Name: אופטימיזציה של כליות אורגאיד ותרבות אורגנותית לvascularization, פיתוח מורחב והדמיה מיקרוסקופית משופרת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: למד פרוטוקול משופח לתרבות כליות עובריות ואורגאידים על ממברנת CAM של עוברי עוף. השיטה משפרת הישרדות, vascularization ומאפשרת הדמיה מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה לחקר התפתחות הכליה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת מבחינה פיננסית על ידי האקדמיה האקדמית של פינלנד (206038, 121647, 250900, 260056; מרכז המצוינות בהענקת 2012-2017 251314), מונאיזזזאקאז-פינית כליה וכליות, האגודה השוודית לתרבות בפינלנד, ויקטוריה, הקרן השבדית. נובו Nordisk, מערכת הסרטן (האגודה הסרטנית של פינלנד), תוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7/2007-2013; גרנט FP7-בריאות-F5-2012-חדשנות -1 EURenOmics 305608), ו H2020 מארי Sklodowska-קירי פעולות הדרכה חדשני רשת "RENALTRACT דרכי" פרויקט מזהה 642937. המחברים מודים לפאולה הייפוס, ג'ואנה קקולאטי-ליפיי והאננלסון היקמן לסיוע טכני.
מספרים 3, 4 ו-Movie 2 מודפס באישור מפיתוח.

טיפול בבעלי חיים ונהלים היו בהתאם לחקיקה הלאומית הפינית לשימוש בבעלי חיים מעבדתיים, האמנה האירופית להגנה על בעלי חוליות המשמשות למטרות נסיוניות ומדעיות אחרות (ETS 123), והוראת האיחוד האירופי 86/609/EEC.
1. ייצור מיני מאגרים לטיפוח הכליות העכבר מעובריים כליות אורגנואידים על מצלמת עוף והגדרת ניסויים xenotransplantation שתלת
<ol><li>השתמש מוסיף תרבות התא המיועדים 6 טוב או 12 צלחות היטב. הערה: בהתאם לניסוי המסוים, ניתן להשתמש במינימאגרים גדולים או קטנים. עדיף להשתמש במיני מאגרים קטנים עבור השתלה של שתלה עד שמונה כליות עובריים או כאשר מיני מאגרים יהיה להציב על אותו עובר עוף (g., ניסוי ובקרה דגימות על אותו מצלמת עוף).</li>
	<li>חותכים את הצדדים של התוספות באמצעות מרובה רוטרי עם להב מסור עגול או יד מסור ליצור טבעת 2 מ"מ פלסטיק גבוהה עם קרום חדיר המצורפת אליו.</li>
	<li>להבריק את הקצוות של מיני מאגרים אלה עם אזמל או סכין חדה.</li>
	<li>לחטא את המינימאגרים ב 70% אתנול לפחות 1 h.</li>
	<li>רוחצים את מיני המאגרים במים מזוקקים כפולים, ומאפשרים להם להתייבש בשכונה שכבתית.</li>
	<li>שטפו את מיני המאגרים ב-PBS ובמדיום התרבותי (מדיום גבוה/10% FBS/1% פניצילין-סטרפטומיצין).</li>
	<li>מניחים את המאגר בצלחת פטרי, על גבי טיפה (600 μL/400 μL) של מדיום התרבות עם הקרום פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>לסדר את הכליות vivo עובריים או כליות אורגנואידים באופן שווה על הקרום בעזרת פיפטה או צינור נימי זכוכית. להימנע מהשארת הרבה נוזל סביב הכליות.</li>
	<li>תנו לדגימות להתחבר לקרום עבור 2 – 24 שעות בחממה לתרבות התא ב 37 ° צ' ו 5% CO2. הערה: עד שמונה כליות העכבר העובריים 11.5 או אורגנואידים כליה ניתן לארגן על הכנס הקטן. התוספת גדול מומלץ אם חתיכות גדולות יותר של רקמה עובריים ישמש עבור xenotransplant שתלה או שילוב תא הידרוג'ל על אזור גדול יותר של מצלמת.</li>
	<li>לקחת שמונה ימים-לשעבר העופות העובריים מתורבת הוכנו על פי שיטות שפורסמו בעבר מתוך חממה תרבות התא12,13.</li>
	<li>להעביר את המינימאגרים כדי CAM כך את השתלים פונים מצלמת, ואת הקרום שכבות אותם. מניחים את המיני מאגרים בפריפריה של CAM, כך שהם לא מכסים את העובר עוף. הערה: כאשר משתמשים מיני מאגרים קטנים מפוברק מוסיף transwell עבור 12 לוחות היטב, עד שלושה minireservoirs ניתן להציב על מצלמת אחד.</li>
	<li>הוסף 500 μL (6 הכנס היטב) או 300 μL (12 הוספה טובה) של התרבות הבינונית למינימאגרים.</li>
	<li>לטפח דגימות על עוף CAM עבור מקסימום של 9 ימים. החלף את מדיום התרבות במינימאגרים מדי יום. הערה: Vascularization של הדגימות ניתן לצפות ברגע 24 – 48 h לאחר ההשתלה.</li>
</ol>2. ייצור צלחות מותאמות אישית והגדרת תרבויות FiZD
<ol><li>מקדחה 20 מילימטר חורים בקוטר בחלק התחתון של 6 צלחת הבאר. הערה: עבור ניסויים FiZD, השתמש 6 צלחות טוב עם עומק 16 מ"מ היטב (מצוין בטבלה של חומרים).</li>
	<li>להבריק את החישוקים של החורים (בעיקר בצד העליון) באמצעות מקדחה חשמלית עם סיבית מקדחה כיור, אזמל, או סכין חדה.</li>
	<li>לחטא את הצלחות ב-70% אתנול לפחות 1 h.</li>
	<li>רוחצים את הצלחות במים מזוקקים כפולים, ומאפשרים להם להתייבש בתנאים סטריליים.</li>
	<li>לשטוף ביסודיות 22 מ"מ x 22 מ"מ שמיכות זכוכית עם 70% אתנול או לנקות אותם על פי הפרוטוקול שפורסם על ידי זארזלה ואח '11.</li>
	<li>הדבק את הכיסויים בצד העליון של החורים ב 6 צלחות היטב באמצעות דבק רקמות לא רעיל. החלת דבק סביב החור ובעדינות למקם את coverslip כדי לכסות אותו. . תן לדבק להתייבש</li>
	<li>בדוק את לוחיות תחת stereomicroscope ולהסיר דבק מיובש עודף מפני השטח של הכיסויים במידת הצורך. הערה: בדוק כי אין דבק מעל coverslip כדי להבטיח אפילו דחיסה של דגימות.</li>
	<li>מערבבים פוליסטירן מוקצף (70 יקרומטר בגודל חלקיק) עם נפח שווה של הידרוג'ל. נפח של 50-100 μL לכל טוב הוא מספיק. הערה: שמרו על התערובת של הידרוג'ל ומחרוזות פוליסטירן על קרח.</li>
	<li>מניחים הוספת העברה מתחת למיקרוסקופ מבתר עם הקרום למעלה.</li>
	<li>לסדר את הדגימות (למשל, לשעבר vivo עובריים כליות או אורגאונואידים כליות) באופן שווה על הקרום.</li>
	<li>הוסיפו את ההידרוג'ל/פוליסטירן מוקצף לצד הדגימות בזהירות כדי למנוע נזק לרקמות שבירות.</li>
	<li>הפוך את התותב להוסיף כך את הקרום עם דגימות שנאספו עליו הוא פונה כלפי מטה.</li>
	<li>בעדינות למקם את ההכנסה לתוך באר של שונה 6 צלחת הבאר בעדינות ללחוץ אותו למטה כך דגימות נדחסים לרמת החרוזים. הערה: בצע את ההתקדמות של הדחיסה באמצעות מיקרוסקופ.</li>
	<li>לשמור על הוספת לחצה מעט לבאר עם יד אחת ולתקן אותו לצלחת על ידי ההיתוך פלסטיק עם ברזל הלחמה בשלוש נקודות בפריפריה של הכנס.</li>
	<li>כאשר ההכנסה מתוקנת לצלחת, להוסיף 2 מ ל של תרבות בינונית (DMEM/10% FBS/1% פניצילין-סטרפטומיצין) ולהמשיך להרכיב את שאר הבארות בצלחת באותו אופן.</li>
	<li>העבר את הצלחת המוגמר לחממה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך לדימות זמן.</li>
	<li>בצע הדמיה בזמן הדמייה של דגימות באמצעות הגדרות ניסוי מתאים. הערה: שינוי מדיום התרבות בבארות הצלחת במהלך ניסויים בזמן, אינו נדרש, אך ניתן לעשות זאת בקלות דרך החורים בצידי התותב.</li>
</ol>

<ol><li>Saxen, L., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+contact+and+cell+adhesion+during+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell contact and cell adhesion during tissue organization.</a> International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).</li>
<li>Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+%C3%BCber+die+tubulogenese+der+niere%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+F%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen über die tubulogenese der niere.</a> Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).</li>
<li>Saxen, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxen%2C+L+%22Organogenesis+of+the+Kidney.+1st+ed%22">Organogenesis of the Kidney. 1st ed</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 536 (7615), 238(2016).</li>
<li>Halt, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146%2B+cells+are+essential+for+kidney+vasculature+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">CD146+ cells are essential for kidney vasculature development.</a> Kidney International. 90, 311-324 (2016).</li>
<li>van den Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+Subcapsular+Transplantation+of+PSC-Derived+Kidney+Organoids+Induces+Neo-vasculogenesis+and+Significant+Glomerular+and+Tubular+Maturation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li>
<li>Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+vascularization+of+the+metanephric+kidney+grafted+on+the+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane.</a> Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).</li>
<li>Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+fusion+of+the+epithelial+and+endothelial+basement+membranes+in+interspecies+hybrid+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli.</a> Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).</li>
<li>Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+glomerular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The origin of the glomerular endothelium.</a> Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).</li>
<li>Short, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Quantification+of+Tissue+Dynamics+in+the+Developing+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney.</a> Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).</li>
<li>Saarela, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fixed+z-direction+%28FiZD%29+kidney+primordia+and+an+organoid+culture+system+for+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging.</a> Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).</li>
<li>Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+ex+ovo-cultivation+of+developing+chicken+embryos+for+human+stem+cell+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts.</a> Stem Cells International. 2013, 960958(2013).</li>
<li>Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+coordinates+directional+cell+migration+and+extension+of+the+M%C3%BCllerian+duct+essential+for+ontogenesis+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract.</a> Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).</li>
<li>Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie-1-directed+expression+of+Cre+recombinase+in+endothelial+cells+of+embryoid+bodies+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice.</a> Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

שני פרוטוקולים מפורטים מוצגים המחדד את שיטת התרבות הקלאסית כליות אורגנותמית, ולאפשר vascularization, התפתחות מורחבת, ו 4D אופטימלי (כלומר, 3D תמונה וזמן) הדמיה של כליות vivo עובריים ואורגנואידים. סעיף זה מדגיש את השלבים הקריטיים בשיטות ודן בפתרון בעיות.
ההבדל המשמעותי בין שיטות אחרות של מצלמת התרבות קאם לבין שיטת התרבות המשופרת של מצלמת העוף הוא השימוש במיני-מאגרים מותאמים אישית ב-שתלה הכליות העובריים ואורגנואידים כליות למצלמת הסרט. התחתון הקרום של הכנס שונה להוסיף לוחץ על דגימות נגד מצלמת עוף...

התרבות האורגנותית של הכליות העובריים הפכה למודל חשוב ללמוד נפרוגנזה לפני עשורים1,2,3. אורגנואידים כליות מייצגים מערכת מודל מתקדמת לחקר התפתחות של כליות בריאה וחולה4. עם זאת, החיסרון העיקרי בשתי השיטות הוא שהשיטה אינה משנה את התפקוד העיקרי של הכליה: סינון דם. הנליות והכליות מתפתחות בתרביות כליות ובתרבויות אורגנואיות, בדומה לשלב מוקדם בפיתוח vivo; עם זאת, הפקולי הנוצרת בתוך מבחנה, נשארות נמק העצם5. Vascularization לשעבר הכליות העובריים ואורגנואידים הכליה הפגינו בעבר ניסויים השתלת רק תחת בתנאים vivo. לדוגמה, השתלת תא גזע בעוצמה האנושית של כליות מתחת לקפסולה העכבר מאפשר פיתוח של הנליות בארגון האורגנואיד לשלב פונקציונלי6.
גישה ביניים בין גרידא בתרבויות מבחנה ובשיטות השתלת vivo הוא xenotransplantation שתלת כדי מצלמת עוברי העופות. Vascularization של כליה כליות העכבר השלם הוכח בעבר באמצעות מערכת זו7,8. עם זאת, זה הוכח גם כי הכליות כליות בכליה murine המושתלים היה נגזר מהמארח אנדותל, לא את השתל9. התבוננות זו הפחיתה באופן משמעותי את הפוטנציאל של מודלים של כליה עובריים (העופות-יונקים) של כלייה מתחלקים ללמוד פיתוח של הכליות כליות, כי התנאים הניסיוניים היו לא מתירני להישרדות של תאים שמקורם בתורמים.
המוצגים בחלק הראשון של פרוטוקול זה היא שיטה משופרת לטיפוח של כליות עובריים של העכבר על מצלמת ביצי עופות, שילוב של תנאים מיקרו סביבתיים של תרבות ארגונית ו-xenotransplantation שתלת. השיפור העיקרי השיטות הקודמות היא כי במקום למקם את הכליות מעובריים וכליות אורגנואידים ישירות על מצלמת הרשת, אזור ההשתלה מצופה במיני מאגרים חדיר מלאים במדיום התרבות כי לספק את הרקמה המושתלת עם חומרים מזינים ולהגן עליו מפני ייבוש. שיעור ההצלחה של הניסויים גדל באופן משמעותי והתנאים לפיתוח של ואסיקובלטורה המופק על ידי תורמים משפרים. היישום של שיטה זו לתרבויות xenotransplant שתלות תוצאות בפיתוח של בנייה של הפקלותתיל מורכב של תאים אנדוגאל אנדוסוגאל מכליות התורמים.
ניתוח מפורט של הסלולר מורפולגנזה הוא יישום נוסף חשוב של מודלים תרבות הכליה. שיטות שדווחו בעבר על רכישת תמונות בזמן הקפיצה של תרביות כליות מספיקות רק לניתוח של מורפולוגיה כוללת ומחקר של כליה עובריים, אך לא למעקב אחר תאים בודדים10. לאחרונה, הרומן קבוע Z-כיוון (fizd) שיטה שמטרתה ברזולוציה גבוהה קונפוקלית וקד 3d זמן הדמיה של מאורגנואידים כליות ותרבויות אורגאוטימית תוארה11. בשיטה זו, אורגנואידים והאיברים העובריים דחוסים בעדינות בין שמיכות זכוכית קרום חדיר של הכנס transwell בלוח מעוצב מותאם אישית עד עובי המדגם מגיע 70 μm, מתן תנאים אופטיים אופטימליים עבור הדמיה. בחלק השני של השיטות, פרוטוקול מפורט לייצור של צלחת מעוצב מותאם אישית והכיוונון של הניסויים FiZD עבור הדמיה לטווח ארוך של אורגנואיד מתואר.

<table><tbody><tr><td>מקדח כף מתכוונן</td><td>Bosch</td><td>2609255277</td><td>לקידוח חורים בקוטר 20 מ"מ</td></tr><tr><td>אוטומטי Egg Turner</td><td>OLBA B.V., הולנד</td><td>AT-42</td><td>לדגירה של ביצים לפני הגדרת ex ovo.</td></tr><tr><td>חממת תאים</td><td>Panasonic</td><td>13090543</td><td>טמפרטורה מוגדרת על 37&deg; C, 90% לחות, 5% CO2</td></tr><tr><td>Cell אינקובטור</td><td>SANYO</td><td>10070347</td><td>חממת תרבית CAM עוף. טמפרטורה מוגדרת על 37&deg; C, 90% לחות, 5% CO2</td></tr><tr><td>Cellstar 6-well Plate</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>16 מ"מ עומק בארות כדי להתאים לתוספות</td></tr><tr><td>להב מסור עגול לכלי סיבובי</td><td>Dremel Dremel</td><td>SC690</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell צלחת בארות מרובות עם מוסיף קרום פוליקרבונט חדיר</td><td>קורנינג</td><td>10301031</td><td>לצלחות 6 בארות. 40 ומיקרו; m נקבוביות</td></tr> גודל <tr><td>מקדח Countersink</td><td>Craftomat, באוהאוס</td><td>22377902</td><td>לליטוש (20.5 מ"מ, 1/4 אינץ', HSS)</td></tr> <tr><td>צינור נימי זכוכית חד פעמי</td><td>Blaubrand</td><td>7087 33</td><td></td></tr><tr><td>אזמל חד פעמי</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>מכונת קידוח</td><td>Bosch</td><td>GSR 18 V-EC Professional</td><td></td></tr><tr><td>Dubbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma</td><td>D777</td><td></td></tr><tr><td>חממת ביצים עם גלוקוז גבוה קומפקטית S84</td><td>Grumbach, גרמניה</td><td>8012</td><td>לדגירה של ביצים לפני הגדרת ex ovo. טמפרטורה מוגדרת על 38&deg; C עם לחות יחסית מוגדרת מעל 60%</td></tr> <tr><td>אתנול (70%)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ביצים מופרות</td><td>Haaviston Siitoskanala, Panelia, פינלנד</td><td></td><td>Hy-Line White and Nick</td></tr><tr><td>Chick Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH3007003HI Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Forceps DUMONT #5</td><td>Dumont</td><td>#5SF</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>Menzel-Gl&auml; סר</td><td>מנזל BBAD02200220#A1TBCMNZ#0#</td><td>#22x22 מ"מ</td></tr><tr><td>דבק היסטואקריל</td><td>בראון</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>מטריג'ל</td><td>קורנינג</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>על הבמה חממה</td><td>Okolab</td><td></td><td>Boldline, PBS בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>-/-</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS +/+</td><td>Biowest</td><td>X0520-500</td><td>שטיפת המאגרים המיני.</td></tr><tr><td>פניצילין וסטרפטומיצין</td><td>סיגמא</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי פוליסטירן</td><td>Corpuscular</td><td>1000263-10</td><td>70 ומיקרו; m בקוטר</td></tr> מערכת <tr><td>רב כלים סיבובית</td><td>Dremel</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>ברזל הלחמה</td><td>Weller</td><td>TCP S</td><td>ניתן להשתמש גם בנימי זכוכית מחוממת</td></tr><tr><td>Thincert 12 בארות מוסיף תרבית תאים עם 0.4 ומיקרו; m-pore פוליסטירן ממברנה</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665641</td><td></td></tr><tr><td>Thincert 6 בארות מוסיף תרבית תאים עם 0.4 &micro; m-נקבוביות ממברנה פוליסטירן</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>657610</td><td></td></tr></tbody></table>

אופטימיזציה של כליות אורגאיד ותרבות אורגנותית לvascularization, פיתוח מורחב והדמיה מיקרוסקופית משופרת

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

התרבויות העובנותיות בכליות, ובעיקר בתאי גזע מסוג pluripotent, הם כלים מצוינים לטיפול בתהליכים ההתפתחותיים ובמחלת כליות הדוגמנות. עם זאת, המודלים מוגבלים על ידי חוסר vascularization ופונקציונליות. כדי לענות על כך, פרוטוקול משופר עבור השיטה של השתלת תאים ורקמות של xenooallאנטומי הקרום (CAM) של העובר העופות לקבל vascularization ושחזור זרימת הדם פותחה. השתלים מצופים בהתאמה אישית מיני מאגרים כי לתקן את הדגימות כדי CAM ולספק להם במדיום התרבות המגנה על השתלים מייבוש. שיטת התרבות המשופרת מאפשרת לגדל שתלי xenografts עד 9 ימים. כתב היד גם מתאר כיצד לספק תנאים אופטימליים לדימות ממוקד לטווח ארוך של מארגני כליות ותרבויות אורגאוטימית באמצעות שיטת הפעולה שפורסמה בעבר כיוון Z (FiZD). שיטה זו דוחסת בעדינות איבר עובריים או אורגנואיד בין שמיכות זכוכית ממברנה בכמות גדולה של בינונית ומספק תנאים מצוינים לדימות עד 12 ימים. ביחד, שיטות אלו מאפשרות זרימת הדם והזרמת דם לאורגנואידים כליות ולתרביות כליות אורגאוטיאית עם הדמיה משופרת של מיקוד. השיטות המתוארות כאן הן מועילות מאוד ללימוד פונקציות בסיסיות ומוחלות של כליות לשעבר vivo. שתי השיטות חלות על סוגים שונים של רקמות ואורגנואידים.

פרוטוקול התרבות פקה הציג כאן איפשר והוא יעיל מאוד vascularization של כליות אורגנואידים וכליות עובריים כתוצאה של xenotransplantation שתלת על עוף מצלמת (איור 1, סרט 1). מיני מאגרים המכילים בינונית תרבותית שסופקו חומרים מזינים לרקמת תורם והגנה אותו מפני ייבוש במהלך תקופת הזמן לפני vascularization נאותה. שיטה זו סיפקה תנאים מתירני לתאים הניתנים לתורם הנגזר לצמוח. לפיכך, הכליות והכליות ב כליות המושתלים ואורגנואידים הוצגו בעיקר, אם כי לא באופן בלעדי, על-ידי תאים ספציפיים לתורם (<s...

עבודה זו מתארת שתי שיטות למחקר התפתחות איברים, התקנה משופרת xenotransplantation שתלת על ממברנה כוראולאנטואית (CAM) מעוברי העופות המאפשר vascularization של איברים עובריים ואורגנואידים הרומן קבוע z-כיוון שיטת תרבות האיברים עם תנאים ניסיוני שונה המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה מיקוד הזמן.

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

תרבות איברים בכליות ואברונים שמקורם בתאי גזע מתוכנתים מספקים דרכים מצוינות ללמוד מנגנונים מאחורי התפתחות הכליות ומחלות. מערכת תרבות האיברים הנוכחית אינה מספקת זרימת דם לכליות, עם זאת. בשל כך, הסיבה שהמודלים הנוכחיים אינם שלמים ולא מצליחים לסכם מחדש את הפונקציה העיקרית של הכליה, שהיא סינון דם.בפרסום זה, אנו מציגים פרוטוקול משופר לטיפוח והדמיה של כליות עוברי אורגנואידים על הממברנה הכוריואלנטואית של עובר העוף. בהגדרת הניסויים החדשנית שלנו, אנו כיסוי בסיסי הכליה מושתלים על CAM עם מאגרי משמעות חדירים כי הם מלאים בינוני תרבות. פרוטוקול זה מגביר באופן משמעותי את ההישרדות של היסודות הכליות וגם את תאי האנדותל המהותיים.השיטה מאפשרת זרימת דם לגלומרולוס המתפתח. לאחרונה פרסמנו גם שיטת תרבות איברים חדשנית בכיוון קבוע המציעה הדמיה תלת-ממדית תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה. השיטה סיפקה תנאים אופטימליים להדמיה קונפוקרטית ארוכת טווח של האורגנואידים ויסודות האיברים.בגישה, אנו דוחסים בעדינות את הרקמה בין תלוש כיסוי זכוכית לבין קרום חדיר. כאן אנו מראים כיצד מיוצרים הלוחות המעוצבים המותאמים אישית וכיצד מוגדרים ניסויי התרבות. לכן, בפרסום זה אנו מציגים טכניקה משופרת תרבות צינורות כליות.שיטה זו מציעה דרך טובה יותר מודל organelle בראשית ולבצע הדמיה ברזולוציה גבוהה ללמוד כליות עובריות אורגנואידים כליות ex vivo. בהתאם לניסוי שלך לקחת תא העברה contra-inserts המיועדים שש בארות או 12 בארות צלחות. צמצם את דפנות ההוספה באמצעות כלי דרמל ליצירת טבעת פלסטיק בגובה שני מילימטרים עם קרום חדיר המחובר אליה.ללטש את קצות הטבעת מן swarf עם אזמל או סכין חדה. מעקרים את המיני מאגרים ב-70% אתנול למשך שעה אחת לפחות. לאחר מכן לשטוף את מאגרי מיני autoclave על ידי מים מזוקקים ולייבש אותם ברדס למינאר.יש לשטוף את המיני מאגרים ב-PBS ובמדיום התרבות. מניחים את המאגר על צלחת פטרי על גבי טיפת מדיום התרבות שלנו עם הממברנה הפונה כלפי מעלה. מסדרים כליות עובריות לשעבר של vivo או אורגנואידים בכליות על הממברנה.הימנעו מלהשאיר נוזלים גדולים סביב הדגימות ולהשאיר אותם מחוברים בין שעתיים ל -24 שעות באינקובטור של תרבות התא. השתלת גולגולת נעשית לממברנה הכוריואלנטואית של עוף עוברי לשעבר בן שמונה ימים. מעבירים את מאגרי המיני כך שהקרום מכסה את השתל.מקם אותם בפריפריה של CAM, כך שהם לא מכסים את העובר. לאחר מכן הוסיפו מדיום תרבות למאגרי המיני. לטפח את הדגימות על עוף CAM במשך תשעה ימים מקסימום.החלף את מדיום התרבות במאגרים הקטנים מדי יום. כלי דם של הדגימות ניתן לראות כבר 24 עד 48 שעות לאחר ההשתלה. כדי להפוך את מותאם אישית מעוצב שש בארות צלחות לתרבות קבועה.אתה צריך להתחיל על ידי קידוח 20 חורים מילימטר בחלק התחתון של הצלחת באמצעות מכונת קידוח עם קצת מקדחה מתאימה. לאחר מכן, ללטש את חישוקי החורים בצד העליון של הצלחת. לבסוף, לעקר את הצלחות ב 70% אתנול לפחות שעה אחת.לאחר מכן לשטוף את הצלחות autoclave על ידי מים מזוקקים ולייבש אותם ברדס lemiar. לשטוף את 22x22 מילימטר מכסה מחליק 70% אתנול ולתת להם להתייבש לחלוטין. הדבק את החלקת הכיסוי על גבי חור בתחתית באר באמצעות דבק רקמה.לאחר הייבוש, לבדוק את הצלחות תחת מיקרוסקופ סטרילי ולהסיר את הדבק עודף. ראשית, מערבבים aliquot של חרוזים פוליסטירן עם נפח שווה של מימן. מניחים את מוסיף המשדר מתחת למיקרוסקופ ניתוח עם קרום הפונה כלפי מעלה ומסדרים את הכליות על הממברנה.מוסיפים טיפה של תערובת חרוזים הידרו-ג'ל ליד הכליות בזהירות. הופכים את המשדר כך שהמברנה והכליות פונות כלפי מטה. ואז בזהירות למקם את הכנס לתוך הבאר שלנו של צלחת מעוצבת אישית שש באר.לדחוף את הכנס בעדינות רבה לתוך באר. בצע את מידת השטחה מן המיקרוסקופ עד הכליה היא ברמה עם חרוזים. שמור את הכנס מעט לחוץ לתוך באר ביד אחת ולתקן אותו לצלחת על ידי המסת פלסטיק בשלוש נקודות בפריפריה של הכנס עם ברזל הלחמה.מוסיפים שני מדיום תרבות מיליליטר לתוך באר דרך פתח בצד. כאשר מתחילים הדמיה לשגות זמן, להעביר את הצלחת לתוך החממה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. פרוטוקול לכידת CAM המשונה שלנו מאפשר כלי דם יעילים ביותר של אורגנואידים בכליות וכליות עובריות.מאגרים רבים המכילים תרבות בינונית מספקים רקמת תורם ומגינים עליה מפני ייבוש במהלך התקופה הראשונית של תהליך vascularizaton. סרט זה מראה את הזרימה של תאי דם עוף במרכז כליות עכבר עוברי מושתל CAM עוף מתורבת במשך שבעה ימים. לוח איור זה מראה כי שיטת תרבות CAM המשופרת שלנו מספקת תנאים מתירניים לתאי ה אנדותל שמקורם בכליות.איורים A ו-B מראים שהכליות העובריות שגדלו במשך חמישה ימים בימים של תרבות מרווחים היו במרכזן של מצלמות עוף במשך חמישה ימים. כתמים עם פרטי העכבר CD-31 נוגדן מראה כי רשת התאים אנדותל של מרכז הכליות מושתל CAM הוא נרחב יותר מאשר בשליטה בצד שמאל. איור C אנו רואים כי כלי הדם של העכבר מוכתמים בנוגדן CD-31 ספציפי לעכבר וזה הכי הרבה עם כלי דם עוף.איורים D ו- E מראים קריוסקופים של כליות עובריות עכבר גדל על תרבות הנסיעות או עוף CAM במשך חמישה ימים מוכתם CD-31 ו Hoechst. כלי הדם גלומרולי הוא בוגר יותר בכליות מתורבתות על עוף CAM מאשר בתרבויות שליטה. איור F מראה כליה עוברית של עכבר בתרבות CAM של תרנגולת GFP מהופנטת במשך שבעה ימים.תאי אנדותל העכבר מוכתמים בנוגדן CD-31 ואנחנו יכולים להבחין כי כלי הדם בכליות העכבר xenotransplanted הוא בעיקר אבל לא רק העכבר נגזר. תרבות הכיוון הקבועה של הרומן מאפשרת פולחן של כליות עובריות ואורגנואידים במרחק מוגדר מוגבל. בתרבות הנסיעות המסורתית, האיברים התרבותיים ממוקמים על מסנן שנשמר בממשק בינוני אוויר על ידי רשת מתכת.שיטה זו מאפשרת תנאים טובים להתפתחות ולצמיחה אך אינה אופטימלית להדמיה. בתרבות הכיוון הקבועה, האיבר התרבותי נלחץ בין תחתית זכוכית של המנה לבין קרום והעובי של זה נשלט על ידי גם כאן כמרחבים. האיברים המתפתחים ניתן לדמיין ישר דרך זכוכית הכיסוי נותן את התצוגה המשופרת של האיבר.פאנל איור זה מראה כי הכליות העובריות ואיברנואידים בכליות יכולים להיות מתורבתים בשיטת תרבות הכיוון הקבוע. תמונות שדה בהירות של כליות עובריות ואיברנואידים בכליות ביום השביעי מראות התפתחות תקינה. איור C, ביטוי GFB הופעל בנפרון המתפתח של אורגנואיד בכליות על ידי איור D מראה כליה עם טראומה אחת מכתימה על ניצן euretric ושש שתיים כתמים סימון תאי מבשר נפרון.הדמויות E ו- F מציגים את כליות העכבר בתרבות במשך 12 ימים. הטראומה 1 וכתמי נפרון מראים את ניצן הנויר ואת הפודוציטים. הסרט גם, מציג כליה עוברית של MTMG, מקור cree טייוואן, שם cree טייוואן גורם ביטוי GFB בתאי אנדותל.אנו יכולים לראות כי תאי אנדותל הכליה נמצאים בכליה העוברית המתפתחת ואת הרשת אנדותל יכול להתפתח גם בשיטת התרבות. בלוח מימין, ניתן לראות כיצד תאי אנדותל נודדים לתוך שסוע כלי הדם של נפרון שלב בצורת S. כאן הצגנו את הפרוטוקול המשופר עבור xenotransplantation של אורגנואידים כליות וכליות עובריות כדי עוף CAM.פרוטוקול זה מגביר באופן משמעותי את ההישרדות של היסודות הכליות וגם את תאי האנדותל המהותיים שלהם. השיטה מאפשרת זרימת דם לגלומרולוס המתפתח. הפרוטוקול השני המוצג כאן הוא שיטת תרבות האיברים בכיוון קבוע המשפרת את איכות ההדמיה ומסייעת ללמוד את בראשית האורגן ברמת התא הבודד.התמונות ברזולוציה גבוהה מתאימות לפיגמנטציה אוטומטית של תאים ולחקר מבוסס מחשב של התנהגות תאית באורגנואידים של כליות ותרבויות כליות.

optimization-renal-organoid-organotypic-culture-for-vascularization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרטון זה מתאר שיטה לחקר התפתחות איברים באמצעות מערך משופר של השתלת קסנו-השתלה על קרום כוריאואלנטואי (CAM) מעוברי עופות. שיטה זו מאפשרת התפתחות של איברים עובריים ואורגנואידים בתרבית כלי דם מלאים.

תרבית אורגנוטיפית של הכליה על עוף CAM: טכניקה להשתלת חצילים של כליות מורין על CAM עוף כדי לגרום להיווצרות של ארכיטקטורה וסקולרית כלייתית

שיטת התרבות תלת ממדים שתוארה בפרוטוקול זה משחזרת פיתוח לבלב מאבות מפוזרים עוברי לבלב של עכבר, כולל הרחבתן משמעותית, בידול והמורפוגנזה לתוך איבר מסועף. שיטה זו ניתנת להדמיה, התערבות ומניפולציה תפקודיות של הנישה.

במבחנה הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים

את כל המבנה תלת-ממדי ואת התוכן התאי של אורגנואידים, כמו גם את הדמיון הפנוטיפיק שלהם לרקמות המקוריות ניתן ללכד באמצעות פרוטוקול הדמיה תלת-ממדי ברזולוציה של תא יחיד המתואר כאן. פרוטוקול זה ניתן להחיל על מגוון רחב של אורגנואידים המשתנים במקור, גודל וצורה.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

פרוטוקול זה מדגים שיטות המאפשרות הרחבה בתרבות המבחנה של xenografts נגזר המטופל (PDX). צעד אחד משפר את הכדאיות הכוללת של תרבויות אשכול רב-תאי בהידרוג'לים תלת-מימדיים, באמצעות הסרה פשוטה של תאים בודדים שאינם ברי קיימא. שלב משני מדגים שיטות עבודה מומלצות לתרבות PDX בפלטפורמה מיקרו-נוזלית מנווטה.

קיימות משופרת עבור תרבויות הידרוג'ל 3D Ex vivo של Xenografts נגזר המטופל בפלטפורמה מיקרופלויד perfused

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). פרוטוקול זה מייצר אורגנואידים בכליות תוך שבועיים. האורגנואידים של הכליות המתקבלים יכולים להיות מתורבתים בבקבוקי ספינר בקנה מידה גדול או בלוחות ערבוב מגנטיים מרובי בארות עבור גישות מקבילות לבדיקת סמים.

שיטה פשוטה ליצירת אורגנואידים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

מאמר זה מציג פרוטוקול ייצור לסוג חדש של מצע תרבית עם מאות מיקרו-מיכלים למ"מ2, שבו ניתן לגדל אורגנואידים בתרבית ולצפות בהם באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. פרוטוקולי זריעת התאים ומערכת החיסון מפורטים גם הם.

פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה לתרבית והדמיה תלת-ממדית של אורגנואידים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להשתלת אורגנואידים בכליות בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות. שיטה זו גורמת לכלי דם ולהבשלה משופרת של האורגנואידים תוך 8 ימים וניתן להשתמש בה כדי ללמוד תהליכים אלה בצורה יעילה.

וסקולריזציה יעילה של אורגנואידים בכליות באמצעות השתלה אינטרסלומית בעוברי תרנגולות

פרוטוקול זה מציג שיטה מקיפה ויעילה לייצור אורגנואידים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות תנאי תרבית תרחיף. הדגש העיקרי של מחקר זה טמון בקביעת צפיפות התאים הראשונית וריכוז האגוניסט WNT, ובכך לטובת חוקרים המעוניינים במחקר אורגנואידים בכליות.

יצירת אורגנואידים בכליות בתרחיף מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת אורגנואידים במוח האנושי בשלבי הבשלה מרובים לתוך קרום כוריואלנטואי אפרוח (CAM). אורגנואידים במוח גודלו בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים לא מונחים.

אורגנואיד מוח אנושי מוקדם לא מונחה מידול נישה נוירו-וסקולרית לתוך קרום עובר אפרוח מתירני Chorioallantoic

פרוטוקול זה מציג שיטה ליצירת אורגנואידים וסקולריים באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

יצירת אורגנואידים וסקולריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם

למד פרוטוקול משופח לתרבות כליות עובריות ואורגאידים על ממברנת CAM של עוברי עוף. השיטה משפרת הישרדות, vascularization ומאפשרת הדמיה מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה לחקר התפתחות הכליה.

אופטימיזציה של כליות אורגאיד ותרבות אורגנותית לvascularization, פיתוח מורחב והדמיה מיקרוסקופית משופרת

גלה סרטונים נוספים