מתוקננת הערכה היסטראורמטרית של אוסטיאוארתריטיס במודל עכבר כירורגי
6 במאי 2020
הפרוטוקול הנוכחי יוצר שיטה קפדנית ומתוכנות לכמת של שינויים מורפולוגיים המלווים אוסטיאוארתריטיס. יישום פרוטוקול זה יכול להיות בעל ערך בניטור התקדמות המחלה והערכת התערבויות טיפוליות אוסטיאוארתריטיס.
הפרוטוקול שלנו מטפל בצורך בלתי ניתן לשחזור בשיטה חזקה ובלתי ניתנת לשחזור לניתוח כמותי של שינויים במפרקים בפיתוח והתקדמות של דלקת מפרקים ניוונית. הטכניקה שלנו מתארת פרמטרים ספציפיים וניתנים לשחזור לניתוח כמותי של שינויים ברקמות מפרקים מרובות בדלקת מפרקים ניוונית. כמו טכניקה זו מאפשרת ניתוח כמותי של דלקת מפרקים ניוונית, זה יכול להיות מועסק כדי להשוות את ההשפעות של טיפולים ספציפיים על רקמות מפרקים מרובים על מנת להעריך את היעילות הטיפולית שלהם.
הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם גם על מודלים אחרים דלקת מפרקים ניוונית או אזורים של מחקר השלד והשרירים שבו כימות של סחוס ועצמות יש צורך. למרות שהמערכת פשוטה ואינטואיטיבית, עדיין יש צורך באימונים כדי לתרגל קבלת מדידות באופן חוזר ונשנה כדי להשיג רבייה. ונגדשפראבהו קארופגונדר, חוקר פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלנו, ידגים כעת את ההליך שלנו.
התחל בהפניית המיקרוסקופ, המצלמה, המחשב וצג מסך המגע. בחר את המטרה 4X ולחץ על סמל התוכנה כדי להפעיל את התוכנה. מקם את השקופית על שלב המיקרוסקופ ומרכז את המדגם בתוך חלון המדידה כדי להבטיח שרשתות המדידה מוגדרות להגדלה המתאימה כדי להתאים למטרה בכך שגם משטח המשטחים הטיביאלי וגם עצם המשנה התת-גולגולתית נכללים באזורי התמונה המעניינים.
לאחר מכן, תחת תפריט קובץ, בחר הגדרות קריאה. בחלון הגדרות, בחר את קובץ ההגדרות המתאים כדי למדוד את הפרמטרים. כדי למדוד את שטח הסחוס הכולל, בחר את הפונקציה TC TC טיב ולעקוב לאורך הקצה העליון של משטח הסחוס tibial שבו הסחוס פוגש את החלל המשותף ולאורך צומת כונדרו-osseous שבו סחוס הסתייד פוגש את עצם subchondral.
כדי למדוד את אזור הסחוס המסויד, בחר את הפונקציה Tib CC ועקוב אחר קו לאורך סימן הגאות והשפל, קו המתרחש באופן טבעי המפריד בין אזורי הסחוס המסוידים והבלתי מחושבים, ולאורך הצומת כונדרו- osseous שבו הסחוס הסתייד פוגש את עצם subchondral. כדי לקבוע את אזור הסחוס הלא מחושב, הפחת את אזור הסחוס הסתיידות מאזור הסחוס הכולל. כדי לקבוע את מספר chondrocyte, ליצור פונקציות ספירה נפרדות בתוך ההגדרות בתוכנת היסטומורפיטריה כדי להבחין את מטריצה לייצר מטריצה שאינם מייצרים chondrocytes.
לאחר מכן השתמש חרט לעשות נקודה קטנה על כל chondrocyte להביע את פנוטיפ שצוין כדי לקבוע את מספר מטריצה לייצר או לא לייצר chondrocytes. כדי למדוד את הפרמטר הכולל של משטח המחשוף הטיביאלי, עקוב אחר קו על פני השטח של הסחוס הטיביאלי כדי להגדיר בזהירות את פרפור בודדים. לאחר מכן צייר קו שני לאורך סימן הגאות כדי לשמש כבקרה פנימית עבור המישור של כל מקטע ולחלק את פרמטר פני השטח של הטיביאלי על ידי הפרמטר סימן הגאות כדי לחשב את מדד פרפור פני השטח של הטיביאלי.
כדי למדוד את אזור מרחב מח העצם המשני, בחר את הפונקציה אזור מח עצם. ואז לצייר קווים סביב הפרמטר של אזורים אלה כדי לקבוע את השטח הכולל של שטח מח העצם בתוך עצם subchondral tibial. כדי למדוד את האזור התת-כולנדראלי הכולל, בחר את הפונקציה Subchondral Bone והתאר את האזור שבין צומת כונדרו-אוסאוס בגבול העליון של לוח הצמיחה המשתרע באופן הצדדי לאזורי האוסטיאופיטים האחוריים והמאחררים.
לאחר מכן הפחת את אזור מרחב מח העצם התת-כולנדראלי מאזור התת-כולנדרל הכולל כדי לחשב את אזור העצם התת-כולדי. כדי למדוד את האזור osteophyte, בחר את הפונקציה אוסטאופיט לפני ולעקוב אחר osteophyte anterior של השוקה הפרוקסימלית. לאחר מכן בחרו אוסטאופיט אחורי ועקבו אחר האוסטיאופיט האחורי של השוקה הפרוקסימלית.
כדי למדוד את עובי סינוביאלי הירך הקדמי, לחץ על קדמיור עצם הירך סינוביום מניסקוס ולצייר קו אחד מנקודת הכניסה הפנימית של הסינוביום הקדמי על עצם הירך לקראת נקודת ההתקשרות שלה על המניסקוס שורה אחת מן הכניסה החיצונית של הסינוביום על עצם הירך לקראת ההחזקה שלה מניסקוס. לאחר מכן לחלק את האזור הסינוביאלי הכולל על ידי הפרמטר סינוביאלי כדי לחשב את עובי סינוביאלי. DMM המושרה דלקת מפרקים ניוונית תוצאות מוגברת דלקת מפרקים ניוונית מחקר האגודה הבינלאומית בהשוואה עכברים מזויפים.
מאופיין בבירור על ידי שחיקת פני השטח וסחוס לאיבוד. פרוטוקול היסטומורפיטריה זה יכול לשמש כדי לזהות מספר שינויים הקשורים דלקת מפרקים ניוונית כולל ירידה בסחוס הכולל אזורי סחוס לא מחושב. הפחתה במספר הכונדרוציטים הכולל וחשוב מכך, אובדן במספר המטריצה המייצרת כונדרוציטים.
שינויים במשטח המשטחים, המעידים על חומרת הסחף, נצפים גם הם, כולל עלייה כוללת במדד פרפור. דלקת מפרקים ניוונית כוללת גם עלייה באזור העצם subchondral וירידה באזור של שטח מח העצם בעכברי DMM המציין טרשת עצם subchondral. הן האזורים הקדמיים והן אזורי האוסטיאופיט האחוריים גדלו גם בעכברי DMM, מה שמרמז על שיפוץ עצם תת-כולדי מתמשך המשמש כמנגנון פיצוי לטיפול בשינויים בהעמסת מפרקים באתר הפציעה.
ניתוח היסטומורפי של הסינוביום מראה עלייה בעובי הסינוביאלי בעכברי DMM. תוצאה אופיינית של דלקת מפרקים ניוונית הקשורים דלקת סינוביאלית ואת דיפוזיה של ציטוקיני דלקתיים לתוך החלל המשותף. בנוסף, אין שונות בין משתמשים משמעותית בין הניתוח ההיסטומורפי של אזור הסחוס הלא מחושב בציון הבינלאומי של החברה הבינלאומית לחקר דלקת מפרקים ניוונית.
לאחר ניתוח היסטומורפי, ניתן להשתמש בשקופיות רציפות וכתמי שפעת חיסונית כדי לבחון שינויים בביטוי החלבון בין דגימות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מספק שיטה חסונה לכימות שינויים מורפולוגיים במפרקים הקשורים לדלקת מפרקים ניוונית (osteoarthritis). הוא תוכנן לצורך ניטור התקדמות המחלה והערכה יעילה של התערבויות טיפוליות.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- מחקר על אוסטאוארתריטיס
- ניתוח רקמת מפרקים
- הערכת יעילות טיפולית
רקע
- דגנרציה של המפרקים מאפיינת את מחלת האוסטאו ארטריטיס (Osteoarthritis).
- ניתוח כמותי של שינויים במפרקים הוא חיוני להבנת המחלה.
- ייתכן כי לשיטות קיימות חסרה הדירות.
- פרוטוקול זה שואף למלא פער זה באמצעות גישה סטנדרטית.
מטרת המחקר
- לבסס שיטה ניתנת לשחזור לכימות שינויים במפרקים.
- להקל על ניטור התקדמות דגנרציה של המפרקים (Osteoarthritis).
- להעריך את ההשפעות של התערבויות טיפוליות על רקמות המפרק.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח כמותי של רקמות מפרק מרובות.
- פרמטרים ספציפיים למדידת שינויים בסומסקר בקרטילגו ובעצם.
- מפגשי הדרכה להבטחת הדירות (reproducibility) במדידות.
- יישום במודלים שונים של אוסטאוארתריטיס.
תוצאות עיקריות
- הודגמה שיטה מהימנה להערכת שינויים במפרקים.
- אפשרה השוואה של השפעות הטיפול על רקמות המפרק.
- סיפקה מסגרת שניתן ליישמה במחקרי שלד ושריר אחרים.
- הראתה את חשיבות ההכשרה לצורך דיוק במדידה.
מסקנות
- פרוטוקול זה מהווה כלי בעל ערך למחקר של דלקת מפרקים שחיקתית (osteoarthritis).
- הוא תומך בהערכת יעילות טיפולית.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לתחומים אחרים של מחקר במערכת השלד והשרירים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה היסטומורפומטרית כמותית נותנת מענה לצורך הקריטי בהערכה אובייקטיבית וניתנת לשחזור של פתולוגיית אוסטאוארתריטיס במודלים פרה-קליניים. על ידי הפחתת הסובייקטיביות הטבועה במערכות דירוג חצי-כמותיות, גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה ובהערכת היעילות הטיפולית. היא תומכת בקבלת החלטות מבוססות נתונים לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) בשלבי הגילוי המוקדמים, על ידי מתן אפשרות לגילוי רגיש של שינויים מבניים עדינים בסחוס, בעצם ובסינוביום.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מדידה כמותית של דגנרציה של סחוס וremodeling של העצם הסובכונדרלית.
- ערך תפעולי: מספק פרמטרים הניתנים לשחזור להערכת מעורבות המטרה (target engagement) ברקמות מפרק מרובות.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי זיהוי שינויים מוקדמים במספרם של כונדרוציטים מייצרי מטריקס ובפיברילציה של פני השטח המפרקיים.
סקר ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תוצאים כמותיים וסטנדרטיים עבור שטח הסחוס, היחס בין סחוס מסייד לסחוס שאינו מסייד, והיווצרות אוסטאופיטים.
- ערך תפעולי: מקל על סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות פרוטוקולי שרטוט מוגדרים ובקרות פנימיות כגון ה-tide mark.
- יכולת הרחבה: מאפשר יישום חוצה-מודלים על מערכות אחרות של אוסטאוארתריטיס הדורשות כימות של סחוס ועצם.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין נקודות קצה מבניות לרלוונטיות למחלה על ידי תיעוד עליות בעובי הסינוביה וסקלרוזיס של העצם הסובקונדרלית.
- קידום מותאם לסיכון: תומכת בקבלת החלטות פרה-קליניות על ידי כימות שטח האוסטאופיט כסמן ביולוגי לשחזור פיצוי.
- תובנה מכניסטית: מאפשרת קורלציה בין שינויים היסטומורפומטריים לצביעת אימונופלואורסצנציה במורד הזרם לצורך ניתוח ביטוי חלבונים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מאישוש המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולות המובילות (lead optimization), על ידי אספקת תוצאים כמותיים ברמת הרקמה המגבים הערכות של יעילות טיפולית.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת היפותזות באמצעות מדידה של אובדן סחוס, שינויים בפנוטיפ של כונדרוציטים ודלקת סינוביאלית.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות מעקב סטנדרטי אחר גבולות הסחוס הטיביאלי, העצם הסוב-כונדראלית והאוסטאופיטים.
- אנליטיקה: מאפשר ניתוח השוואתי באמצעות מדדים נגזרים, כגון מדד פיברילציה של פני השטח המפרקיים של הטיביה וחישובים של עובי הסינוביה.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי כימות שינויים מבניים המנבאים ירידה תפקודית של המפרק.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה היסטומורפומטרית לשימוש חוזר, ישימה במגוון מודלים של מחלות של מערכת השלד והשרירים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי הפחתת השונות הבין-משתמשית במדידות של שטח הסחוס.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות תוכנה חצי-אוטומטית וקבצי הגדרות סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של תרכובות לא יעילות באמצעות נקודות קצה מבניות רגישות.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק מידע לתעדוף מותאם סיכון באמצעות שינויים כמותיים באוסטאופיטים ובעצם הסובכונדרלית.
שיקולי יישום
- דורש הכשרה בתוכנה להיסטומורפומטריה כדי להשיג שרטוט עקבי של גבולות הרקמה.
- תלוי בתשתית של מיקרוסקופ, מצלמה, מחשב ומסך מגע לצורך רכישת תמונות.
- מחייב סטנדרטיזציה של קבצי הגדרות בין משתמשים ומעבדות שונות כדי לאפשר השוואה בין מחקרים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפרמטרים על אזורי מפרק שונים או מודלים של אוסטאוארתריטיס.
- מוגבל בשל הצורך בשרטוט ידני למרות הסיוע של תוכנה חצי-אוטומטית.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:13
Histomorphometric Analysis Setup
1:59
Total, Calcified, and Uncalcified Cartilage Area Measurements
2:47
Chondrocyte Number and Phenotype Evaluation
3:17
Tibial Articular Surface Perimeter Measurement
3:47
Subchondral Bone and Marrow Space Area Measurement
4:30
Anterior and Posterior Osteophyte Area and Synovial Thickness Measurement
5:21
Results: Representative Histomorphometric Osteoarthritis (OA) Evaluation in Destabilization of the Medial Meniscus (DMM) and Sham Mice
7:06
Conclusion
