוירו-מוסטים וגדילים מוארכים של תאים הם תאי ההתמחות. החל מנוירומטום הפריפורדיום הנודד הראשון, השתמש בהיגוי בקרת הבמה כדי לסרוק באופן חזותי באופן סיבתי לאורך המיוספטום האופקי. בעקבות המחרוזת של תאי interneuromast עד האזור בין השלישי והרביעי נודדים primordium neuromasts הוא הגיע.אם יש לדמיין מספר זחלים, בחרו מיקום למיקום השלב הראשון. לאחר שזוהו גופי תאים באזור L3, L4, עבור למצב רכישה ולהשתמש בלייזר המתאים כדי להפעיל את מסלול ההדמיה GFP. כדי להוסיף ערוץ אור משודר למסלול הלייזר המופעל, לחץ על התיבה T-PMT בתפריט הנפתח של הגדרת ההדמיה.כדי לדמיין זחלי ET20, בחר בלייזר 488 ננומטר, הגדר את כוח הלייזר ל- 6% מגודל חור הסיכה ליחידת שטח אחת שוות ערך ואת הרווח הדיגיטלי ל- 750. התאימו את הרווחים כך שגופם של התאים יהיה רווי כדי ללכוד תחזיות עמומות ופילופודיה. והגדר את גודל המסגרת ל- 1, 024 על 1, 024 פיקסלים, הממוצע לשניים וההגדלה הדיגיטלית ל- 0.7.סמן את התיבה מחסנית Z כדי להעלות את התפריט הנפתח מיקום Z. תוך כדי סריקה מהירה, התמקדו עד שתאי ה-interneuromast פשוט יצאו מפוקוס והגדירו את הפרוסה הראשונה. התמקדו בדגימה עד שתאי ה-interneuromast שוב יצאו מהפוקוס והגדירו את הפרוסה האחרונה.לאחר מכן לחץ על עצור ולחץ על התחל ניסוי כדי ללכוד מחסנית Z טרום-אבלציה. אם נוספו מיקומי הבמה, בטל את הפעלת אפשרות המיקומים כך שרק המיקום הנוכחי ידמיין וישמור את הקובץ לאחר לכידתו. לקבלת אבלציה בלייזר של גופי התאים הממוקדים, לחץ על הצג את כל הכלים בממשק הרכישה ובתפריט הגדרת ההדמיה, בחר הוסף רצועה חדשה.לחץ על צבע ובחר DAPI. תחת ערוצים, בחר 405 עבור הגדרת הלייזר והגדל את כוח הלייזר ל- 75%Unclick של ערוץ DAPI כדי לכבות את הלייזר בעת סריקה לאיתור גופי תאים מועמדים לקבלת אבלציה. לחץ בשידור חי ועם הגוף של תא interneuromast מרוכז בשדה התצוגה, זום לתוך מסגרת הסריקה ל 20 עד 22X.הפסק את הסריקה החיה ברגע שגוף התא ימלא את שדה התצוגה. בדוק את תיבת תריס לייזר 405 ננומטר כדי להפעיל את המסלול ולהגדיר טיימר במשך 45 שניות. לאחר מכן, הפעל סריקה רציפה והפעל את שעון הזמן.מיד לעצור את הסריקה ב 45 שניות. להדמיה של גופי התא לאחר אבלציה, מתחת לתפריט הערוצים, בטל את הרצועה DAPI כדי להשבית את לייזר אבלציה ולפתוח את תפריט מצב הרכישה. לחץ על שנה גודל תצוגה והקטין את גודל התצוגה ל- 0.7.כדי להעריך את ההצלחה של אבלציה התא, לסרוק במהירות את שדה התצוגה. שימוש באותן הגדרות כמו אלה עבור דימות טרום אבלציה, ללכוד ולשמור תמונה שלאחר אבלציה. בדוק את תמונת ערוץ הצינור photomultiplier אור משודר כדי לאשר עוד יותר את הנזק התאי.תאים פגומים ידגימו מראה פרטני והגרעין יתנפח לעתים קרובות או ייראה לא סדיר בצורתו. כדי להעריך את התאוששות גוף התא שלאחר אבלציה, הפעל הן את מיקום הבמה והן את אפשרויות הזמן ללכידת תמונה לשגות בזמן והגדר את פרמטרי הזמן לנקודת הזמן הניסיונית המתאימה ומרווחי זמן של 15 דקות. לאחר מכן, התחל את הניסוי כדי להשיג תמונות ולשמור את הקובץ שנוצר לאחר השלמתו.בניסוי מייצג זה זוהה אזור הקו הצדדי הממוקם בין הנוירומסטים הנודדים השלישי והרביעי נודדים ותמונות טרום אבלציה נלכדו. סריקה שלאחר אבלציה אישרה כי לא נשארו גופות תאים באזור האבלציה. השארת פער בין התחזיות המוארכות של תאי ההתמחות הסמוכים.ניתוח של ערוץ צינור photomultiplier אור משודר לאחר אבלציה, מגלה תאים פגומים וגוססים. מסומן על ידי גרעינים נפוחים בצורה לא סדירה ומראה פרטני. גיוס של תאים אמובואידיים גדולים כי הם מקרופאגים סביר גם ניתן לראות.בניסוי זה, אבלציה של מספר תאים בזחלים המהומשים הכפולים יצרה פערים ניכרים במחרוזת התאים interneuromast, אך הייתה לה השפעה מועטה או ללא השפעה על עצב הקו בצד השני. לאחר אבלציה בלייזר, גדלי הפער ניתן למדוד. החל מכמה מיקרונים ועד 100 מיקרון, בהתאם לרוחב שתאי הנוירו-מאסט הבודדים וכמה תאים נבחרים לאבלציה.לאחר אבלציה, כמה תאים interneuromast להתאושש בתוך השעות הראשונות של הדמיה. עם ההסתברות לסגירת פערים בקורלציה שלילית עם גודל הפער. אפילו בתאי interneuromast שאינם מסוגלים להתאושש עם זאת, היווצרות של תחזיות ארוכות מתאי interneuromast השכנים, אשר יכול להידמות הארכת קונוסים צמיחה עצבית ניתן לראות.חשוב לבדוק ביסודיות את ערוץ T-PMT לתאים פגומים המציגים גרעינים וצפיפות בצורה לא סדירה, ולאפשר מספיק זמן לאינדיקטורים אלה של מוות תאי להיות גלויים. ניתוח נוסף של נתוני המיקרוסקופיה הנובעים מזמן לשגות, יכול לחשוף התנהגויות תאיות חדשניות הנגרמות על ידי אבלציה בלייזר ועשוי להנחות את הפיתוח של ניסויים לזיהוי וסתים של התחדשות. טכניקה זו אפשרה לנו ללמוד את הרגולטורים המולקולריים של התחדשות תאי interneuromast על ידי מתן שיטה מהירה וחסכונית לפגיעה סלקטיבית בתאים אלה.

confocal-microscope-based-laser-ablation-regeneration-assay-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מתארים שיטה הרכבה עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך, שני הפוטונים הדמיה רקמות נזק טכניקות זמן לשגות הדמיה confocal.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של...

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

סרטון זה מדגים את השיטה לחקר זיהוי טרף חזותי בזחלי זברה טרנסגניים באמצעות הדמיה פלואורסצנטית מבוססת מחוון סידן כאשר תאי העצב שלהם מבטאים קומפלקסים של אינדיקטור סידן פלואורסצנטי.

ניתוח הפעילות העצבית המעוררת טרף בזחל דג זברה מהונדס

מקור: Volpe, B. A., ,  ואחרים בדיקת אבלציה והתחדשות לייזר מבוססת מיקרוסקופ קונפוקלי בתאים בין-נוירומאסטים של דג הזברה. J. Vis. exp.{{TAG_ 31}} (2020) } סרטון זה מדגים ניטור התאוששות תאים בין-עצביים בדגי זברה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, מעקב אחר מוות ותיקון תאים באמצעות הדמיה פלואורסצנטית בזמן-lapse.

ניטור התאוששות של תאים בין-נוירומסטים בלייזר בדגי זברה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

מקור: Morsch, M.,  et. al., הפעלת מתח ומוות של תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של לייזר UV קונבנציונלית. J. Vis. Exp. (2017) בסרטון זה, אנו בוחנים את הטכניקה של אבלציה בלייזר UV בעוצמה גבוהה למיקוד מדויק ולימוד של נוירונים בודדים בדג זברה טרנסגני. אנו מדגימים כיצד להכין, לשתק ולדמיין תגובות עצביות, תוך הדגשת הדינמיקה התאית של פציעה והתאוששות.

אבלציה סלקטיבית של לייזר חד-נוירון בזחל דג זברה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

מקור: Muto, A., . אבלציה של אוכלוסייה עצבית באמצעות לייזר דו-פוטוני והערכתה באמצעות הדמיית סידן ורישום התנהגותי בזחלי דג זברה. J. Vis. exp. (2018)} } בסרטון זה,  מודגם הליך אבלציה בלייזר דו-פוטוני, המאפשר הרס סלקטיבי של נוירונים פלואורסצנטיים בזחלי דג זברה משותקים באגרוז. הדמיה ברזולוציה גבוהה לפני ואחרי ההליך מאשרת נזק עצבי יעיל, כפי שנצפה בהיעדר פלואורסצנטיות.

אבלציה עצבית ממוקדת באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית בזחל דג זברה

למרות שמערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי לאחר פציעה, מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש חי, דג הזברה מהונדס וassay חיתוך רוחב עצב לשחזור, אנחנו יכולים ללמוד התנהגויות תא גליה דינמיות במהלך ניוון עצבי והתחדשות.

חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

דג זברה היא דוגמנית החיות פופולרי לחקור מנגנונים של ניוון רשתית/התחדשות גולגולת. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזירוז מקומי פגיעה שיבוש הרשתית החיצונית עם נזק מינימלי הרשתית הפנימי. לאחר מכן, אנחנו מפקחים ויוו המורפולוגיה הרשתית ואת התגובה עכשיו, דונלד מילר ברחבי התחדשות ברשתית.

עכשיו, דונלד מילר הפעלת תא לייזר המושרה ניוון הרשתית, התחדשות מודל בדג זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ablate של subpopulation שכותרתו גנטית של נוירונים על ידי לייזר שני הפוטונים מן דג זברה הזחלים.

אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבחינת פעילות עצבית באזורי מוח של דגי זברה טרנסגניים המבטאים מדדי סידן GCaMP באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ב Vivo הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של פעילות עצבית הנגרמת על ידי גירוי חושי בדג זברה זחל מרוסן חלקית

למדו שיטת אבלציה בלייזר 405 ננומטר במיקרוסקופ קונפוקל לחקר התחדשות תאי Interneuromast בזברה Danio rerio. הפרוטוקול מאפשר מעקב מדויק אחר תהליכי התחדשות תאי קולטנים ותובנות לטיפולים בבעיות שמיעה.

מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

גלה סרטונים נוספים