מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

תרבויות תאים דו מימדיות אינן מחקות כראוי בגידול vivo. כדי לשפר, נהלים 3D פותחו באמצעות כדוריות. ההתמדה שלנו המבוססת על כדוריאובלסטומה תלת מימדית מתאימה במיוחד לחקור פלישה לגידולים במוח לסביבת הגידול הבריאה במוח.

מודלים תלת מימדיים תרבות יכול לשמש כדי לסכם ארכיטקטורה רב תאית, הטרוגניות מצב מטבולי של גידולים המאפשר הערכה קפדנית יותר של השפעות סמים. הקפד לא לגעת בחלק התחתון של באר או להסיר לחלוטין את supernatant, כדי לשמור על הג'ל על הקרח, ולהוסיף את התאים לג'ל במהירות. כדי ליצור כדוריות גידול בגודל אחיד, ראשית לשטוף את תרבות תא הגידול של עניין עם חמישה מיליליטר של PBS ולטפל בתאים עם 0.5 כדי מיליליטר אחד של אנזים דיסוציאציה.

לאחר חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לעצור את התגובה עם ארבעה עד 4.5 מיליליטר של PBS ולהעביר את התאים מנותקים לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מדיום צמיחה מלאה. לאחר הספירה, יש להשתמש מחדש בתאים במהירות של פי 10 עד התא השישי לשמונה מיליליטר של מדיום צמיחה שלם בתוספת שני מיליליטר של ריכוז מתילקלולוס של 2% ולהעביר את ההשעיה למיכל מערכת סטרילי. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטרים של תאים לכל באר של צלחת תחתונה עגולה 96 היטב ומ מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה עד ארבעה ימים.

כדי לבצע בדיקת פלישה, כאשר תאי הגידול יצרו כדוריות בגודל אחיד, להעביר כל מבנה תא לתוך צינור 500 microliter ולשטוף את הכדורואידים פעם אחת עם 200 microliters של PBS. לאחר הכביסה השנייה, מעבירים את הספרואידים בזהירות ל-100 מיקרוליטרים של מטריצת קולגן טרייה ומוסיפים כל מתלה כדורי למרכז כל באר של צלחת שטוחה עם 96 בארות. לאחר דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף 100 microliters של מדיום צמיחה מלאה על גבי הג'ל בכל באר.

הקפד למקם את כל הכדורואידים במרכז כל באר להדמיה הטובה ביותר של פלישת תאי הגידול. כדי לבצע בדיקת הגירה, כאשר תאי הגידול יצרו כדוריות בגודל אחיד, מצפים צלחת שש באר עם 0.2 מיליגרם למיליליטר של Matrigel במדיום צמיחה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להסיר את Matrigel ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום צמיחה מלאה לכל באר.

מעבירים את הכדורים מהצלחת התחתונה העגולה ב-50 כרכים מיקרוליטרים לתוך בארות בודדות של צלחת שש הבאר ומנחים את הצלחת באינקובטור של תרבות התאים למשך 24 שעות. למחרת, להכתים את הספרואידים עם 10 ננוגרם למיליליטר של Hoechst במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לרכישת תמונה לאחר פלישה או בדיקה הגירה, למקם את הלוח על הבמה של מיקרוסקופ confocal Brightfield מצויד במצלמת וידאו ולקבל תמונות במהלך תקופת הניסיון המתאימה.

כדי לנתח את התמונות באופן אוטומטי למחצה, יבא את התמונות לפיג'י ולחץ על תוספים, פקודות מאקרו, מתורגמן אינטראקטיבי. העתק והדבק את הלולאה הסגולה המותאמת. שמור את המשפטים הסגולים והוסף את המשפטים הירוקים של עניין לפי הצורך.

לאחר מכן, כדי למדוד את האזור של כל ספרואיד, לחץ על נתח ולמדוד. כדי למדוד היפוקסיה באזורים שונים של המבנה הכדורי, פחמן anhydrase IX כתמים ניתן להשתמש כדי לקבוע את הפעילות hypoxic. בניתוח מייצג זה, תאים חיוביים יותר פחמתי anhydrase IX נצפו במרכז ספרואיד.

תאים היפוקסיים הממוקמים בליבת הכדור נוטים להיות גליקוליטיים יותר מהתאים המקיפים את הליבה. מיטוכונדריה ניתן לדמיין על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים לניתוח נוסף. קוטר הכדוריד מתואם ישירות לצפיפות התאים המשלמים את מבנה התאים תלת-מימדיים ופקודות מאקרו של פיג'י יכולות לשמש לכימות התפשטות, פלישה או הגירה של התאים בתוך כל ספרואיד או הגירה של התאים בתוך כל ספרואיד.

עליות בליבת הספרואיד משקפות את הגירוי של התפשטות התאים. עם עיכוב המורכב I של שרשרת הנשימה המיטוכונדרית, הרוב המכריע של ייצור ATP במיטוכונדריה נפגע הפחתת התפשטות על ידי 20% לאחר 72 שעות. טיפול מימן כלורי משפר את סוג הקולגן אני פלישה על פני תקופה של 24 שעות אבל מקטין את אזור הנדידה של כדוריות 1.5-פי לעומת שליטה כדוריים מטופלים.

כפי שהוערך על ידי הדמיה חיה, הכדורואידים מדגימים דינמיקה פנימית גבוהה וזזים במהירות. גודל הספרואידים צריך להיות אחיד יחסית ויש לדאוג לתפעל את הכדורואידים למרכז בארות לתוצאות ההדמיה הטובות ביותר. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור התפשטות תאים סרטניים, הגירה ומוות, כמו גם את הביטוי של מטריצה חוץ תאית, קולטני תאים או חלבונים תאיים של עניין.

הכדורידים עשויים גם להיות אנקפסולציה ואת ההשפעה של מתח משטח התא מוגברת ניתן לחקור עם הסרת הכמוסות.