Name: מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: למד שיטת ספרואידים תלת-ממדית לחקר גלינובלסטומה ופלישת גידולים לרקמת מוח בריאה. מודל זה מאפשר הערכה מדויקת של השפעת תרופות על התנהגות תאי הגידול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre הסרטן (הקומיא דה לה גירדה et דה לה Charente-ימית). Joris Guyon הוא מקבל התחברות מבית החולים באוניברסיטת טולוז (CHU טולוז).

הסכמה בכתב מושכלת הושגה מכל המטופלים (מבית החולים האוקלאני, ברגן, נורבגיה על פי תקנות וועדת האתיקה המקומיות). הפרוטוקול שלנו עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של המוסד האנושי.
1. הדור של הגידולים הסרטניים בגודל אחיד
הערה: תאים כמו גזע הם מתורבתים בינונית נוירובסיס משלימה עם תוספת B27, הפארין, FGF-2, פניצילין, ו סטרפטומיצין, כפי שמתואר בסעיפים הקודמים12. תאים אלה יוצרים באופן ספונטני את הספאידים בתרבות.
<ol><li>לשטוף את התאים הסרטניים עם מלוחים 5 מ ל פוספט באגירה (PBS) ו הדגירה של תאים עם 0.5-1 mL האנזים הדיסוציאציה (ראה טבלת חומרים) עבור 5 דקות ב 37 ° c.</li>
	<li>לשטוף עם 4-4.5 מ"ל PBS ולהוסיף 10 מ ל של הצמיחה המלאה בינונית (מדיום neurobasal סיס מלא, cNBM).</li>
	<li>ספור את התאים תוך שימוש בטכניקת ספירה אוטומטית עם טרי, כחול ושקופית תא ספירת תאים.</li>
	<li>כדי ליצור 100 spheroids עם 104 תאים לספרואיד (לפי גודל מועדף), לערבב 106 תאים ב 8 מ ל Nbm עם 2 מ ל של 2% מתילצלולוזה.</li>
	<li>להעביר את ההשעיה אל מיכל סטרילי מערכת ולוותר 100 μL/ובכן עם פיפטה רב-ערוצית לתוך הלוח 96 בסיבוב התחתון היטב.</li>
	<li>מודקת את הצלחת ב 37 ° c, 5% CO2 ו 95% לחות. שוויון בגדלים שווים יהיה ליצור וניתן להשתמש בהם לאחר 3-4 ימים.</li>
</ol>2. ניסויים תלת-ממדיים
<ol><li>תפשטות<ol>
<li>כנה<ol>
<li>להשעות מעכבי (למשל, rotenone כמו באיור 4א) וכימיקלים ב 100 μl של בינוני ולהוסיף 100 μl של בינוני בכל טוב (כלומר, אחד ספרואיד לכל טוב).</li>
			<li>מודקת את הצלחת ב 37 ° c, 5% CO2, ו 95% לחות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>רכישת תמונה וניתוח<ol>
<li>צלם תמונות עם מיקרוסקופ וידאו ב ברייטפילד כדי ליצור סדרה של תנאים ב-T0 והמועדים הבאים צפויים.</li>
			<li>השתמש בפיג כדי לנתח תמונות באופן ידני או באופן חצי אוטומטי. כדי לעשות זאת באופן ידני, לצייר עיגול סביב הליבה ספרואיד עם הכלי בחירה ביד חופשית ולמדוד את האזור של כל ספרואיד. כדי לנתח את התמונות באופן חצי אוטומטי, השתמש במאקרו המוצג במסמך משלים 1 עם האזור המרכזי בלבד.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>פלישה<ol>
<li>כנה<ol>
<li>הכן את מטריצת קולגן בשפופרת על הקרח עם סוג אני קולגן ב 1 מ"ג/mL הריכוז הסופי, 1x PBS, 0.023 החמישה עשרקולגן, 1 M נתרן הידרוקסיד, ו-H סטרילי2O. הפתרון על הקרח עבור 30 דקות.</li>
			<li>לאסוף spheroids מן התחתון העגול צלחת הבאר ב 500 μL צינורות ולשטוף 2x עם 200 μL 1x PBS.</li>
			<li>פיפטה את הספרואידים בקפידה לתוך 100 μL של מטריצת קולגן ולהכניס במרכז באר בצלחות רגילות 96 טוב.</li>
			<li>דגירה ג'ל קולגן עבור 30 דקות ב 37 ° צ' ולאחר מכן להוסיף cNBM על גבי ג'ל. מעכבי או מפעילים (למשל, מימן כלוריד כפי שמוצג באיור 4ב, 4c) ניתן להוסיף למדיום בשלב זה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>רכישת תמונה וניתוח<ol>
<li>צלם תמונות ברצף עם מיקרוסקופ וידאו במצב ברייטפילד 24 שעות לאחר הכללת קולגן.</li>
			<li>השתמש בפיג כדי לנתח תמונות באופן ידני או באופן חצי אוטומטי. כדי לעשות זאת באופן ידני, לצייר סביב הליבה ואת האזור הכולל של הספרואיד עם הכלי בחירה ביד חופשית ולמדוד את האזור פולשני של כל ספרואיד על ידי הפחתה באזור כולל עם אזור הליבה. כדי לנתח את התמונות באופן חצי אוטומטי, השתמש במאקרו כפי שמצוין במסמך המשלים 1 כדי לקבוע את האזור הפולשני.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>העברה<ol>
<li>כנה<ol>
<li>מעיל לוחית 6 היטב עם מטריצות (0.2 mg/mL) ב NBM עבור 30 דקות ב 37 ° c, לאחר מכן להסיר את מטריצות ולהוסיף 2 מ ל cNBM.</li>
			<li>העברת spheroids לתוך 50 μL של cNBM מצלחת התחתונה העגולה היטב עד 6 צלחת הבאר.</li>
			<li>מודקת את הצלחת ב 37 ° צ' ולחכות 30 דקות כדי spheroids לדבוק.</li>
			<li>לאחר 24 שעות של דגירה, כתם עם 10 ng/mL של Hoechst ו הדגירה 30 דקות ב 37 ° c.</li>
		</ol>
</li>
		<li>רכישת תמונה וניתוח<ol>
<li>להשיג תמונות באמצעות מיקרוסקופ וידאו ברייטפילד. לייזר 405 ננומטר משמש להדמיה של כתמים מואכסט.</li>
			<li>השתמש בתוכנת פיג'י כדי לנתח תמונות ולהפעיל את המאקרו כפי שמצוין במסמך המשלים 1. הערה: נגיעה בתחתית הבאר או הסרת לחלוטין את נזקי הסופרנאנט. עבור סוג קולגן אני ג'ל טיפול, לשמור על הג על הקרח כדי למנוע הקולגן פולימור, לא להוסיף רכיב חומצי כי השינוי ב-pH ישפיע על הקומפקטיות של הג, ו פיפטה תאים במהירות לתוך הקולגן כדי למנוע את המוות התאים ואת ההשפלה של ג'ל.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. מאקרו פיג'י
הערה: פיג'י היא תוכנית ניתוח תמונה שפותחה בתחום הציבורי המאפשר פיתוח של פקודות מאקרו כדי להאיץ את ניתוח התמונה. ניתוח ידני אפשרי גם, אבל זהו תהליך איטי והוא עשוי להציג הטיות. ניתן לייבא תמונות על-ידי גרירה ושחרור בתוכנה וכימות עם תוסף מנהל הכלים של ROI. הנוהל המשמש במחקר זה מתואר להלן:
<ol><li>פתח את חלון המאקרו: תוספים | פקודות מאקרו | מתרגם אינטראקטיבי.</li>
	<li>העתק והדבק את הלולאה הסגולה הבאה שהותאמה. שמור על המשפטים הסגולים והוסף את משפטים הריבית הירוקים (מסמך משלים 1).</li>
	<li>כדי לנתח את הסידרה כולה, התאימו את הפרמטרים באדום לקוונפיקציה מסוימים והפעל את המאקרו באמצעות פקודות מאקרו | הפעל מאקרו או הקש Ctrl + R.</li>
	<li>בדוק ובמידת הצורך, התאם ידנית את אזור הריבית (ROI).</li>
</ol>4. מיקרוסקופ אלקטרוני של מספרואידים
הערה: יש לבצע את רוב הצעדים הבאים במכסה כימי.
<ol><li>שלב קיבוע<ol>
<li>לאסוף את הספרואיד עם טיפ חיתוך לחתוך, לשים אותו בצינור 1.5 mL, ולשטוף 1x עם 0.1 M פוספט מאגר (PB).</li>
		<li>תקן את הלילה הספרואיד ב -4 ° c ב-2% גלוטרלדהיד/2% פאראפורמלדהיד (בכיוון השני) ב-0.1 M PB.</li>
		<li>החליפו את פתרון הקיבעון בתמיסה של 1% בכיוון התנועה ב0.1 M PB ולאחריה הכנה לדוגמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה לדוגמא<ol>
<li>להעביר את הספרואידים לתוך מסננת ולשים אותם בתוך גביע זכוכית כדי למנוע נזק כלאיד.</li>
		<li>שטוף בזהירות 3x עם 0.1 M PB.</li>
		<li>, מיכל הלילה. דלל את אוסמיום ל 4% ב 1% 0.1 M PB מאגר.</li>
		<li>שטוף בזהירות 3x עם 0.1 M PB.<ol>
<li>הדמיים כדלקמן: להשרות ב-50% אתנול עבור 10 דקות, 70% אתנול עבור 10 דקות, 2x 90% אתנול עבור 15 דקות, 2x 100% אתנול עבור 20 דקות, ו-2x אצטון עבור 30 דקות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>מודטה את הדגימות בתערובת 50/50 של אצטון/שרף עבור 2 h. במהלך שלב זה, להכין את שרף EPON (להטביע-812:11.25 g; DDSA: 9 גרם; NMA: 4.5 g).</li>
		<li>להיפטר אצטון/שרף תערובת, להחליף עם שרף שהוכן טרי, הדגירה הלילה.</li>
		<li>החלף את השרף על ידי אחד חדש ו-דגירה בין 2-6 h.</li>
		<li>מוסיפים את הספרואידים בשרף לתוך עובש ב 60 ° c עבור 48-72 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pelissier, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+dysfunction+in+mechanotransduction+impairs+differentiation+of+human+mammary+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors.</a> Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+spheroids%3A+Relevance+to+cancer+stem+cells+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications.</a> Cancer Science. 108, 283-289 (2017).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance?</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Corbet, C., Feron, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+acidosis%3A+from+the+passenger+to+the+driver%27s+seat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).</li>
<li>Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Spheroid+Model+as+a+More+Physiological+System+for+Cancer-Associated+Fibroblasts+Differentiation+and+Invasion+In+Vitro+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e60122(2019).</li>
<li>Boye, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Dejeans, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+control+of+glioma+cells+adhesion+and+migration+through+IRE1alpha-mediated+cleavage+of+SPARC+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA.</a> Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).</li>
<li>Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+SPARC+expression+promotes+U87+glioblastoma+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+travel%3A+the+role+of+proteases+in+individual+and+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion.</a> Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).</li>
<li>Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP+proteolytic+activity+regulates+cancer+invasiveness+by+modulating+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins.</a> Scientific Reports. 7, 14219(2017).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+migration+and+invasion+uncoupled%3A+increased+migration+is+not+an+inexorable+consequence+of+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).</li>
<li>de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Experimenter%27s+Guide+to+Glioblastoma+Invasion+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways.</a> Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+invasive+proteome+of+glioblastoma+revealed+by+laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection.</a> Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הגידול ספרואיד בחני מותאמים היטב כדי ללמוד מאפייני הגידול כולל התפשטות, פלישה, הגירה, כמו גם מוות תאים ותגובת סמים. תאים סרטניים לפלוש מטריקס 3D ויוצרים גידול פולשני מיקרו, כפי שנראה באיור 4B, C. במהלך התהליך פולשנית, מטריצה מטאלואוטיות (MMP) לעכל מטריצות מסביב תאים סרטניים13, ו mmp מעכבי (g., GM6001 או Rebimastat) עלול לפגוע בפלישה לתא אבל לא הגירה14. ההגירה והפלישה כרוכות באירועים מולקולריים אך נפרדים, הניתנ...

ברוב המחקרים באמצעות קווי תא ראשי או מסחרית, בחני מבוצעים על תאים שגדלו על משטחי פלסטיק כמו תרבויות דופלקס. ניהול תרבות התא ב-2D מייצג חסרונות, כפי שהוא אינו מחקה בסביבת תא vivo 3D. בתרבויות דו-ממדיות, כל משטח התא הוא ישירות במגע עם המדיום, שינוי צמיחת התאים ושינוי זמינות התרופה. יתר על כן, משטח פלסטיק לא פיזיולוגי מפעיל בידול תא1. מודלים תלת ממדיים של תרבות פותחו כדי להתגבר על הקשיים הללו. יש להם את היתרון של לחקות את האדריכלות הרב-תאיים ואת טרוגניות של גידולים2, ולכן יכול להיחשב למודל רלוונטי יותר עבור גידולים מוצק3. המבנה המורכב של הספרואידים תורם להערכה טובה יותר של חדירה לסמים והתנגדות4. הגידול טרוגניות ב ספרואיד משפיע על הדיפוזיה של חמצן וחומרים מזינים, ואת התגובה של סוכני תרופתי (איור 1A). דיפוזיה של חמצן משתנה כאשר גודל ספרואיד מגיע 300 μm, גרימת סביבה ארוי במרכז הספרואיד (איור 1A, C). מטבוליטים הם גם פחות חודר דרך שכבות התא והתגובות מטבולית לפצות להתרחש5. כאשר קוטרו של מגדיל ספרואיד, ליבות נקרוטיות ניתן לצפות, עוד מאפיינים לחקות המצויים בסוגי סרטן מוצק רבים, כולל סרטן המוח האגרסיבי גליובלסטומה (GBM)6.
מספר הפלישה 2d או 3d שאומר עבור gliנובלסטומה דווחו בספרות7,8. מימד דו-מימדי הם בעיקר לחקר הפלישה במישור אופקי על שכבת מטריצה דקה או בתוך שיטת הקאמרית Boyden9. תלת מימדי בחני שתוארו עם תרבויות תלת-ממד ספרואיד באמצעות קווי התאים הקלאסיים גליובלסטומה10. גרסאות מורכבות יותר מיוצגים על ידי פלישה של אורגנואידים המוח על ידי spheroids הגידול בתרבויות העימות11. עם זאת, עדיין חשוב לפתח שיטת קל לשימוש ושימוש בלתי זמין לכל מעבדה. פיתחנו פרוטוקול לייצר תאים של גזע גלנובלסטומה מדגימות המטופל. הקוונפיקציה של מספר אלה ניתן לניהול בקלות ודורשת רק תוכנה מקוונת גישה לפתוח. בקצרה, חתיכות הגידול הם חותכים לחתיכות קטנות מתעכל באמצעות אנזימטי. תאים בודדים הנגזרים מהעיכול מעובדים במדיום נוירו-בסיס. לאחר 4-7 ימים, מבנים ספרואיד יוצרים באופן ספונטני. עם השרשה הגולגולתית בדגמי עכברים, הם יוצרים גידולים המציגות ליבה נקרוטיק מוקפת בתאי מדומה-פאליפורם12. זה דומה מאוד למאפיינים המצויים בחולים GBM.
במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו כדי לייצר spheroids מתוך מספר נחוש של תאים כדי להבטיח התוכסות. ניתן להשתמש בשני מטריצות משלימות למטרה זו: מטריצות וסוג קולגן I. מטריצות מועשר בגורמי גדילה ומחקה את קרום המוח הבזתי הנדרש לתא המצורף והגירה. מצד שני, קולגן סוג אני, אלמנט מבנית של משתית, הוא הנפוץ ביותר fibrillary מטריקס מטריצה והוא משמש הפלישה התא assays. להלן, אנו ממחישים את המודל הספרואיד שלנו על-ידי ביצוע הגירה והפצת מוסר. ניתוח נעשה לא רק בנקודות בזמן קבוע אלא גם על ידי ניטור התרחבות ספרואיד ותנועת התאים על ידי הדמיה חיה. יתר על כן, המיקרוסקופיה אלקטרונית נעשתה כדי להמחיש פרטים מורפולוגיים.

<table><tbody><tr><td>96 צלחת תחתונה עגולה היטב</td><td>Falcon</td><td>08-772-212</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, אנזים דיסוציאציה כדורית</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; C, הפשרה לפני השימוש</td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factor</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, הפשרה לפני השימוש</td></tr><tr><td>שקופיות תא ספירת תאים של רוזנת</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>מאוחסנות בטמפרטורה של 4 מעלות; </td></tr><tr><td>C תוכנת פיג'י</td><td>ImageJ</td><td></td><td>משמשת לניתוח תמונות</td></tr><tr><td>בקבוק 75 ס"מ2</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; C, מדולל לריכוז סופי של 0.2 מ"ג/מ"ל ב-NBM</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0512</td> קר <td>מדולל ב-NBM לריכוז סופי של 2%</td></tr><tr><td>NBM</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>מאוחסן ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>פניצילין - Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>טריפן כחול 0.4%</td> <td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>משמש לספירת תאים</td></tr><tr><td>354236 קולגן מסוג I</td><td></td><td></td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; ג</td></tr></tbody></table>

מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

שתי ממדיות (2D) תרביות תאים לא לחקות את הגידול vivo בסדר משביע רצון. לכן, מודלים תלת ממדיים (3D) תרבות ספרואיד פותחו. מודלים אלה עשויים להיות חשובים במיוחד בתחום של נוירולוגיה-אונקולוגיה. אכן, גידולים במוח יש נטייה לפלוש לסביבת המוח הבריא. אנו מתארים זאת באופן אידיאלי 3d גליובלסטומה המבוססת על מבוססי שפיתחנו לחקור את הפלישה הגידול. אנו מספקים את כל הפרטים הטכניים והכלים האנליטיים כדי לבצע בהצלחה את השיטת העבודה.

הספרואידים הוכנו כמתואר בסעיף הפרוטוקולים ותצפיות נעשו לגבי הגירה, פלישה, התפשטות ומיקרוסקופ. כדי למדוד היפוקסיה באזורים שונים של המבנה כדורית, כתמים carboxic התשיעי המשמש לקביעת פעילות ארוי (איור 1א-ג). תאים CAIX-חיוביים נוספים נצפו במרכז ספרואיד (איור 1א-ג). תאים ארוי ממוקם בליבת ספרואיד נוטים להיות גליקוליטיק יותר מאשר אלה שמסביב. ניתן להציג את המיטוסקופיה לניתוח נוסף כפי שמוצג על ידי אלקטרון ...

כאן, אנו מתארים שיטת פלישה קלה לשימוש עבור גלינובלסטומה. שיטת הפעולה הזאת מתאימה לתאים גלנובלסטומה כמו גזע. מאקרו של פיג'י לכימות קל של פלישה, הגירה והתפשטות מתואר גם כן.

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

תרבויות תאים דו מימדיות אינן מחקות כראוי בגידול vivo. כדי לשפר, נהלים 3D פותחו באמצעות כדוריות. ההתמדה שלנו המבוססת על כדוריאובלסטומה תלת מימדית מתאימה במיוחד לחקור פלישה לגידולים במוח לסביבת הגידול הבריאה במוח.מודלים תלת מימדיים תרבות יכול לשמש כדי לסכם ארכיטקטורה רב תאית, הטרוגניות מצב מטבולי של גידולים המאפשר הערכה קפדנית יותר של השפעות סמים. הקפד לא לגעת בחלק התחתון של באר או להסיר לחלוטין את supernatant, כדי לשמור על הג'ל על הקרח, ולהוסיף את התאים לג'ל במהירות. כדי ליצור כדוריות גידול בגודל אחיד, ראשית לשטוף את תרבות תא הגידול של עניין עם חמישה מיליליטר של PBS ולטפל בתאים עם 0.5 כדי מיליליטר אחד של אנזים דיסוציאציה.לאחר חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לעצור את התגובה עם ארבעה עד 4.5 מיליליטר של PBS ולהעביר את התאים מנותקים לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מדיום צמיחה מלאה. לאחר הספירה, יש להשתמש מחדש בתאים במהירות של פי 10 עד התא השישי לשמונה מיליליטר של מדיום צמיחה שלם בתוספת שני מיליליטר של ריכוז מתילקלולוס של 2% ולהעביר את ההשעיה למיכל מערכת סטרילי. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטרים של תאים לכל באר של צלחת תחתונה עגולה 96 היטב ומ מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה עד ארבעה ימים.כדי לבצע בדיקת פלישה, כאשר תאי הגידול יצרו כדוריות בגודל אחיד, להעביר כל מבנה תא לתוך צינור 500 microliter ולשטוף את הכדורואידים פעם אחת עם 200 microliters של PBS. לאחר הכביסה השנייה, מעבירים את הספרואידים בזהירות ל-100 מיקרוליטרים של מטריצת קולגן טרייה ומוסיפים כל מתלה כדורי למרכז כל באר של צלחת שטוחה עם 96 בארות. לאחר דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף 100 microliters של מדיום צמיחה מלאה על גבי הג'ל בכל באר.הקפד למקם את כל הכדורואידים במרכז כל באר להדמיה הטובה ביותר של פלישת תאי הגידול. כדי לבצע בדיקת הגירה, כאשר תאי הגידול יצרו כדוריות בגודל אחיד, מצפים צלחת שש באר עם 0.2 מיליגרם למיליליטר של Matrigel במדיום צמיחה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להסיר את Matrigel ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום צמיחה מלאה לכל באר.מעבירים את הכדורים מהצלחת התחתונה העגולה ב-50 כרכים מיקרוליטרים לתוך בארות בודדות של צלחת שש הבאר ומנחים את הצלחת באינקובטור של תרבות התאים למשך 24 שעות. למחרת, להכתים את הספרואידים עם 10 ננוגרם למיליליטר של Hoechst במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לרכישת תמונה לאחר פלישה או בדיקה הגירה, למקם את הלוח על הבמה של מיקרוסקופ confocal Brightfield מצויד במצלמת וידאו ולקבל תמונות במהלך תקופת הניסיון המתאימה.כדי לנתח את התמונות באופן אוטומטי למחצה, יבא את התמונות לפיג'י ולחץ על תוספים, פקודות מאקרו, מתורגמן אינטראקטיבי. העתק והדבק את הלולאה הסגולה המותאמת. שמור את המשפטים הסגולים והוסף את המשפטים הירוקים של עניין לפי הצורך.לאחר מכן, כדי למדוד את האזור של כל ספרואיד, לחץ על נתח ולמדוד. כדי למדוד היפוקסיה באזורים שונים של המבנה הכדורי, פחמן anhydrase IX כתמים ניתן להשתמש כדי לקבוע את הפעילות hypoxic. בניתוח מייצג זה, תאים חיוביים יותר פחמתי anhydrase IX נצפו במרכז ספרואיד.תאים היפוקסיים הממוקמים בליבת הכדור נוטים להיות גליקוליטיים יותר מהתאים המקיפים את הליבה. מיטוכונדריה ניתן לדמיין על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים לניתוח נוסף. קוטר הכדוריד מתואם ישירות לצפיפות התאים המשלמים את מבנה התאים תלת-מימדיים ופקודות מאקרו של פיג'י יכולות לשמש לכימות התפשטות, פלישה או הגירה של התאים בתוך כל ספרואיד או הגירה של התאים בתוך כל ספרואיד.עליות בליבת הספרואיד משקפות את הגירוי של התפשטות התאים. עם עיכוב המורכב I של שרשרת הנשימה המיטוכונדרית, הרוב המכריע של ייצור ATP במיטוכונדריה נפגע הפחתת התפשטות על ידי 20% לאחר 72 שעות. טיפול מימן כלורי משפר את סוג הקולגן אני פלישה על פני תקופה של 24 שעות אבל מקטין את אזור הנדידה של כדוריות 1.5-פי לעומת שליטה כדוריים מטופלים.כפי שהוערך על ידי הדמיה חיה, הכדורואידים מדגימים דינמיקה פנימית גבוהה וזזים במהירות. גודל הספרואידים צריך להיות אחיד יחסית ויש לדאוג לתפעל את הכדורואידים למרכז בארות לתוצאות ההדמיה הטובות ביותר. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור התפשטות תאים סרטניים, הגירה ומוות, כמו גם את הביטוי של מטריצה חוץ תאית, קולטני תאים או חלבונים תאיים של עניין.הכדורידים עשויים גם להיות אנקפסולציה ואת ההשפעה של מתח משטח התא מוגברת ניתן לחקור עם הסרת הכמוסות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מדגים כיצד גליומאספירות, שמקורן בגידולי מוח, מופרדות לתאים בודדים ועטופות בהידרוג'ל המבוסס על חומצה היאלורונית. תהליך זה מקדם אינטראקציות בין תאים ויוצר מודל גליובלסטומה תלת-ממדי מובנה.

הידרוג'ל על בסיס חומצה היאלורונית לתרבית תלת מימדית של תאי גליובלסטומה

מקור: Guyon, J., et al. מודל ספרואיד תלת מימדי לגליובלסטומה. J. Vis. Exp. (2020)הסרטון מדגים את היצירה של מודל ספרואיד תלת מימדי של פלישת תאי גידול. ספרואידים נוצרים מתאי גידול מוח אנושיים ומוטמעים במטריצת קולגן. תאי הגידול בפריפריה הספרואידית מאמצים פנוטיפ פולשני, מפרישים פרוטאזות כדי לפרק את הקולגן ומתקדמים לפלוש למטריצה שמסביב.

יצירת מודל ספרואיד תלת מימדי של פלישת תאי גידול

פרוטוקול להפצה של דגימות כירורגיות גליומה בדרגה גבוהה מנותקות במדיום נוירוספרה ללא סרום כדי לבחור עבור תאים עם פנוטיפ תא גזע סרטני. עבור דגימות שלא מצליחות לגדול כמו נוירוספרות, פרוטוקול חלופי מוצע. טכניקת הטמעת פרפין לשמירה על הארכיטקטורה הנוירוספרית התלת מימדית לאימונוציטוכימיה מתוארת.

אופטימיזציה של תרבית תאי גליומה בדרגה גבוהה מדגימות כירורגיות לשימוש במודלים קליניים רלוונטיים לבעלי חיים ואימונוכימיה תלת-ממדית

פלישה לרקמות נורמליות שמסביב היא מאפיין מגדיר של גידולים ממאירים. אנו מספקים כאן מבחן מיקרו-צלחת פשוט ואוטומטי למחצה של פלישה לביומטריצה תלת מימדית טבעית שהודגמה במספר מודלים של סרטן אנושי מתקדם.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

במאמר זה אנו מתארים מודל עכבר אורתוטופי פרה-קליני עבור GBM, שהוקם על ידי הזרקה תוך-גולגולתית של תאים שמקורם בגידולי מודל עכבר מהונדסים גנטית. מודל זה מציג את סימני ההיכר של המחלה של GBM אנושי. עבור מחקרים תרגומיים, הגידול במוח העכבר נמצא במעקב על ידי MRI in vivo והיסטופתולוגיה.

מודלים אורתוטופיים תרגומיים של גליובלסטומה מולטיפורמה

עוברי אפרוחים משמשים לחקר גידולי מוח מסוג גליובלסטומה אנושית (GBM) בתרביות משותפות של פרוסות מוח ב-ovo וב-ex vivo. ניתן לתעד התנהגות תאי GBM במיקרוסקופ בהילוך מהיר בתרביות משותפות ex vivo, וניתן לנתח את שני התכשירים בנקודת הקצה של הניסוי על ידי ניתוח קונפוקלי תלת-ממדי מפורט.

שימוש במוח עובר אפרוח כמודל לניתוחי In Vivo ו - Ex Vivo של התנהגות תאי גליובלסטומה אנושיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר ייצור מהיר, חזק וזול של ספרואידים סרטניים ואחריו אנקפסולציה הידרוג'ל. זה ישים באופן נרחב כפי שהוא אינו דורש ציוד מיוחד. זה יהיה שימושי במיוחד לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה ובניית פיזיולוגיה של רקמות חוץ גופיות או מודלים פתולוגיים.

ייצור ספרואידי גידול ואנקפסולציה בהידרוג'ל פוליאתילן גליקול לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה

אנו מציגים שיטה לשכפול מיקרו-סביבה של גידול גליומה בחזית פולשנית המשלבת זרימת נוזל אינטרסטיציאלית. מודל זה הוא הידרוג'ל היאלורונן-קולגן I בתרבית רקמה שבה ניתן להפעיל ראש לחץ נוזל. פלישה ניתן לכמת, תאים ניתן לבודד או lysed.

מודל חומצה היאלורונית קולגן פוטופולימרי של מיקרו-סביבה פולשנית מסוג גליומה עם זרימה אינטרסטיציאלית

כאן, אנו מקימים פלטפורמת פרופיל מטבולי המשלבת ספרואידים גליומה תלת מימדיים (תלת מימדיים) ונורמליזציה מבוססת הדמיה באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי. גישה זו מאפשרת הערכה מדויקת יותר של התגובות המטבוליות של הגידול לטיפולים תרופתיים ומספקת תובנות לגבי מנגנוני עמידות פוטנציאליים.

התקדמות בפרופיל מטבולי של ספרואידים תלת מימדיים של גידולי מוח לבדיקת תרופות

אנו מציגים מודל נדידה תלת-ממדי של גליובלסטומה המשתמש בגליאומספירות מגנטיות שמקורן במטופלים שנוצרו מגידולים שאובחנו לאחרונה וחזרים. פלטפורמה זו מאפשרת המחשה של דינמיקת ההגירה הספציפית של מטופלים והערכת יעילות טיפולית. הבדיקה יכולה להיות מולטיפלקסית לאחר ההגירה כדי להעריך את מיקום החלבונים ודפוסי ביטוי.

בדיקת נדידת גליובלסטומה תלת-ממדית שכפולה עם מיקום ספרואידי מתווך ננו-חלקיקים מגנטיים בתנאים היפוקסיים

למד שיטת ספרואידים תלת-ממדית לחקר גלינובלסטומה ופלישת גידולים לרקמת מוח בריאה. מודל זה מאפשר הערכה מדויקת של השפעת תרופות על התנהגות תאי הגידול.

מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

גלה סרטונים נוספים