Name: באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: למד לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון בזרע של C. elegans באמצעות שיטת הסמיכות. טכניקה זו חושפת תבניות מרחביות וזמניות ומספקת רגישות השווה לשיטות FRET ו-BiFC ללא מורכבותן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

כמה זנים נמטודות בשימוש במחקר זה סופקו על ידי המרכז הגנטיקה של caenorהאבודיטיס ממומן על ידי NIH (P40OD010440). מיקרוסקופ confocal וקד נערך באוניברסיטת מונטנה BioSpectroscopy ליבה מעבדה מחקר פעלו עם תמיכה מ-NIH פרסים P20GM103546 ו S10OD021806. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק NIH GM109053 כדי E.V., האגודה האמריקנית לאיגוד הלבבות 18 PRE34070028 ל X.W., ופרס האקדמיה למדעים של מונטנה ל-X.W. התורמים לא היו מעורבים בתכנון הלמידה או בכתיבת הדו ח. . אנו מודים למ אלאלבקר לדיון

<ol><li>Berggård, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li>
<li>Nooren, I. M., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li>
<li>Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hub+promiscuity+in+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Hub promiscuity in protein-protein interaction networks.</a> International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).</li>
<li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807(2010).</li>
<li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+germ+cell+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).</li>
<li>Nousch, M., Eckmann, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).</li>
<li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003(2018).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA%2C+a+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+situ+protein-protein+complexes+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+using+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), 52139(2015).</li>
<li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li>
<li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29%3A+a+5-year+update+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives.</a> Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).</li>
<li>Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45 (3), 185-191 (2008).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li>
<li>Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+chains+of+mammalian+cytoplasmic+dynein%3A+identification+and+characterization+of+a+family+of+LC8+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains.</a> Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).</li>
<li>Erdős, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+linear+motif+filtering+protocol+reveals+the+role+of+the+LC8+dynein+light+chain+in+the+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway.</a> PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885(2017).</li>
<li>Navarro-Lérida, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+of+brain+proteins+that+interact+with+dynein+light+chain+LC8%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8.</a> Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).</li>
<li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DYNLL%2FLC8%3A+a+light+chain+subunit+of+the+dynein+motor+complex+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond.</a> FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).</li>
<li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+reveals+the+binding+motif+preference+of+the+LC8%2FDYNLL+hub+protein+and+predicts+large+numbers+of+novel+binders+in+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18818(2011).</li>
<li>Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+IDP+assemblies%3A+Unique+properties+of+LC8-associated%2C+IDP+duplex+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds.</a> FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).</li>
<li>Jespersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+recognition+motifs+for+the+hub+protein+LC8%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8.</a> Life Science Alliance. 2 (4), (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+light+chain+DLC-1+promotes+localization+and+function+of+the+PUF+protein+FBF-2+in+germline+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells.</a> Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).</li>
<li>Dorsett, M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+dynein+in+the+inhibition+of+germ+cell+proliferative+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).</li>
<li>Ellenbecker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+Light+Chain+DLC-1+Facilitates+the+Function+of+the+Germline+Cell+Fate+Regulator+GLD-1+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).</li>
<li>Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+DLC-1+associates+with+ribonucleoprotein+complexes+to+promote+mRNA+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation.</a> FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).</li>
<li>Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zinc+finger+proteins%2C+OMA-1+and+OMA-2%2C+are+redundantly+required+for+oocyte+maturation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans.</a> Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).</li>
<li>Spike, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+the+oogenic+program+by+components+of+OMA+ribonucleoprotein+particles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).</li>
<li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK+in+the+C.+elegans+Germline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+staining+in+C.+elegans+using+%22freeze-cracking%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking".</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Crittenden, S., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+immunolabeling+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

כאשר לימוד PPIs ב -C. אלגיה germline, הרזולוציה הגבוהה ביותר המוצעים על ידי PLA לעומת שיתוף חיסוני מאפשר הדמיה וכימות של מיקומים שבהם אינטראקציות להתרחש ב-germline. זה דווח בעבר כי DLC-1 לקיים אינטראקציה ישירה עם OMA-1 באמצעות שיטת מחוץ גופית בשנת 26; עם זאת, האינטראקציה הזאת לא התאושש על ידי vivo הנפתח. הפלורסנט שיתוף חיסוני של 3xFLAG::D LC-1; OMA-1:: GFP germlines מראה חפיפה בדפוסי הביטוי עבור DLC-1 ו-OMA-1; עם זאת, אין אינדיקציה היכן האינטראקציות שלהם מתרחשות ב-germline, ואת ה...

מעל 80% של חלבונים מוערכים יש אינטראקציות עם מולקולות אחרות1, אשר מדגיש כיצד ppis חשוב לביצוע של פונקציות ביולוגיות ספציפיות בתא2. חלבונים מסוימים לתפקד כרכזות ההקלה על הרכבה של מתחמים גדולים יותר הנחוצים עבור הישרדות התא1. רכזות אלה מתווך PPIs מרובים ולעזור לארגן חלבונים לתוך רשת המאפשרת פונקציות ספציפיות בתא3. היווצרות של מכלולי חלבון מושפע גם על ידי הקשר הביולוגי, כגון נוכחות או היעדרות של שותפים ספציפיים אינטראקציה4, תא איתות אירועים, ובשלב ההתפתחותי של תא.
ג. אלגיה משמשת בדרך כלל כאורגניזם מודל למגוון מחקרים, כולל פיתוח. האנטומיה הפשוטה של בעל החיים מורכבת ממספר איברים, כולל הגונאד, הבטן והקוטיקולה השקופה, המאפשרת ניתוח של פיתוח תולעים. את germline המתגוררים לוטה הוא כלי נהדר ללמוד כיצד בתאי גזע germline בוגרים לתוך גמטות5 המתפתחים לעוברים ובסופו של דבר הדור הבא של צאצאי. אזור הקצה המרוחק של הגרמקו (germline) מכיל מאגר של תאי גזע המחדשים את עצמם (איור 1). כמו תאי גזע לעזוב את הנישה, הם התקדמות לתוך pachytene המיון ובסופו של דבר להתפתח oocytes בשלב המבוגר הצעיר (איור 1). תוכנית זו של פיתוח ב-germline מוסדר באופן הדוק באמצעות מנגנונים שונים, כולל רשת לאחר ההמרה הרגולציה הקלה על ידי ה-RNA-כריכת חלבונים (RBPs)6. PPIs חשוב עבור פעילות תקינה זו, כמו RBPs שותף עם קופנים אחרים כדי להפעיל את הפונקציות שלהם.
ישנן מספר גישות שניתן להשתמש בהן כדי לחקור עבור PPIs בתולעת, אבל לכל אחד יש מגבלות ייחודיות. ב vivo IMMUNOPRECIPITATION (IP) ניתן להשתמש כדי לבודד חלבון חלבון מתחמי מתמציות תולעת שלמות; עם זאת, גישה זו אינה מציינת היכן ה-PPI מתרחשת בתולעת. בנוסף, מתחמי חלבון כי הם ארעי ורק טופס במהלך שלב מסוים של פיתוח או במספר מוגבל של תאים יכול להיות קשה להתאושש על ידי co-immunoprecipitation. לבסוף, ניסויים בקניין רוחני צריכים לטפל בחששות של מורכבות חלבון לאחר הליזה ושימור לא ספציפי של חלבונים על מטריצת הזיקה.
גישות חלופיות לאיתור באתרו של ppis כתמים שיתוף חיסוני, Förster תהודה העברת אנרגיה (לדאוג), ומשלימה ביולקולרית הקומפלמנטציה (bimolecular). שיתוף חיסוני מסתמך על זיהוי סימולטני של שני חלבונים של עניין רקמת תולעת קבועה ומדידה של היקף לוקליזציה של אות. שימוש במיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, המציעה פירוט רב יותר מאשר המיקרוסקופיה הסטנדרטית7, מסייע באופן מדוקדק יותר לבדוק לוקליזציה חלבון מעבר למכשול עקיפה-מוגבל של 200-300 ננומטר8. עם זאת, התאמה חיסונית משותפת באמצעות מיקרוסקופ קונבנציונאלי ברזולוציה סופר עובד הטוב ביותר עבור חלבונים עם דפוסי לוקליזציה מוגדרים היטב. לעומת זאת, הוא הופך להיות הרבה פחות אינפורמטיבי לשותפים בעלי אינטראקציה מבוזרת. מדידה להתאמה משותפת של אותות המבוססים על חפיפה אינה מספקת מידע מדויק על האם החלבונים מורכבים זה מזה9,10.
יתר על כן, co-immunoprecipitation ושיתוף חיסוני של מכלולי חלבון-חלבון אינם כמותיים, מה שהופך אותו מאתגר כדי לקבוע אם אינטראקציות כאלה הן משמעותיות. מדובר בשתי טכניקות המבוססות על פלורסנט. מסתמך על תיוג חלבונים של עניין עם חלבונים פלורסנט (FPs) כי יש חפיפה ספקטרלית שבה אנרגיה מאחד FP (תורם) מועבר אחר FP (קבלה)11. זו העברה לא רדיוטיבית של תוצאות האנרגיה הפלואורסצנטית של הקבלה FP שניתן לזהות בתוך הגל המתאים של פליטה. BiFC מבוססת על החוקה של חלבון פלורסנט ב vivo. זה כרוך בפיצול GFP לשני שברים משלימים, כגון ה1-10 ו סליל 1112, אשר התמזגו אז שני חלבונים של ריבית. אם שני החלבונים האלה אינטראקציה, השברים המשלימים של GFP להיות קרובים מספיק בסמיכות לקפל ולהרכיב, המהווים מחדש את fluorophore GFP. מחדש GFP הוא הבחין במישרין כמו פלואורסצנטית ומציין היכן PPI התרחשה.
ככזה, הן גם לדאוג וגם BiFC תלוי תגי פלורסנט גדול שיכול לשבש את הפונקציה של חלבון מתויג. בנוסף, יש לבקש ממנו ביטוי שופע ודומה של החלבונים המתויגים להשגת נתונים מדויקים. לא ניתן להתאים לניסויים שבהם שותף אחד הוא עודף של השני, אשר יכול להוביל לרקע גבוה13. ביטוי יתר בניסויים BiFC יש גם להימנע, כי זה יכול לגרום להרכבה לא ספציפית14 כי התוצאה היא מוגברת הרקע. שתי הטכניקות דורשות אופטימיזציה של הביטוי ותנאי הדימות של חלבונים מתויגים, אשר עשוי להאריך את הזמן הנדרש כדי להשלים ניסויים.
הטיפול הצמוד (PLA) הוא גישה חלופית שיכולה לטפל במגבלות הטכניקות המוזכרות לעיל. PLA מנצל את הנוגדנים העיקריים המכירים את חלבוני הריבית (או התגים שלהם). נוגדנים ראשוניים אלה מאוגדים לאחר מכן על ידי נוגדנים משניים המכילים בדיקה מחדש של olig, שיכולים לhybridize אחד עם השני כאשר בתוך 40 ננומטר (או קצר) מרחק15. ה-DNA הוכלא כתוצאה מוגבר באמצעות תגובת PCR, אשר מזוהה על ידי בדיקות המשלימים את ה-DNA. זה התוצאות וקדי כי הם דמיינו על ידי מיקרוסקופ. טכנולוגיה זו יכולה לזהות PPIs באתרו רקמות מורכבות (כלומר, gonad התולעת), אשר מאורגן כקו הרכבה המכיל תאים בשלבים שונים של פיתוח ובידול. עם PLA, PPIs יכול להיות במישרין דמיינו בתוך gonad תולעת קבועה, אשר יתרון עבור חקירת האם PPIs להתרחש במהלך שלב ספציפי של פיתוח. PLA מציע ברזולוציה גבוהה יותר של PPIs לעומת שיתוף לוקליזציה מבוסס assays אשר הוא אידיאלי לעשיית מדידות מדויקות. אם נעשה שימוש, מיקרוסקופ סופר-רזולוציה יש את הפוטנציאל לספק פרטים דקים יותר על המיקום של PLA וקדי בתוך תא. יתרון נוסף הוא כי וקדי הנובע מתגובות PLA ניתן לספור על ידי זרימת עבודה מבוססי imagej ניתוח, מה שהופך את הטכניקה הזאת כמותית.
המשפחה LC8 של שרשראות האור דינאין תוארה לראשונה כיחידת משנה של דינאין מנוע קומפלקס16 ו היפותזה לשמש מתאם המטען. מאז התגלית הראשונית שלה, LC8 נמצא מתחמי חלבון מרובים בנוסף למתחם דינאין מנוע17,18,19,20. סריקת רצפי חלבונים המכילים את מוטיב LC8 אינטראקציה19 מציע כי LC8 יכול להיות הרבה אינטראקציות עם מגוון רחב של חלבונים שונים17,18,19,20,21,22. כתוצאה מכך, חלבונים LC8 משפחתיים נחשבים כעת רכזות המסייעות לקדם את ההרכבה של מכלולי חלבון גדולים יותר19,22, כגון מכלולים של חלבונים בעלי סדר מבחינה מיסודה21.
אחד C. אלגיה LC8-חלבון משפחה, דינאין אור שרשרת-1 (DLC-1), מבוטא באופן נרחב על פני רקמות רבות ולא מועשר מבנים ספציפיים subcellular23,24. כתוצאה מכך, זיהוי של רלוונטיות ביולוגית בvivo שותפים של DLC-1 ב -C. אלגיה מאתגרת מספר סיבות: 1) co-immunoprecipitation אינו מצביע על מקור הרקמה שבו האינטראקציה מתרחשת; 2) ביטוי מוגבל של שותפים מסוימים או אינטראקציות ארעי עלול לעכב את היכולת לזהות אינטראקציה על ידי co-immunoprecipitation; ו-3) לפזר התפלגות של DLC-1 מוביל חפיפה לא ספציפית עם חלבונים שותפים פוטנציאליים על ידי שיתוף חיסוני. בהתבסס על האתגרים הללו, PLA היא גישה אידיאלית לבחינות באינטראקציות vivo עם DLC-1.
בעבר דווח כי DLC-1 מקיים אינטראקציה ישירה עם ומשמש כקופקטור עבור ה-RNA-כריכת חלבונים (RBPs) FBF-223 ו gld-125. העבודה שלנו תומכת במודל של dlc-1 לשמש כחלבון hub ומציע dlc-1 מקלה על רשת אינטראקציה המתפרס מעבר דינאין19,22. באמצעות השיטה הנפתחת GT, מחדש DLC-1-אינטראקציה RBP בשם OMA-1 זוהה26. OMA-1 חשוב עבור צמיחה oocyte ו meiotic התבגרות27 פונקציות בשילוב עם מספר מrepressors translational ומפעילי28. בעוד FBF-2 ו-GLD-1 מבוטאים בתאי הגזע ואזורי pachytene, בהתאמה, OMA-1 היא ביטוי בדרך מאוד מתבטאת ב-germline מתוך pachytene meiotic באמצעות האוציטים27 (איור 1). הדבר מרמז על כך DLC-1 צורות מתחמים עם RBPs באזורים שונים של gonad. יש גם נמצא כי האינטראקציה הישירה בין DLC-1 ו-OMA אחד נצפתה בתוך מבחנה לא התאושש על ידי vivo IP. ה-PLA שימש בהצלחה כגישה חלופית למחקר נוסף זה אינטראקציה ב -C. אלגיה germline, ואת התוצאות מרמזות כי PLA ניתן להשתמש כדי לחקור ppis רבים אחרים בתולעת.

<table><tbody><tr><td>תמיסת פרפורמלדהיד 16%</td><td>שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15710</td><td>שימש לייצור תמיסת עבודה</td></tr><tr><td>של 4% 1M KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>הכן מלאי עבודה של 1M</td></tr><tr><td>1x M9</td><td>שונים</td><td></td><td>מוכנים כמלאי 10x בשימוש ב-1x; ראה wormbook.org לפרוטוקול</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>שונים</td><td></td><td>ראה wormbook.org לפרוטוקול</td></tr><tr><td>26.5 Gauge Needle</td><td>Exel International</td><td>26402</td><td>מחטים המשמשות לדיסקציה</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Lampire</td><td>7500802</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה</td><td>Thermo Scientific</td><td>05-529C</td><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה רכס אלון המשמש לסנכרון</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>צנצנת קופלין</td><td>PolyLab</td><td>62101</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip להקפאת דגימת</td><td>Globe Scientific</td><td>1411-10</td><td>22x40 מ"מ, מס' 1</td></tr><tr><td>Coverslip לאיטום Slide</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td>22x22 מ"מ, מס' 1.5</td></tr><tr><td>מדיום הרכבה DAPI עבור וקטור אימונופלואורסצנטי</td><td></td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82029</td><td>Duolink 1x Ligase, מגיע כחלק מהערכה האדומה של Duolink In Situ Detection Reagent </td></tr><tr><td>DUO92008 מאגר אדום הגברה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>DUO82011</td><td>Duolink 5x הגברה מאגר אדום, מגיע כחלק מהערכה האדומה של Duolink In Situ Detection Reagents DUO92008</td></tr><tr><td>Ligation Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> DUO82009-Duolink <td>5x Ligation Buffer, מגיע כחלק מהערכה האדומה של Duolink In Situ Detection Reagents Red DUO92008</td></tr><tr><td>נוגדנים מדלל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82008</td><td>מדלל נוגדנים Duolink, מגיע עם DUO92004 ו-DUO92002, הערה: תמיסת PBS/1% BSA 1x יכולה לשמש גם כתחליף לדילול הנוגדן.</td></tr><tr><td>פתרון חסימה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82007</td><td>פתרון חסימת Duolink, מגיע עם</td></tr><tr><td>מדיום הרכבה DUO92004 ו-DUO92002 עבור PLA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td>מדיום הרכבה Duolink באתרו עם DAPI</td></tr><tr><td>MINUS Probe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS</td></tr><tr><td>PLUS בדיקה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>DUO92002 Duolink In Situ בדיקה אנטי-ארנב פלוס</td></tr><tr><td>מאגר כביסה A</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>DUO82046</td><td>Duolink מאגר כביסה באתרו מאגר</td></tr><tr><td>כביסה B</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>DUO82048</td><td>Duolink מאגר כביסה באתרו B</td></tr><tr><td>פולימראז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>DUO82030</td><td>Duolink פולימראז, מגיע כחלק מהערכה האדומה של Duolink In Situ Detection Reagents DUO92008</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td></td><td>DFC300G מצלמה, מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>DM5500B עז נגד עכבר Alexa 594</td><td>JacksonImmuno</td><td>115-585-146</td><td>השתמש ב-1:500</td></tr><tr><td>עז נגד ארנב Alexa 488</td><td>JacksonImmuno</td><td>111-545-144</td><td>השתמש ב-1:200</td></tr><tr><td>תוכנת עיבוד תמונה</td><td>Adobe</td><td></td><td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td></tr><tr><td>זכוכית פיפטה</td><td>קורנינג</td><td>7095B-5X</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>ACROS אורגני</td><td>187870100</td><td>הכן מלאי עבודה של 250 מ"מ</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר מדעי</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נגד FLAG</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>השתמש ב 1:1000 לאימונופלואורסצנציה ו- PLA, חסימה מוקדמת עם סרום עזים רגיל מומלץ</td></tr><tr><td>לק ציפורניים</td><td>צבעי לוס אנג'לס</td><td>CNP195</td><td></td></tr><tr><td>מדיום גידול נמטודות (NGM)</td> <td>שונים</td><td></td><td>ראה wormbook.org עבור פרוטוקול</td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>JacksonImmuno</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן פסטר פיפטה</td><td>גלובוס מדעי</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1524</td><td>מוכן כתמיסת מלאי של 0.1% במים, מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, ומדולל 1:100 במים לציפוי שקופיות</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>Tritech</td><td>PD7060</td><td>ארנב בקוטר 60 מ"מ</td></tr><tr><td> אנטי-GFP</td><td>תרמו פישר</td><td>G10362</td><td>השתמש ב-1:200 עבור אימונופלואורסצנטיות, 1:4000 עבור</td></tr><tr><td>שקופיות</td> PLA <td>Thermo Fisher</td><td>30-2066A-Brown</td><td>שקופיות ניתנות לחיטוי תלת-ריבועיות 14x14 מ"מ עם סורגים מוזמנות בהתאמה אישית דרך פישר סיינטיפיק. פולי-L-ליזין נוסף לשקופיות במעבדה</td></tr><tr><td>תמיסת נתרן היפוכלוריט</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS290-1</td><td></td></tr><tr><td>מגבוני משימות</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>4.4x8.4 אינץ' מגשי משימות</td></tr><tr><td>(242x241x20 מ"מ)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>240845</td><td>משמש לייצור תא לח</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ACROS Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>מים טהורים במיוחד</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>מים טהורים במיוחד המתקבלים ממערכת טיהור מים אינטגרלית Milli-Q</td></tr><tr><td>Watchglass</td><td>Carolina Biological</td><td>742300-20</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C מקפיא-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מעלות; מקפיא</td><td></td><td></td><td></td>C</tr><tr><td>רדיד</td><td></td><td></td><td></td>אלומיניום</tr><tr><td>OP50 זן E. coli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זני נמטודות ששימשו במחקר זה (שניהם זמינים לפי בקשה)</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II; UNC-119(ED3) III; teIs1 [pRL475]</td><td></td><td>UMT 376</td><td>dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; הפניה 24</td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td><td></td><td>UMT 422</td><td>dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); סימוכין: מחקר זה</td></tr></tbody></table>

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -c. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

הבנת המועד והיכן מתרחשים אינטראקציות חלבונים בחלבון (PPIs) קריטיות להבנת פונקציית החלבון בתא וכיצד תהליכים רחבים יותר כגון פיתוח מושפעים. האלקאנס הוא מערכת מודל מעולה ללימוד ppis הקשורים בוויסות תאי גזע, מיוזיס ופיתוח. יש מגוון רחב של טכניקות מפותחות המאפשרות חלבונים של עניין להיות מתויג על ידי נוגדנים סטנדרטיים, מה שהופך את זה יתרון מערכת עבור הסמיכות הצורך הקשור (PLA) תגובות. כתוצאה מכך, PLA הוא מסוגל להראות איפה PPIs להתרחש בצורה מרחבית וטמפורלית באופן יעיל יותר מאשר גישות חלופיות. המתואר כאן הוא פרוטוקול עבור יישום וכימות של טכנולוגיה זו כדי לחקור את PPIs ב -C. אלגיה germline.

שיתוף חיסוני של שני הדגלים של 3xFLAG::D LC-1; דגל GFP ו 3xFLAG::D LC-1; OMA-1:: GFP germlines עם הדגל ונוגדנים GFP חשף דפוסי הביטוי שלהם ב-germlines (איור 3כל-Iii, 3bii-iii). בעוד GFP התבטא ברחבי germline (איור 3Aiii), OMA-1:: gfp הביטוי היה מוגבל pachytene מאוחר ו oocytes (איור 3biii)27. חיסוני הדגל מראה כי 3xFLAG::D LC-1 התב...

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

מישן קשירה קרבה מאפשר למשתמשים לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון במקום, חושף דפוסים מרחביים ותזמניים של האינטראקציות. טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות חשובות על רגולציה של פיתוח C.elegans. טכניקה זו מציעה רגישות דומה לגילוי אינטראקציות חלבון-חלבון ללא המורכבות של טכניקות אחרות, כגון FRET ו- BiFC.אנשים שמעולם לא לנתח תולעים כדי לשחרר את הקניונים עשויים להיאבק עם צעד זה. תרגלו לנתח תולעים, ולהשתמש בהן לשפעת חיסונית כדי לשכלל את טכניקות הטיפול והניתוח לפני שתעבור ל-PLA. כדי להתחיל, לבחור 30 עד 40 תולעים בוגרות צעירות לתוך צלחת זכוכית שעון המכיל 500 microliters של 1x M9 ו levamisole.לאחר איסוף התולעים, להסיר בזהירות להשליך את רוב התקשורת כדי להסיר חיידקים המועברים יחד עם התולעים. מוסיפים 500 מיקרוליטר טריים של 1x M9 ו levamisole, ולהשתמש פיפטה בעדינות לצייר ולחלק את התקשורת כדי לשטוף את התולעים. הסר ומחק בזהירות את רוב המדיה.חזור על הכביסה פעמיים עד שלוש פעמים. לאחר הכביסה, להשאיר את התולעים על 100 microliters של מדיה במשך לא יותר משמונה דקות. בעזרת זכוכית או פיפטה פוליאתילן, מעבירים את התולעים לשקופית מיקרוסקופ של 25 מילימטר על 75 מילימטרים מצופה 001%poly-L-lysine.הסר את המדיה העודפת כך שכ- 15 מיקרוליטרים של מדיה יישארו בשקופית. הסרת מאגר עודף היא קריטית כדי להבטיח כי תולעים ו gonads

in-situ-detection-ribonucleoprotein-complex-assembly-c-elegans

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה...

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

סרטון זה מתאר את בדיקת קשירת הקרבה כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן בתאי נמטודה. הקרבה של החלבונים המעניינים יוצרת את תבנית הדנ"א המעגלית בעזרת גשושית PLA המחוברת לנוגדן משני. הגשושית מוגברת עוד יותר באמצעות תמיסת ההגברה, המייצרת DNA חד גדילי ארוך ואחריו הכלאה של הגשושית הגלאי, המאפשרת לוקליזציה של אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים.

בדיקת קשירת קרבה ללימוד אינטראקציות חלבון-חלבון באתרו

סרטון זה מדגים את ההדמיה של אינטראקציות חלבון-חלבון בצומת העצבי-שרירי Drosophila (NMJ) באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA). לאחר בידוד דפנות הגוף, חלבונים המקיימים אינטראקציה נבדקים עם נוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים מצומדים PLA. הקרבה של החלבונים האינטראקטיביים מקלה על קשירת בדיקות עם אוליגונוקלאוטידים מחברים, ויוצרים DNA מעגלי, אשר מוגבר לאחר מכן על ידי הגברת מעגל מתגלגל. בדיקות פלואורסצנטיות נקשרות ל-DNA המוגבר, ומאפשרות הדמיה של אינטראקציות חלבון-חלבון ב-NMJ.

איתור אינטראקציות חלבון-חלבון בזחלי דרוזופילה באמצעות בדיקת קשירת קרבה

פרוטוקול זה מדגים כיצד סמיכות קשירת Assay יכול לשמש כדי לזהות באינטראקציות חלבון-חלבון אתרו בצומת העצבית-שרירית זחל תסיסנית. בעזרת טכניקה זו, שאו טאי גדול והו-לי דיסקים מוצגים בצורה מורכבת באזור postsynaptic, עמותה זוהתה בעבר באמצעות שיתוף immunoprecipitation.

זיהוי של באתר מכלולי חלבון-חלבון ב דרוזופילה הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

אנו מדווחים על הליך תמציתי של הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) בבלוטת המין ובעוברים של Caenorhabditis elegans לצורך התבוננות וכימות רצפים חוזרים. צפינו וכימתנו בהצלחה שני רצפים חוזרים שונים, חזרות טלומרים ותבנית של התארכות חלופית של טלומרים (TALT).

תצפית כימות הטלומרים ו רצפים חוזרים קרינה באמצעות<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) עם PNA בדיקות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ערוץ אניון תלוי מתח / cyclophilin D מורכבים על ממשק הקרום קשור המיטוכונדריה.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

אנו מציגים שיטת immunofluorescence מבוסס הדמיה ללוקליזציה במרחב ובזמן של ERK הפעיל הגזור ג בלוטת מין elegans. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים להדמיה של כל איתות או חלבון מבני ג elegans בלוטת המין, סיפק מגיב נוגדן מתאים זמין.

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

כאן, אנו מראים כיצד להשתמש Assay מצדו קרבה (PLA) כדי להמחיש את MST1/MST2 heterodimerization בתאים קבוע עם רגישות גבוהה.

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

הצורך בגישות חדשות לחקר אתרי מגע עם ממברנות (MCS) גדל עקב העניין הגובר בחקר מבנים תאיים אלה ומרכיביהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיות מיקרוסקופיה שהיו זמינות בעבר כדי לזהות ולכמת קומפלקסים של חלבונים תוך-אברונים ובין אברונים השוכנים ב-MCS.

ויזואליזציה וכימות של אינטראקציות חלבון תוך-אברוני אנדוגניות באתרי קשר של ER-מיטוכונדריה על ידי מבחני קשירת קרבה

למד לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון בזרע של C. elegans באמצעות שיטת הסמיכות. טכניקה זו חושפת תבניות מרחביות וזמניות ומספקת רגישות השווה לשיטות FRET ו-BiFC ללא מורכבותן.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

גלה סרטונים נוספים