Name: בליסטי לתיוג של הנוירונים בתוך המוח בפרוסות ובתרבות התא הראשוני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: חקור שיטת תיוג בליסטי לנוירונים פירמידליים וזיזים דנדריטיים במוח עכברושים. הפרוטוקול משלב תוכנת שחזור מתקדמת לניתוח מורפולוגי מדויק של מבנה התאים ותפקודם העצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו ממומנת על ידי NIH מענקים HD043680, MH106392, DA013137, ו NS100624.

כל הפרוטוקולים בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת דרום קרוליינה (מספר הביטחון הפדרלי: D16-00028).
1. הכנת אבובים דיאני/טונגסטן חרוז
<ol><li>לפזר 100 מ"ג של polyvinylפירוסיים (PVP) עם 10 מ ל של ddH2O. מערבולת פתרון PVP בקלילות.</li>
	<li>ממלאים את אבובים עם פתרון PVP (ראה טבלת חומרים) ולהשאיר אותו 20 דקות. לאחר מכן, לגרש את פתרון PVP דרך הקצה השני של אבובים באמצעות מזרק 10 mL.</li>
	<li>שילוב 170 מ"ג של חרוזים מיקרומוביל טונגסטן עם 250 μL של מתילן כלוריד. וורטקס ההשעיה של טונגסטן חרוז ביסודיות.</li>
	<li>לשלב 6 מ ג של ליפופילית DilC18 (3) לצבוע עם 300 μL של מתילן כלוריד. מערבולת the DilC18 (3) הפתרון לצבוע ביסודיות. הערה: בצע את שלבים 1.3 – 1.4 בתוך מכסה.</li>
	<li>פיפטה 250 μL של ההשעיה של טונגסטן חרוז על שקופית זכוכית. לחכות ההשעיה לאוויר יבש (~ 3 דקות).</li>
	<li>הוסף 300 μL של DilC18 (3) לצבוע פתרון על גבי שכבת ההשעיה של חרוז טונגסטן. מערבבים את DiIC18 (3) לצבוע את הפתרון ואת חרוז טונגסטן ההשעיה ביסודיות עם טיפ פיפטה ולאפשר את התערובת לאוויר יבש (~ 3 דקות).</li>
	<li>לאחר ייבוש, להשתמש להב גילוח כדי לפצל את התערובת לשני צינורות צנטריפוגה 1.5 mL. ממלאים את הצינורות במים.</li>
	<li>Sonicate באמבט מים (Amp I, 100%) עד הומוגנית (~ 5 דקות). ודא כי קצה הsonicator שוכנת ישירות על הצינורות עם ההשעיה חרוז.</li>
	<li>לשלב את שני 1.5 mL של תערובת הומוגניים לתוך צינור 15 מ"ל. Sonicate התערובת לעוד 3 דקות.</li>
	<li>לצייר את חרוזי טונגסטן-DilC18 (3) לצבוע את התערובת לתוך הצינורות PVP מצופה באמצעות מזרק 10 mL. האכילו את האבובים בתחנת ההכנה (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>סובב למשך 1 דקות בתחנת ההכנה. הסר בזהירות את כל המים מן האבובים באמצעות מזרק 10 מ"ל.</li>
	<li>הפעל את הגז חנקן ולהתאים את זרימת החנקן ל כ 0.5 ליטר לדקה (LPM), לסובב את אבובים בתחנת ההכנה, ויבש עם חנקן עבור 30 דקות.</li>
	<li>הסר את אבובים מתחנת ההכנה וחותכים לאורך 13 מ"מ (התאמת גודל הטעינה של המחסנית) באמצעות חותך אבובים. שמרו על אורך 13 מ"מ בתוך החושך בבקבוקונים.</li>
</ol>2. הכנת חתכי מוח
הערה: למבוגרים גברים F344/N חולדות היו זוג שוכנו בסביבה מבוקרת תחת האור 12/12: מחזור כהה עם גישה מודעת המודעה למזון ומים. כל בעלי החיים טיפלו בהנחיות שנקבעו על ידי המכון הלאומי לבריאות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
<ol><li>עכברים מאוד מורדם. משתמשים ב -5% בלבד</li>
	<li>המשך לשלב הבא כאשר החולדות לא מגיבים רעילים גירויים ורפלקסים נעדרים.</li>
	<li>אבטחו את החולדה בתנוחה. בתוך מכסה המנוע הכימי</li>
	<li>לעשות חתך דרך העור לאורך קו האמצע של החזה. הפרידו את הסרעפת ופתחו את החזה במספריים. הכנס מחט של 20 גרם 25 מ"מ לחדר השמאלי.</li>
	<li>חותכים מיד את האטריום הימני עם מספריים. מבשם 50 mL של 100 mM PBS עם 5 מ ל/מינימום של קצב זרימה. מבשם 100 mL של 4% פאראפורמלדהיד באגירה ב 100 mM PBS.</li>
	<li>להסיר את כל מוח החולדה מיד לאחר הפרזיה.</li>
	<li>Postfix את כל המוח במשך 10 דקות עם 4% פאראמפורמלדהיד. הערה: אל postfix 4% פאראפורמלדהיד עבור יותר מ 30 דקות, כי זה ישפיע על תיוג.</li>
	<li>גזור 500 יקרומטר סעיפים ילתית עבה באמצעות מטריצה המוח חולדה (ראה טבלת חומרים). תעשה את החיתוך הראשון. ותשאיר את הלהב במקומו לעשות לחתוך השני באמצעות להב השני ולהסיר אנכית את הלהב הראשון, שמירה על הרקמה על פני הלהב.</li>
	<li>מניחים את פרוסות המוח בצלחת 24 שעות עם 1 מ מ של 100 mM PBS בכל טוב. חזור על תהליך זה עד לגזירה של כל הפרוסות.</li>
</ol>3. תיוג והדמיה בליסטיים של סעיפים במוח
<ol><li>הסר את הערוץ הPBS מכל. מטרה ממוקדת</li>
	<li>לטעון את מחסנית עם פיסת DiI/בחרוזים טונגסטן חרוז ולמקם אותו לתוך המוליך.</li>
	<li>שימו פיסת נייר סינון בין שני מסכי רשת שינוי. . חברו את המוליך לצינור ההליום להתאים את הלחץ הפלט של הליום כדי 90 לירות לאינץ ' מרובע (psi).</li>
	<li>מניחים את המוליך אנכית ביד על מרכז הבאר המיועד במרחק של 1.5 ס מ בין המדגם לבין מסך רשת השינוי. אש צינורות DiI/טונגסטן. הערה: הקפידו להסיר את כל ה-PBS מבארות היעד לפני הירי.</li>
	<li>טען את מחסנית עם אבובים DiI/טונגסטן הבא. ברציפות לירות את החרוזים DiI/טונגסטן מן אבובים על הפרוסות הנותרות.</li>
	<li>למלא את הצלחת 24 עם 100 מ"מ של PBS. לשטוף עם 500 μL של טריים 100 mM של PBS 3x. אל תתנו הפרוסות להתהפך בזמן הכביסה עם PBS.</li>
	<li>הוסף 500 μL של טרי 100 mM PBS ולשמור את הפרוסות ב 4 ° c בחושך במשך 3 h.</li>
	<li>העבר את פרוסות המוח לתוך שקופיות זכוכית באמצעות מברשת עדינה. הערה: ניתן להעביר שלושה מקטעי מוח על כל מגלשת זכוכית.</li>
	<li>הוסף מיד 1 מ ל של מדיום הרכבה אנטי לדעוך על כל מקטע. מניחים החלקה 22 מ"מ x 50 מ"מ שמיכות על מקטעי המוח. מייבשים את מגלשות הזכוכית בחשכה במשך יומיים.</li>
	<li>הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונקטיבית ועבור למטרה 60 ×.</li>
	<li>הגדר את מערכת המיקרוסקופ קונפוקלית וקד כדי להיות הגדלה של 60 × (a/1.4, שמן) ו-Z מטוס מרווח של 0.15 יקרומטר (גודל חריר 30 יקרומטר, חזרה מוקרן ברדיוס חריר 167 nm). השתמש באורך הגל 543 ננומטר כדי להשיג תמונות של נוירונים בעלי עניין.</li>
	<li>להשיג Z-מחסנית תמונות עבור הסוג המיועד תא העצב מבוסס על גבולות אזור המוח מאפיינים מורפולוגיים של נוירונים. הערה: לרכוש לפחות שלוש תמונות המבצע כל חיה.</li>
</ol>4. שימוש במתודולוגיה עם תרבית תאים
<ol><li>לבודד נוירונים בקליפת הבית העיקרי מ F344/N חולדות ביום לפני הלידה אחד באמצעות מתודולוגיה שדווחה בעבר14.</li>
	<li>תרבות בקליפת העצב הראשי בצלחת 35 מ"מ זכוכית בתחתית לשבוע אחד. לשנות את מחצית מדיום התרבות עם מדיום צמיחה תא העצב החדש ביום שלישי לאחר בידוד. לשטוף את הזכוכית התחתונה צלחת 2x עם 1 מ מ של 100 mM PBS.</li>
	<li>תקן עם 4% פאראפורמלדהיד עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלבים 3.2 – 3.6 כדי לתייג את התאים באופן הוליסטי.</li>
	<li>לשטוף עם 1 מ ל של 100 mM PBS 3x. הוסף 500 μL של טרי 100 mM של PBS ולשמור אותו ב 4 ° c בחושך במשך 3 h.</li>
	<li>הוסף 200 μL של מדיום הרכבה antifade.</li>
	<li>להשיג תמונות Z-מחסנית עבור כל תא מטרה ממוקד באמצעות הפרמטרים בשלב 3.10.</li>
</ol>5. ניתוח עצבי וכימות עמוד השדרה הדנדריטי
<ol><li>נוירונים עיוורים באמצעות מספרי קוד כדי למנוע הטיית ניסויים.</li>
	<li>הקמת קריטריוני בחירה לנוירונים בהתבסס על אזור המוח של עניין. הערה: קריטריוני הבחירה של הנוירונים כוללים כתמים דנדריטי רציף, רקע נמוך, אין אשכולות צבע בתוך התאים, דיפוזיה מינימלית של הצבע DiI לתוך החלל החילוץ, המבנה הנכון של הנוירונים באמצע (איור 1).</li>
	<li>פתח תוכנת שחזור עצבית (ראה את הסרטוןהמצורף 1).</li>
	<li>טען קובץ תמונה על-ידי לחיצה על התמונה "תיקיית קבצים" בפינה השמאלית העליונה.</li>
	<li>לחץ "סומה" ולסמן את הסומה של הנוירונים על התמונה.</li>
	<li>לחץ על "עץ" ובחר "מונחה משתמש".</li>
	<li>עקוב אחר כל הענפים הדנדריטים של עניין. הערה: בשביל הנוירונים האלה, אשר מאופיינים על ידי אחד הדנדריטים הרשמי ומספר הדנדריטים בזיאר, רק הדנדריטים הרשמי מאותר. ודא שכל הענפים המחוברים מחוברים זה לזה.</li>
	<li>לחץ על "עמודהשדרה".</li>
	<li>הגדרת פרמטרי זיהוי ולחץ על "זיהוי הכל". הערה: עבור פרוסות מוח, הפרמטרים העקביים מנוצלים לרוחב אזורי המוח הם: 2.0 (טווח חיצוני), 0.3 (גובה מינימלי), 100% (רגישות לגלאי) ו-10 (מינימום הספירה). עבור תרבות התא, יש צורך להגדיל את רגישות הגלאי ולהקטין את הספירה המינימלית.</li>
	<li>סווג את הקוצים על ידי בחירת "סיווג הכל". הערה: השדרה הדנדריטית מסווגת באמצעות אלגוריתם אינטגרלי לתוכנת השחזור העצבית15.</li>
	<li>שמור מעקב על-ידי בחירת תמונת הדיסק בפינה השמאלית העליונה.</li>
	<li>לבצע ניתוחים עצביים והדנדריטים שדרה מורפולוגית.<ol>
<li>פתח תוכנה לניתוח כמותי שחזור עצבי (ראה וידאומצורף 2).</li>
		<li>טען תמונה על ידי לחיצה על "קובץ" ו-"פתיחת קובץ נתונים".</li>
		<li>לחץ על "ניתוח" ו-"ניתוח מבנה מסועף" כדי לנתח מורפולוגיה עצבית ומורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי.</li>
		<li>עבור מורפולוגיה עצבית, לחץ על "סכומי עץ" ובחר את התיבה עבור "כוללות דנדט".</li>
		<li>למבנה השדרה הדנדריטי, לחץעל "שדרה"ולאחר מכן בחר את התיבה עבור "פרטי עמוד השדרה".</li>
		<li>שמור פלט כקובץ טקסט (. txt) על-ידי לחיצה ימנית על טבלת הפלט ובחירה באפשרות "שמור לקובץ".</li>
		<li>לחץ על "לנתח" ו-"ניתוח שולבה".</li>
		<li>הגדר את הרדיוס ההתחלתי ל-10 יקרומטר ואת התוספת הקבועה ל-10 יקרומטר.</li>
		<li>לחץ על התיבה "דנדריטים" ולחץ על "הצג".</li>
		<li>שמור פלט כקובץ טקסט (. txt) על-ידי לחיצה ימנית על טבלת הפלט ובחירה באפשרות "שמור לקובץ".</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>לנתח את המבנה העצבי (כלומר, מורכבות הסתעפות הדנדריטים) נתונים.<ol>
<li>הוסף את מספר הדנדריטים בכל הזמנה בסניף וחלק במספר הכולל של הדנדריטים. הכפל ב-100 כדי לחשב את התדרים היחסיים עבור מספר הדנדריטים בכל הזמנה בענף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח נתוני האנליזה של השולל כדי לבחון את המורכבות העצבית והקישוריות לעמוד השדרה הדנדריטי.<ol>
<li>חישוב ממוצע השגיאה והתקן של הממוצע עבור מספר הצמתים בכל רדיוס.</li>
		<li>סכם את מספר שדרה התלוי בסוג עמוד השדרה (כלומר, דק, שבור, גדול) בכל רדיוס וחילוק לפי המספר הכולל של שדרה לסוג זה של עמוד השדרה. הכפל ב-100 כדי לחשב את התדרים היחסיים עבור מספר השדרה בכל רדיוס.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+%22DiOlistic%22+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li>
<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocol%22%5BJournal%5D)">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202(2009).</li>
<li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li>
<li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+Golgi+method%3A+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons%3A+dendritic+structure+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li>
<li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li>
<li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon%2C+dendrites+and+spines%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li>
<li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+number%2C+location%2C+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li>
<li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations%2C+spinules%2C+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li>
<li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+dendritic+spine+detection%3A+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li>
<li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens%3A+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavior+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285(2018).</li>
<li>Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+female+rat%3A+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Filamentous+Actin+%28F-actin%29+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697(2016).</li>
<li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371(2008).</li>
</ol>

לאף אחד מהמחברים אין ניגודי אינטרסים להכריז.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקת תיוג רב-תכליתי עבור נוירונים ממוח החולדה ואלה שגדלו בתוך מבחנה. יתרה מזאת, אנו מדווחים על המתודולוגיה לניצול תוכנת שחזור עצבית ושחזור עצבי כמותי להערכת המבנה העצבי והשדרה הדנדלית. הערכה של מורפולוגיה עצבית ושדרה דנדריטי מספק הזדמנות לקבוע שינויים במורכבות הסתעפות הדנדריטים, המורכבות העצבית, המבנה של השדרה הדנדריטי, וקישוריות סינפטית.
בעת ניהול הפרוטוקול, החוקרים צריכים להקדיש תשומת לב מיוחדת לכמה צעדים. ראשית, לאחר התיקון ב 4% בליגה במשך זמן רב מדי יפגע בשלמות ק...

בשנת 2000, גן ואח ' תיאר טכניקת תיוג מהירה לנוירונים בודדים ולגליה במערכת העצבים שבשילוב צבעי ליפוליים שונים, ומאפשר תיוג סימולטני של תאי מוח רבים בצבעים שונים1,2. לאחרונה, טכניקת תיוג בליסטי תוארה על ידי סיאולד ואח '3 שהוצגו צבעי פלורסנט (דיל) לתוך הנוירונים של פרוסות המוח. טכניקה מכתימה רב-תכליתי, תיוג בליסטי הוא מוערך על יכולתה להיות מנוצל במינים רבים בעלי חיים ולאורך מגוון רחב של גילאים. יתר על כן, זה יכול להיות משולב עם כתמים חיסוני לזהות אוכלוסיות משנה של תאי המוח3. לעומת טכניקות מסורתיות (למשל, Golgi-קוקס כסף הספגה, microinjection)4, תיוג בליסטי מעניקה הזדמנות להבדיל באופן ברור יותר מאפיינים מורפולוגיים, כולל השדרה הדנדריטי, תכונה קריטית לציור מסקנות על מורכבות עצבית וקישוריות סינפטית5.
מרגש הנוירונים מתאפיין באחד, דנדריטים הרשמי הגדול, מספר דנדטים בסיס קצר, ואלפי שובך הדנדריטים6. הנוירונים האלה מצויים באזורי המוח המרובים הקשורים לעיבוד קוגניטיבי גבוה יותר, כולל קליפת ראש הדור הקדמי (טוראי ראשון) ו ההיפוקמפוס. בטוראי הראשון, הנוירונים באמצע המבנה מתבוננים בשכבות II/III ושכבה V, כאשר כל אחד מהם מציג מורפולוגיה ייחודית. במיוחד, הנוירונים באמצע שכבה II/III של הטוראי הראשון יש הדנדריטים פסגה קצר יותר ופחות הסתעפות מאשר הנוירונים באמצע השכבה V6. בתוך ההיפוקמפוס, הנוירונים באמצע הפירמידה ממוקמים הן באזורים CA1 ו CA3, עם כל הצגת מורפולוגיות נפרדות. באופן ספציפי, הנוירונים באזור CA1 מוצג הדנדריטים הרשמי הייחודי יותר, עם הסתעפות המתרחשים רחוק יותר הסומה, ביחס לאזור CA36.
הדנדריטים הדנדריטי על הנוירונים באמצע הפירמידה הן הראשון ההיפוקמפוס הם האתר העיקרי של סינפסות מרגש7. מאפיינים מורפולוגיים של שתדלתיים דנדריטים, אשר מאופיינים באופן קלאסי לתוך שלוש קטגוריות ראשיות (כלומר, דק, קלוש, או פטריות8), היו קשורים בגודל של הרגש סינפסה9. השדרה הדק, המאופיינת בצוואר ארוך, דק, ראש בולבוסי קטן, וצפיפות הפוסט-סינפטית הקטנה יותר, אינם יציבים יותר ומפתחים התקשרויות חלשות יותר. עם זאת, שדרה פטריות, אשר יש ראש השדרה הדנדריטי גדול יותר, מוכרים ליצירת קשרים סינפטית חזקים יותר, אפקט כתוצאה מהגודל הגדול שלהם. בניגוד חד, שדרה שולי הוא נטול צוואר עמוד השדרה, המציגות יחס שווה ערך ראש וצוואר שווים8. בתוך ההיפוקמפוס, שדרה הסתעפות יכול להיות גם נצפתה, לפיה עמוד השדרה יש ראשים מרובים היוצאים מן הצוואר הדנדריטי זהה10. לכן, השינויים הורפולוגיים של הקוצים הדנדריטים יכולים לשקף פונקציונליות וקיבולת מבנית. יתר על כן, מחקרים הוכיחו כי הגודל והצורה של השדרה הדנדריטי מתייחס הפלסטיות הקונסטרוקטיבי שלהם, המוביל את הרעיון כי הקוצים הקטנים מעורבים בלמידה ובתשומת לב, בעוד שבעמודי השדרה הגדולים והיציבים יותר, מעורבים בתהליכים ארוכי טווח, כולל זיכרון11. בנוסף, הפצת הקוצים הדנדריטים לאורך הדנדריטים עשויה להיות קשורה לקישוריות סינפטית5,12.
לפיכך, הנייר המתודולוגי הנוכחי כולל שלוש מטרות: 1) הצגת הפרוטוקול שלנו עבור תיוג בליסטי, אשר כבר מנוצל עם שיעור הצלחה (כלומר, הנוירונים לפגוש קריטריונים הבחירה מתאים לניתוח) של 83.3%5,12,13 וברחבי מחוזות המוח מרובים (כלומר, טוראי ראשון, 2) להפגין את היכולת הגנריות של הטכניקה ואת יישומו לנוירונים שגדלו בתוך מבחנה; 3) פירוט המתודולוגיה הנמצאת בשימוש בתוכנת שחזור עצבית ומסקנות שניתן לשאוב מנתונים אלה.

<table><tbody><tr><td>20Gx25 מ"מ מחט PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 24 בארות</td><td>Costar</td><td>3562</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ כלים תחתונים מזכוכית</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>B-27 תוסף</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>תוחם חבית</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2417</td><td></td></tr><tr><td>בורקס</td><td>סיגמא</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>Sigma</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחסנית</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2426</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת הדמיה קונפוקלית</td><td>Nikon</td><td>EZ-C1</td><td>גרסה 3.81b</td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td>TE-2000E</td><td></td></tr><tr><td> זכוכית</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>DilC18(3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>F344 חולדה</td> <td>(מעבדות הרלן, אינדיאנפוליס, אינדיאנה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>מסכי דיפוזיה הליוס</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2475</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אקדח גן הליוס</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2411</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אקדח גנים של הליוס</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2431</td><td></td></tr><tr><td>מכלול צינור הליום</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2412</td><td></td></tr><tr><td>איריס מלקחיים</td><td>מכשירים מדויקים עולמיים</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>מספריים איריס</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>מתילן כלוריד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>D150-1</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים</td><td>בינוניות נוירובזאליות</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida 360 תוכנה</td><td>mbf bioscience</td><td></td><td>ניתוח עמוד שדרה דנדריטי</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>פוליוויניל פירולידון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>5295</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold מגיב נגד דהייה</td><td>Fisher</td><td>Scientific P36930</td> מטריצת מוח <td>חולדה בינונית הרכבה</td></tr><tr><td>, 300 - 600 גרם, קורונלית, 0.5 מ"מ</td><td>טד פלה</td><td>15047</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt אספקה וטרינרית</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%</td><td></td></tr> <tr><td>ערכת</td> <td>מזרקBIO-RAD</td><td>165-2421</td><td></td></tr><tr><td>צינורות טפזל</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>חותך צינורות</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>תחנת הכנת צינורות</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2418</td><td></td></tr><tr><td>טונגסטן M-25 Microcarrier 1.7 ומיקרו; m</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2269</td><td></td></tr><tr><td>Vannas מספריים</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

בליסטי לתיוג של הנוירונים בתוך המוח בפרוסות ובתרבות התא הראשוני

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

דווח כי גודל וצורה של השדרה הדנדריטים קשורה הפלסטיות הקונסטרוקטיבי שלהם. כדי לזהות את המבנה המיורפולוגי של הנוירונים ושידולי הדנדריטים, ניתן לעשות שימוש בטכניקת תיוג בליסטיים. בפרוטוקול הנוכחי, הנוירונים העצביים מתויגים עם DilC18 (3) לצבוע וניתח באמצעות תוכנת שחזור עצבי להעריך מורפולוגיה עצבית ושפה דנדריטי. כדי לחקור את המבנה העצבי, ניתוח הסתעפות הדנדריטים וניתוח שולבה מבוצעים, ומאפשר לחוקרים לצייר מסקנות על מורכבות הסתעפות הדנדריטים והמורכבות העצבית העצביים, בהתאמה. הערכה של השדרה הדנדריטי מתבצעת באמצעות הסיווג האוטומטי באמצעות אלגוריתם מיון אינטגרלי לתוכנה שחזור, אשר מסווג את הקוצים לתוך ארבע קטגוריות (כלומר, דק, פטריות, שמנה, שמנת, פילפיאה). יתר על כן, שלושה פרמטרים נוספים (כלומר, אורך, ראש קוטר, ונפח) נבחרים גם להעריך שינויים במבנה השדרה הדנדריטי. כדי לאמת את הפוטנציאל של היישום הרחב של טכניקת תיוג בליסטי, הנוירונים בצורה מרחבית מתוך תרבות תא מבחנה בהצלחה מתויג. בסך הכל, שיטת התיוג הבליסטי היא ייחודית ושימושית להמחיש נוירונים באזורי מוח שונים בחולדות, אשר בשילוב עם תוכנת שחזור מתוחכמת, מאפשר לחוקרים להבהיר את המנגנונים האפשריים המשמשים כבסיס תפקוד נוירוקוגניטיבי.

באיור 2A, את הנוירונים טיפוסי הפירמידה באזור ההיפוקמאל בסעיפים המוח חולדה זוהו על ידי הטכנולוגיה תיוג בליסטי, המאופיינת על ידי אחד גדול הדנדריטים הדנדריטים ומספר דנדטים בסיס קטן יותר סביב סומה. איור 2B מראה את העצב בתוך התוכנה ניתוח כמותי שחזור נוירואליות לאחר התגלתה הסומה, הענפים הדנדריטים היו מעוקבים, ושלוחות השדרה זוהו. לאחר מכן, הנתונים נותחו באמצעות תוכנה לניתוח כמותי שחזור עצבי, אשר סיפקה הזדמנות להעריך את מורכבות הסתעפות הדנדריטים (אי...

אנו מציגים פרוטוקול כדי לתייג ולנתח נוירונים באמצע, אשר קריטי להערכת שינויים מורפולוגיים פוטנציאליים בנוירונים ובקוצים הדנדריטים שעלולים להיות מומים נוירוכימיקלים והתנהגותיים.

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

פרוטוקול זה מאפשר להעריך שינויים מורפולוגיים פוטנציאליים בנוירונים ובעמודי שדרה דנדריטיים שעשויים לה מדגישים חריגות נוירוכימיות והתנהגותיות. זה ייחודי ושימושי עבור לדמיין נוירונים באזורים שונים במוח בחולדות, אשר בשילוב עם תוכנת שחזור מתוחכמת מאפשר לחוקרים להבהיר את המנגנונים האפשריים שבבסיס תפקוד נוירוקוגניטיבי. התחילו בהכנת פתרון PVP בהתאם לכיווני כתב היד.מלאו את הצינור ב-PVP והשאירו אותו למשך 20 דקות. ולגרש אותו דרך הקצה השני עם מזרק 10 מיליליטר. שלבו 170 מיליגרם של גם גם 250 מיקרוליטרים של מתילן כלוריד.ואז ביסודיות מערבולת ההשעיה. לאחר מכן, מוסיפים 6 מיליגרם של צבע DilC18(3) ליפופילי ל-300 מיקרוליטרים של מתילן כלוריד ומערבולת. Pipet 250 מיקרוליטרים של מתלי חרוז טונגסטן על מגלשת זכוכית.המתינו עד שההשעיה תיייבש באוויר ותוסיפו 300 מיקרוליטרים של תותר הצבע. לאחר התייבשות, להשתמש סכין גילוח כדי לפצל את התערובת לשני צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולמלא את הצינורות במים. sonicate את התערובת באמבט מים עד הומוגני.מוודא כי קצה sonicator טמון ישירות על הצינורות. מערבבים את שתי תערובות בצינור חרוט 15 מיליליטר. ו sonicate במשך שלוש דקות נוספות, לוודא כי לא גושים גדולים של חרוזים מצופים צבע להישאר.לאחר sonication, לצייר את התערובת לתוך צינורות מצופה PVP עם מזרק 10 מיליליטר. ולהאכיל את הצינורות לתחנת ההכנה. סובב את הצינור למשך דקה אחת.בזהירות להסיר את כל המים באמצעות מזרק. מפעילים את גז החנקן ומתאימים את זרימת החנקן לכ-0.5 ליטר לדקה. לסובב את הצינור בתחנת ההכנה ולייבש אותו עם חנקן במשך 30 דקות.מוציאים את הצינור מהתחנה וחותכים אותו למקטעים של 13 מ"מ עם חותך צינורות. ודא כי החולדה אינה מגיבה לגירויים מזיקים ורפלקסים נעדרים. אז תאבטח את זה בתמקם ה"סופין".בצע חתך לאורך קו האמצע של בית החזה. מפרידים את הסרעפת ופתיחת החזה במספריים. ואז להכניס מחט 20 מד 25 מילימטר לתוך החדר השמאלי.מיד לחתוך את ה אטריום הנכון עם מספריים וללעוס 15 מיליליטר של 100 מילימטר PBS עם קצב זרימה של 5 מילימטרים לדקה. לאחר מכן לבלבל 100 מיליליטר של 4%PFA במאגר PBS. לאחר תדלוק, להסיר את המוח החולדה כולה.ולהדביק אותו עם 4%PFA במשך 10 דקות. השתמש במטריצת מוח עכברוש לחתוך 500 מיקרומטר עבה קטע coronal. לעשות חתך אגרוף ולשמור את הלהב במקום.לאחר מכן בצע חתך שני עם להב שני ולהסיר אנכית את הלהב הראשון, שמירה על הרקמה על פני הלהב. מניחים את פרוסות המוח בצלחת 24 באר עם 1 מיליליטר של PBS בכל באר. ולחזור על התהליך עד שכל הפרוסות נחתכו.הסר PBS מכל באר ממוקדת. טען את הסחוס עם חתיכת צינורות דיל / טונגסטן והכנס אותו למוליך. שים פיסת נייר סינון בין שני מסכי רשת שינוי.ולחבר את המוליך לצינור ההליום. ואז להתאים את לחץ הפלט של הליום ל 90 פאונד לאינץ 'מרובע. הנח את המוליך אנכית במרכז הבאר הממוקדת באורך 1.5 ס"מ בין המדגם למסך רשת שינוי.ואז לירות צינורות דיל / טונגסטן. לטעון את הסחוס עם הצינור הבא ברציפות לירות את חרוזים מן הצינורות על הפרוסות הנותרות. מלאו את צלחת ה-24 בארות ב-100 מילימולרים PBS.ולשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם 500 microliters של PBS טרי. ודא כי הפרוסות לא להתהפך במהלך לשטוף. בסיום, הוסיפו 500 מיקרוליטר של PBS טרי לפרוסות.ותגרה אותם במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר הדגירה, השתמש במברשת דקה כדי להעביר את פרוסות המוח לשקופיות זכוכית. ומיד להוסיף מיליליטר אחד של מדיום הרכבה antifade לכל קטע.מניחים כיסוי של 22 על 15 מילימטר מעל החלקים ומייבשים את השקופיות בחושך. הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקל ולעבור למטרה 60X. התאם את הגדרות ההדמיה בהתאם לכיווני כתב היד.ולקבל תמונות Z-stack עבור סוג נוירון ממוקד מבוסס על גבולות אזור המוח ומאפיינים מורפולוגיים של נוירונים. לבודד את הנוירון קליפת המוח העיקרי מחולדות F344/N ביום שלאחר הלידה אחד ולתרבת אותם בצלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר במשך שבוע אחד. מחצית מהמדיום מרענן ביום השלישי לאחר הבידוד.לשטוף את המנה פעמיים עם 1 מיליליטר של 100 מילימולר PBS. ולתקן את התאים עם 4% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. תייג את התאים בצורה בליסטית כפי שתואר קודם לכן.ולשטוף אותם שלוש פעמים נוספות עם 1 מיליליטר של PBS. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של PBS לתאים ו דגירה אותם במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד חיטוי.ולקבל תמונות מחסנית Z עבור כל נוירון ממוקד. נוירונים פירמידליים טיפוסיים באזור ההיפוקמפוס בחלקי המוח של החולדות זוהו עם טכנולוגיית תיוג בליסטי המאופיינת בדנדריט אפית אחד גדול וכמה דנדריטים בסיסיים קטנים יותר סביב סומה. תוכנת ניתוח כמותי שחזור עצבי שימשה להתחקות אחר ענפים דנדריטיים ולזהות קוצים.לאחר מכן, התוכנה שימשה להערכת מורכבות הסתעפות דנדריטית ומורכבות ארבור עצבית. שינויים מורפולוגיים בקוצים דנדריטיים הוערכו באמצעות אורך, נפח וקוטר ראש. ואז קוצים סווגו לקוצים דקים, דקים ופטריות.והתדירות היחסית של מספר הקוצים בין כל רדיוס נבדקה. יתר על כן, טכניקת התיוג הבליסטי אומתה על נוירון פירמידלי ראשוני בתרבות התאים. נוירונים פירמידליים זוהו בהתבסס על צורת המשולש של הומה ודנדריט אפי גדול.לאחר מכן נעשה שימוש בתוכנת שחזור עצבי כדי לנתח את התפלגותם של קוצים דנדריטיים דקים ואורך עמוד שדרה דנדריטי. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב להימנע גושים גדולים או אשכולות של חרוזים טונגסטן מצופה צבע בליסטי החל הכנה. גושים לא יאפשרו לנוירונים בודדים להיות מכובדים.בשילוב עם תוכנת שחזור עצבי שיטה זו מאפשרת לנו לבחון מורפולוגיה של עמוד השדרה העצבי והדנדריטי בנוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס. תוכנת שחזור עצבי להשתמש באלגוריתם להציע סיווג בסיוע אוטומטי של קוצים דנדריטיים. כימות של פרמטרים עצביים מרובים מציע הזדמנות להבין טוב יותר את המנגנון שבבסיס תפקוד קוגניטיבי עצבי.

ballistic-labeling-pyramidal-neurons-brain-slices-primary-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מדגימים את השימוש באקדח הגן להציג צבעי ניאון, כגון DiI, לתוך הנוירונים פרוסות המוח של מכרסמים פרימטים שאינם בני אדם בגילאים שונים. במקרה הספציפי הזה, אנו משתמשים בעכברים בוגרים (3-6 חודשים) וקופים cynomologus מבוגר (9-15 שנים). טכניקה זו, שתוארה לראשונה על ידי במעבדה של ד"ר ליכטמן...

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

זהו פרוטוקול להכין ולתחזק הכנה פרוסה neocortical בתרבות organotypic לצורך ביצוע הקלטות חשמל עצב פירמידליים.

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

סרטון זה מדגים את ההליך לצביעה של פרוסות מוח קבועות של חולדות המכילות אינטרנוירונים מלאים בביוציטין. הפרוטוקול כולל דגירה עם קומפלקס אבידין-ביוטין (ABC), צביעה עם HRP ומצע כרומוגני, שימור מבנים עם אוסמיום טטרוקסיד והטמעת הרקמה בשרף להדמיה.

תיוג של אינטרנוירונים מלאים בביוציטין בפרוסות היפוקמפוס של חולדות לצורך הדמיה

שיטה מתוארת לתיוג נוירונים עם צבעי ניאון בתחומי מייקר מראש תפקודיים של הניאוקורטקס. ראשית, דימות אופטי אות פנימית משמש להשגת מפה תפקודית. אז מיקרוסקופ שני פוטונים משמש לתווית ונוירונים תמונה בתוך תחום מייקרו של המפה.

תיוג ממוקד של תאי עצב בתחומים ספציפיים מייקר פונקציונליים של הניאוקורטקס ידי שילוב אותות פנימיים והדמית שני פוטונים

סחר קרום עצבי דינמי שולט זמינה פלזמה קרום חלבון ומשמעותי עצבית משפיע. נכון להיום, זה כבר מאתגר למדוד סחר endocytic עצבי בנוירונים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה מאוד, כמוני למדידת שינויים מהירים בביטוי חלבון פני השטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

מתוארת טכניקה לחקר תאי NG2 ואוליגודנדרוציטים באמצעות מערכת תרבית פרוסות של המוח הקדמי והמוח הקטן.  שיטה זו מאפשרת לבחון את הדינמיקה של התפשטות והתמיינות של תאים בתוך שושלת האוליגודנדרוציטים שבה ניתן לתפעל בקלות את הסביבה החוץ-תאית תוך שמירה על ציטו-ארכיטקטורת רקמות.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

פרוטוקול זה מציג שיטה ההתאוששות מורפולוגי של נוירונים תוקנו במהלך הקלטות אלקטרו באמצעות מילוי biocytin ו postprocessing immunohistochemical שלאחר מכן. אנו מראים כי חלקים עבים המלאה biocytin כי היו מוכתמות coverslipped ניתן restained עם ימים או חודשי נוגדן ראשוניים שניים לאחר מכן.

Immunostaining סעיפים Biocytin מלא ומעובד מרקרים הנוירוכימיים

הציגו כאן היא שיטת צינור רולר ששונה culturing, לסירוגין דימות ברזולוציה של המוח מכרסמים פרוסות בשבועות רבים עם שינוי מיקום מדויק על photoetched coverslips. הכדאיות עצביים, מורפולוגיה פרוסה מתוחזקים היטב. יישומים של השיטה במלואו סגור באמצעות וירוסים עבור ביטוי מסוים סוג התא הינם מסופקים.

רולר ששונתה שיטת צינור לדימות לסירוגין במדויק לשפות אחרות וחוזר על עצמו במהלך תרבות לטווח ארוך של פרוסות המוח בכל מערכת סגורה

אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות חריפות מההיפוקמפוס הגבי-ביניים של עכברים. אנו משווים הכנה רוחבית זו עם חתך קורנל במונחים של איכות הקלטות ושמירה על תכונות מורפולוגיות של נוירונים מוקלטים.

הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה וחזקה לחקר גדילת אקסון באתרו ודינמיקת חרוט גדילה. הוא מתאר כיצד להכין פרוסות מוח חריפות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ex vivo ומספק צינור ניתוח ידידותי למשתמש.

באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

חקור שיטת תיוג בליסטי לנוירונים פירמידליים וזיזים דנדריטיים במוח עכברושים. הפרוטוקול משלב תוכנת שחזור מתקדמת לניתוח מורפולוגי מדויק של מבנה התאים ותפקודם העצבי.

בליסטי לתיוג של הנוירונים בתוך המוח בפרוסות ובתרבות התא הראשוני

גלה סרטונים נוספים