Name: הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: למדו לסנן פיטואסטרוגנים במזונות צמחיים באמצעות מבחן דיווח לקולטן אסטרוגן β בתאים. השיטה מאפשרת לזהות פעילות אסטרוגנית ביולוגית ולחקור השפעות תזונתיות על פרימטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לדייל לייטמן על אימון ראשוני בשימוש במבחני ארעי ארעיים כדי לקבוע פעילות אסטרוגניים של מזונות צמחיים פרימטים. תודה לברדפורד ווסטריץ' ואריק ג'ונסון שעזרו להקים ציוד מעבדה ולהכשיר סטודנטים בשיטות חילוץ. לבסוף, תודה לאוניברסיטת אינדיאנה על מימון המחקר הזה.

1. הכנת חומרים צמחיים
<ol><li>הקפאת פריטים צמחיים יבשים שנאספו טריים באמצעות ליופילייזר.<ol>
<li>כדי להגן על דגימות מפני אור, לכסות תאים עם רדיד אלומיניום במהלך תהליך הייבוש.</li>
		<li>כדי להבטיח כי דגימות יבשות לחלוטין, lyophilize עד התאים כבר לא מרגיש קר לגעת חומרים צמחיים כבר לא לאבד מסה כאשר שקל.</li>
		<li>יש לאחסן צמחים מיובשים בשקיות שאריות נמוכות סטריליות בהיעדר אור עד לטחינה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>טוחנים דק דגימות בעזרת טחנת טחינה עם מסך רשת של 0.85 מ"מ.<ol>
<li>לאחסן את דגימות הקרקע בשקיות בהיעדר אור עד החילוץ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מיצוי מטבוליטים משניים צמחיים
<ol><li>כדי לחלץ את מטבוליטים הצמח המשני, להשתמש ביחס של 1 גרם של מדגם מיובש ל 10 מ"ל של מתנול כיתה HPLC.<ol>
<li>לשקול מדגם על איזון אנליטי ולהוסיף אותו בקבוק Erlenmeyer בגודל המתאים (125 – 250 מ"ל). לאחר מכן הוסף נפח מתאים של מתנול. רשום את המסה של המדגם שחולצה.</li>
		<li>לכסות את הפתרון הצמח מתנול עם רדיד אלומיניום, ולאחר מכן להגדיר לסובב במהירות 100 סל"ד בטמפרטורת החדר (RT) במשך 3 ימים על שייקר מסלולית, המאפשר תרכובות אסטרוגניים פוטנציאליים להתמוסס לתוך מתנול.</li>
		<li>מכניסים את הסופרנט למערכת סינון טפטוף באמצעות נייר סינון (125 מ"מ).</li>
		<li>באמצעות מאייד סיבובי, לייבש את תמצית הצמח עד המדגם הוא מעובה, אבל לשפוך, בבקבוק 300 מ"ל עגול התחתון. יוצקים דגימה לתוך בקבוק 50 מ"ל עגול התחתון, לשטוף את הבקבוק הגדול עם כמות קטנה של מתנול. ממשיכים לייבש את הדגימה בבקבוקון הקטן עד שהמתנול מתאדה לחלוטין.</li>
		<li>לשקול את שאריות המדגם באמצעות איזון אנליטי. רשום מסה של שאריות.</li>
		<li>ממיסים את תמצית הצמח בדמתיל סולפוקסיד (DMSO) בריכוז של 0.1 גרם תמצית ל-2 מ"ל של DMSO. וורטקס עד הומוגני.</li>
		<li>אחסן את תמצית הצמח-פתרון DMSO ב 4 מעלות צלזיוס בבקבוקוני זכוכית ענבר עד לתסמין.</li>
	</ol>
</li>
</ol>התראה: צמחים יכולים לייצר כימיקלים פעילים ביולוגית לא ידועים, ו- DMSO הוא רכב שיכול להעביר אותם על פני קרום התא. השתמש בציוד מגן אישי מתאים וטיפול בעת טיפול בדגימות אלה.
3. קולטן אסטרוגן אנושי β transfection assay12
הערה: טכניקה אספטית ומכסה המנוע לזרימה למינארית נדרשים ליום הראשון של פרוטוקול ההסתעפות.
<ol><li>הכן דילולים של 17β-אסטרדיול עבור העקומה הסטנדרטית.<ol>
<li>מעבירים את מדיום ההקרנה הבינונית והתרכובת של שחזור התאים (CSM) מאחסון המקפיא ומפשירים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>תווית צינורות microcentrifuge ביניים 1 ו 2 (INT1, INT2) ו 1-8.</li>
		<li>מלא INT1 עם 995 μL של CSM, INT2 עם 615 μL של CSM, צינור 1 עם 900 μL של CSM, וצינורות 2-8 עם 600 μL של CSM. מניחים את צינור 8 בצד.</li>
		<li>העבר 5 μL של 100 מיקרומטר 17β-אסטרדיול מלאי לתוך INT1. השלך את הקצה. מערבולת.</li>
		<li>לפני כל העברה, לשטוף פיפטה 3 פעמים, ולאחר מכן להעביר 10 μL מ INT1 לתוך INT2. השלך את הקצה.</li>
		<li>לשטוף פיפטה 3 פעמים, ולאחר מכן להעביר 100 μL מ INT2 לתוך צינור 1. השלך עצה. העבר 300 μL מצינור 1 לתוך צינור 2. חזור על הפעולה עבור צינורות 3 עד 7. השלך 300 μL מצינור 7 לתוך מיכל פסולת. צינור 8 הוא אפס ואינו מקבל אסטרדיול. הריכוזים הסופיים של סטנדרטים מצופים הם: 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 ו 0 pM אסטרדיול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו תרכובות לדוגמה.<ol>
<li>דגימות וורטקס.</li>
		<li>קח 4 μL של כל מדגם צמח DMSO ולהוסיף 496 μL של CSM להניב פתרון DMSO 0.8%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להפשיר במהירות תאי כתב.<ol>
<li>לאחזר את הצינור של תא התאוששות בינוני מאמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לחטא את המשטח החיצוני באמצעות 70% אתנול.</li>
		<li>אחזר תאי כתב מ- -80 °C (70 °F) אחסון והפשרה על-ידי העברת 10 מ"ל של CRM שחומם מראש לתוך הצינור של תאים קפואים.</li>
		<li>סגור את הצינור של תאי כתב ולהעביר לאמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 5 - 10 דקות.</li>
		<li>לאחזר את הצינור של השעיית תא כתב מאמבט המים. הפוך את הצינור של תאים מספר פעמים בעדינות כדי לשבור אגרגטים של תאים לייצר השעיה הומוגנית. לנקות את פני השטח של הצינור עם 70% אתנול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ציפוי מבחנים<ol>
<li>לוותר על 100 μL של השעיית תא הכתב לתוך כל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית.</li>
		<li>לוותר על 100 μL של דגימות משולש לתוך בארות assay המתאים.</li>
		<li>מעבירים את הצלחת לאינקובטור 37 מעלות צלזיוס, לחות 5% CO2 עבור 22-24 שעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפשרת מצע זיהוי ומאגר זיהוי במקרר חשוך בן לילה כדי להתכונן ליום 2.</li>
	<li>רגע לפני סיום הדגירה, הסירו את מצע הגילוי ומאגר הגילוי מהמקרר והניחו באזור תאורה חלשה עד לשיווי משקל ל-RT. פעם אחת ב- RT, הפוך כל צינור בעדינות מספר פעמים כדי לערבב פתרונות ביסודיות.<ol>
<li>מיד לפני השלמת הדגירה, יוצקים את כל התוכן של מאגר הגילוי לתוך הצינור של מצע זיהוי כדי ליצור ריאגנט זיהוי לוציפראז. מערבבים בעדינות כדי לא לייצר קצף.</li>
		<li>לאחר הדגירה הושלמה, להפוך את הצלחת כדי להשליך תוכן לתוך מיכל פסולת מתאים. הקישו בעדינות על הצלחת על מגבת נייר נקייה סופגת כדי להסיר את הטיפות האחרונות מהבארות.</li>
		<li>הוסף 100 μL של ריאגנט זיהוי לוציפראז לכל באר. אפשר לצלחת ההסתעפות לנוח ב- RT במשך 15 דקות. אל תנער את הצלחת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לכמת זוהר באמצעות לומינומטר 96-טוב לקריאת צלחת.</li>
</ol>

<ol><li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+plant+consumption+predicts+red+colobus+monkey+%28Procolobus+rufomitratus%29+hormonal+state+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior.</a> Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).</li>
<li>Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+phytoestrogens+in+primate+ecology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution.</a> International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).</li>
<li>DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+plant+defensive+chemistry+on+nutrient+availability+predict+reproductive+success+in+a+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal.</a> Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).</li>
<li>Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWasserman%2C+MD+%22Primate+Diet+%26+Nutrition%22">Primate Diet & Nutrition</a>. Lambert, J. E., Rothman, J. M. , University of Chicago Press. (2020).</li>
<li>Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intergroup+variation+in+oestrogenic+plant+consumption+by+black-and-white+colobus+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Ecology%22%5BJournal%5D)">Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys.</a> African Journal of Ecology. , (2019).</li>
<li>Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+breeding+problem+of+sheep+on+subterranean+clover+pastures+in+Western+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia.</a> Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).</li>
<li>Tubbs, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenicity+of+captive+southern+white+rhinoceros+diets+and+their+association+with+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility.</a> General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).</li>
<li>Shen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+the+influences+of+diosgenin+on+aging+ovarian+reserve+and+function+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model.</a> European Journal of Medical Research. 22 (1), 42(2017).</li>
<li>Boué, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+estrogenic+effects+of+legume+extracts+containing+phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).</li>
<li>Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+interaction+with+estrogen+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor interaction with estrogen response elements.</a> Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).</li>
<li>Nishikawa, J. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+screening+methods+for+chemicals+with+hormonal+activities+using+interaction+of+nuclear+hormone+receptor+with+coactivator%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Human+Estrogen+Receptor+Beta+%28ERb%3B+ESR2%3B+NR3A2%29+Reporter+Assay+System%22">Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System</a>. , Indigo Biosciences. State College, PA. (2020).</li>
<li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+plant+foods+of+red+colobus+monkeys+and+mountain+gorillas+in+uganda%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physical+Anthropology%22%5BJournal%5D)">Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda.</a> American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).</li>
<li>Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+activation+of+estrogen+receptor-%CE%B2+target+genes+by+3%2C+3%27-diindolylmethane%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3'-diindolylmethane.</a> Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).</li>
<li>Whitten, P. L., Patisaul, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+and+interassay+comparisons+of+phytoestrogen+action%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action.</a> Environmental Health Perspectives. 109, suppl 1 5-20 (2001).</li>
<li>Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDi+Gioia%2C+F+%22Advances+in+Food+and+Nutrition+Research%22">Advances in Food and Nutrition Research</a>. , Academic Press Inc. (2019).</li>
<li>Lutz, I., Kloas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphibians+as+a+model+to+study+endocrine+disruptors%3A+I.+Environmental+pollution+and+estrogen+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding.</a> Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).</li>
<li>Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+Photochemistry+of+Isoflavone+Phytoestrogens%3A+Degradation+Kinetics+and+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways.</a> Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).</li>
<li>Jeng, Y. -J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+estrogen+receptor-alpha-mediated+nongenomic+actions+of+phytoestrogens+in+GH3%2FB6%2FF10+pituitary+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Signaling%22%5BJournal%5D)">Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells.</a> Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).</li>
<li>Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Phytoestrogens.</a> Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).</li>
<li>Kuiper, G. G. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Estrogenic+Chemicals+and+Phytoestrogens+with+Estrogen+Receptor+%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β.</a> Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).</li>
<li>Wasserman, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWasserman%2C+MD+%22Feeding+on+Phytoestrogens%3A+Implications+of+Estrogenic+Plants+for+Primate+Ecology%22">Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology</a>. , UC Berkeley. (2011).</li>
<li>Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+consequences+of+developmental+phytoestrogen+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure.</a> Reproduction. 143 (3), Cambridge, England. 247-260 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בדיקת כתב ERβ שפותחה כדי לסנן בנפרד סוכני תרופות מתאים גם לסינון מזונות צמחיים עבור phytoestrogens פעיל ביולוגית באמצעות ERβ. שיקולים חשובים בפרוטוקול כוללים טיפול בדגימות הצמח בזהירות: יש לייבש במהירות חומר צמחי טרי כדי למנוע דפוס או השפלה ביולוגית אחרת, ויש להרחיקו מהאור כדי למנוע פוטוליזה של התרכובות18. פרוטוקול הבדיקה12 שסופק על ידי היצרן ברור וזקוק למעט מאוד שינויים למטרות סינון. העקומה הסטנדרטית שהציע היצרן שונתה בפרוטוקול זה כדי להגדיל את מספר הנקודות הנופלות בטווח ה...

צמחים הם מקור הכרחי של מזון עבור בעלי חיים רבים, מתן קלוריות וחומרים מזינים קריטיים להישרדות, רבייה, צמיחה, התפתחות, והתנהגות1. צמחים מייצרים אלפי כימיקלים, רבים כהתאמות לצמיחה שלהם, תחזוקה סטומטית, ורבייה. תרכובות אחרות, נחשב מטבוליטים משניים צמח (PSMs), יש פונקציות כי הם פחות ברורים, אם כי חלקם רעילים וסביר לשמש כהגנה מפני אוכלי עשב וטפילים (למשל, אלקלואידים, טאנינים)2,3. חלק מכימיקלים אלה יש את היכולת להשפיע על תהליכים פיזיולוגיים ארוכי טווח בבעלי חיים, כגון תפקוד אנדוקריני, אם כי מדוע אלה פיטוכימיקלים האנדוקרינית פעיל אינטראקציה עם המערכת האנדוקרינית החולייתנית עדיין לא ברור2,4.
Phytoestrogens, פיטוכימיקלים האנדוקרינית-פעילה הנחקרת ביותר, הם PSMs פוליפנוליים המחקים אסטרוגנים מבניים ופונקציונליים, המקיימים אינטראקציה ישירה עם ציר האשכים ההיפותלומו-יותרת המוח של המערכת האנדוקרינית החולייתנית5. בליעה של phytoestrogens בתזונת האדם קשורה להגנה מפני כמה סוגי סרטן, מחלות לב, תסמיני גיל המעבר, אם כי השפעות אחרות כוללות בעיות פוריות. למעשה, ההשפעות הפיזיולוגיות של תרכובות אלה התגלו בשנות הארבעים כאשר פוריות בכבשים יוחסה למרעה שלהם על תלתן עשיר בפיטואסטרוגן (Trifolium subterrareum)6. כאשר לבלוע, phytoestrogens יכול לעבור לתאים ולחקות את ההשפעות של אסטרוגן. בעוד phytoestrogens היו השפעות שליליות על פוריות הכבשים, הקשר בין phytoestrogens ופיזיולוגיה אינה פשוטה. כמו כבשים, קרנף לבן דרומי להפגין רגישות תרכובות אסטרוגניים במזון נגזר כמויות גבוהות של סויה אספסת. בנות של נקבות האכילו דיאטה זו במהלך ההריון נוטים פחות להתרבות7. עם זאת, מחקרים אחרים הראו כי phytoestrogens עשוי להיות השפעות חיוביות גם כן, כולל התבגרות של זקיקי השחלות בעכברים מבוגרים8, מניעת סרטן מסוימים, פעילות נוגדת חמצון, ואפקטים antiproliferative9.
רוחב ההשפעות של phytoestrogens אינם מפתיעים בהתחשב בכך אסטרוגנים להשפיע על מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות, כולל צמיחה, פיתוח, ויסות של מערכת הרבייה ומערכת העצבים המרכזית10. למרות שיש מנגנונים רבים של פעולה, phytoestrogens לעתים קרובות יש את היכולת לשנות, לשפר, או לשבש איתות אסטרוגן באמצעות היכולת שלהם לפעול כמו ליגנדים עבור קולטני אסטרוגן תוך גרעיני אלפא בטא (ERα ו ERβ). פיטואסטרוגנים רבים יש מבנה טבעת פנולי דומה אסטרוגנים המאפשר להם לקשור קולטני אסטרוגן. אלה עם פעילות אסטרוגניים אגוניסטי לתפקד כמו אסטרוגן, יצירת קומפלקס פעיל ER-ligand שיכול לעמעם ולקשור אלמנט תגובת אסטרוגן (ERE) ולהפעיל שעתוקגנים 11. לכן, אסטרוגנים ופיטואסטרוגנים לווסת את פעילות התא ואת תפקודי המערכת באמצעות מעשיהם כגורמי שעתוק.
כאן אנו מציגים את השימוש החדשני של מבחנה מבוססת תאים כדי לסנן תמציות צמחים לנוכחות של תרכובות שיש להם פעילות ביולוגית אסטרוגניים. אסאי זה משתמש בתאי CHO השחלות אוגר סיניים מהונדסים לבטא מאוד ERβ, אשר כבר חצו עם גחלילית(Photinus pyralis)גן לוציפראז מקושר מקדם ERE12. כאשר קיימים תרכובות אסטרוגניים, הם נקשרים למיון, מצטמצמים ונקשרים ל- ERE, מה שמוביל לתעתיק של גן לוציפראז. עם הוספת פתרון מצע, לוציפראז מזרז תגובה המובילה לפליטת פוטון. לכן, דגימות חיוביות לייצר דגימות אור ושליליות לא.
זה מבחנים זמינים מסחרית מבטל את הצורך במעבדות כדי transfect את תאי היונקים עם הגן הכתב קולטןאסטרוגן 13,14, אשר היה יציב ומשתנה ביעילות. ה- Assay מספק פלטפורמת transfection יציבה המאפשרת לקבוע במהירות ופשוט אם לצמח יש פעילות אסטרוגניים באמצעות כריכת קולטן.
אנו בודקים את ההשערה כי פולי סויה יש פעילות אסטרוגניים גבוהה יותר מאשר כל מזונות אחרים בהתחשב בריכוזים הידועים שלהם של איזופלבונים אסטרוגניים15 באמצעות מזונות אנושיים ממכולת מקומית.

<table><tbody><tr><td>1000 ומיקרו; פיפטה</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>20 ומיקרו; פיפטה</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>200 ומיקרו; L פיפטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &#176; אמבט</td><td></td><td></td><td></td>מים</tr><tr><td>37 &#176;, חממה לחה 5% CO2 חממה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזון</td><td></td><td></td><td></td>אנליטי</tr><tr><td>תרבית תאים מדורגת קולט אדים</td><td></td><td></td><td></td>זרימה למינרית</tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגן מדיה חד פעמי,</td> מערכת סינון טפטוף סטרילית <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות</td><td></td><td></td> Erlenmeyer <td>125 מ"ל ו-250 מ"ל</td></tr><tr><td>HPLC מתנול</td><td></td><td></td><td></td>בדרגת</tr> ER<tr><td></td>&beta אנושי;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מערכת בדיקת מדווח, 1 x 96 בארות מבחנים בפורמט</td><td>Indigo Biosciences</td><td>ערכת</td><td>בדיקה IB00411 - מנתחת 24 דגימות בתוספת</td></tr><tr><td>ליופילייזר</td><td></td><td></td><td></td></tr> עקומה <tr><td>סטנדרטית שייקר מסלולי פיפטה</td><td></td><td></td><td></td>רב ערוצי</tr><tr><td>לקריאת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת לומינומטר</td><td></td><td></td><td>לדוגמא מאייד</td></tr> <tr><td></td><td>רוטורי Bioteck Synergy HTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תחתונות עגולות</td><td></td><td></td><td>50 מ"ל ו-300 מ"ל</td></tr><tr><td>צינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים או אגני</td><td></td><td></td><td></td>מדיה רב-ערוציים סטריליים</tr><tr><td>קצות</td><td></td><td></td> סטריליים <td>200 ומיקרו; L ו-1000 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>Whatman כיתה 1 שקיות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>נייר מערבולת-פאק</td><td>שקיות פוליאתילן סטריליות</td></tr></tbody></table>

הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

צמחים הם מקור מזון לבעלי חיים רבים, והם יכולים לייצר אלפי כימיקלים. חלק מהתרכובות הללו משפיעות על תהליכים פיזיולוגיים בחולייתנים הצורכים אותם, כגון תפקוד אנדוקריני. Phytoestrogens, פיטוכימיקלים האנדוקרינית-פעילה הנחקרת ביותר, אינטראקציה ישירה עם ציר האשכים ההיפותלמו-יותרת המוח של המערכת האנדוקרינית החולייתנית. כאן אנו מציגים את השימוש החדשני של מבחנה מבוססת תאים כדי לסנן תמציות צמחים לנוכחות של תרכובות שיש להם פעילות ביולוגית אסטרוגניים. מבחנה זו משתמשת בתאי יונקים מהונדסים לבטא מאוד בטא קולטן אסטרוגן (ERβ) וכי כבר transfected עם גן לוציפראז. חשיפה לתרכובות עם פעילות אסטרוגניים גורמת לתאים לייצר אור. בדיקה זו היא דרך אמינה ופשוטה לבדוק פעילות אסטרוגניים ביולוגיים. יש לו מספר שיפורים על פני מבחנים חולפים חולפים, בעיקר, קלות השימוש, היציבות של התאים, ואת הרגישות של ההסתערות.

עשרים ושתיים תמציות של פירות וירקות נפוץ למצוא דיאטות אנושיות הוקרנו לנוכחות של תרכובות אסטרוגניים. מגוון רחב של מזונות היו assayed, כולל קטניות, כגון פולי סויה, אפונה שלג, אפונה הצמד, כמו משפחת אפונה הוא מקור ידוע של phytoestrogens16, כמו גם תאנים, תמרים, תירס, גזר, תפוחים, בננות, תותים, עגבניות, כרוב, כרוב. תרכובות משבשות אנדוקריניות נמצאות בחומרים נפוצים (למשל, פלסטיק וחומרי הדברה) וחלקן פעילות ביולוגית באמצעותERs 17. במידת האפשר, הן פריטים אורגניים ולא אורגניים היו assa...

יש לנו אופטימיזציה של קולטן אסטרוגן זמין מסחרית β הכתב assay עבור הקרנת מזונות פרימטים אנושיים ולא אנושיים לפעילות אסטרוגניים. אימתנו את ההסתעפות הזו בכך שהראינו שסויה ידועה של מזון אסטרוגניים רושמת גבוה, בעוד מזונות אחרים אינם מראים פעילות.

הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

אנו משתמשים בבדיקה זו כדי להעריך אם מזונות צמחיים מכילים פיטוסטריודים, שיכולים להשפיע על תהליכים פיזיולוגיים בבעלי חיים, כמו גם על התנהגות והצלחת רבייה. בדיקה זו מספקת שיטה פשוטה ואמינה לקביעה אם צמחים מייצרים תרכובות אסטרוגניות בעלות פעילות ביולוגית. שיטה זו פותחה בתחילה כדי לסנן תרופות בעלות פעילות קסנואסטרוגן ליישומים ברפואה.לדוגמה, עיכוב התפשטות תאים. אנו משתמשים בו כדי לספק תובנות על אקולוגיה ואבולוציה של פרימטים. חשוב להתאמן בעבודה עם טכניקה אספטית בסביבה נקייה לפני ניסיון בדיקה זו, מכיוון שהיא רגישה מאוד לזיהום.התחל בייבוש בהקפאה של פריטי הצמחים הטריים עם הליופילייזר, ולאחר מכן טחן אותם דק באמצעות טחנת טחינה עם רשת של 0.85 מילימטר. אחסן את הדגימות הטחונות בשקיות בחושך עד למיצוי. כדי לחלץ פיטוסטרואידים פוטנציאליים בצמחים, הוסף דגימה מיובשת לבקבוק בגודל מתאים, ואז במתנול בדרגת HPLC.מכסים את תמיסת המתנול הצמחית בנייר אלומיניום ומגדירים אותה להסתובב ב-100 סל"ד למשך שלושה ימים על שייקר מסלולי. לאחר שלושה ימים, השתמש בנייר סינון כדי לשפוך את הסופרנט ולתוך מערכת סינון טפטוף. יבש את תמצית הצמח עם מאייד סיבובי עד שהיא מסמיכה, אך ניתנת למזיגה בבקבוק תחתון עגול של 300 מיליליטר.יוצקים את הדגימה לבקבוק של 50 מיליליטר ושוטפים את הבקבוק הגדול בכמות קטנה של מתנול, ואז ממשיכים לייבש את הדגימה בבקבוק הקטן עד שהמתנול מתאדה לחלוטין. בסיום, שקלו את שאריות הדגימה באיזון אנליטי ורשמו את המסה. ממיסים את תמצית הצמח ב-DMSO בריכוז של 0.1 גרם תמצית לשני מיליליטר DMSO ומערבלים אותה עד להומוגניזציה.DMSO אינו רעיל בפני עצמו, אך הוא כלי המאפשר לחומרים אחרים לחצות ממברנות. מכיוון שאיננו יודעים אם הצמחים שלנו מכילים כימיקלים רעילים, מתייחסים לכולם כאילו הם מסוכנים. אל תאפשר לתמיסה לגעת בעור, החלף כפפות אם מזוהמות, ולנעול נעליים עבות וסגורות ומעילי מעבדה.אחסן את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס בבקבוקוני זכוכית ענבר עד שתהיה מוכנה לשימוש. מערבל את הדגימות, ולאחר מכן הוסף ארבעה מיקרוליטר מכל דגימה ל-496 מיקרוליטר של מדיום סינון תרכובות כדי להניב תמיסת DMSO של 0.8%. יש לחטא את המשטח החיצוני של צינור מדיום לשחזור תאים שחומם מראש עם אתנול 70% ולהעביר 10 מיליליטר מהמדיום לתוך צינור של תאי דיווח קפואים כדי להפשיר אותם.סגור את הצינור של תאי המדווח והנח אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות. לאחר החזרת התאים מאמבט המים, הפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים כדי לפרק אגרגטים של תאים ולייצר תרחיף הומוגני, ולאחר מכן נקה את פני הצינור עם 70% אתנול. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוציא 100 מיקרוליטר מתרחיף תא המדווח לכל באר של צלחת 96 בארות, ולאחר מכן לחלק 100 מיקרוליטר של דגימות בשלוש פעמים לבארות המתאימות.דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 22 עד 24 שעות. רגע לפני סיום הדגירה של הצלחת הסר את מצע הזיהוי ואת מאגר הזיהוי מהמקרר והנח אותם באזור תאורה חלשה עד לאיזון לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הפוך בעדינות כל צינור כדי לערבב את התמיסות. מיד לפני השלמת הדגירה של הצלחת, שפכו את כל תכולת מאגר הזיהוי לתוך הצינור של מצע הזיהוי כדי ליצור מגיב לזיהוי לוציפראז.מערבבים את הצינור בעדינות כדי לא לייצר קצף. השליכו את תכולת לוחית הדגימה למיכל פסולת לא מתאים והקישו עליה בעדינות על מגבת נייר סופגת נקייה כדי להסיר את הטיפות האחרונות מהבארות. הוסף 100 מיקרוליטר של מגיב זיהוי הלוציפראז לכל באר ואפשר ללוחית הבדיקה לנוח בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ולאחר מכן כמת את הזוהר באמצעות לומינומטר קריאת צלחת 96 בארות.22 תמציות של פירות וירקות הנמצאים בדרך כלל בתזונה אנושית נבדקו לנוכחות תרכובות אסטרוגניות. פעילות אסטרוגנית מוצגת בצורה איכותית סידורית של פעילות גבוהה, בינונית, נמוכה או ללא פעילות. פולי סויה אורגניים ולא אורגניים נבדקו ברמות פעילות גבוהות, בעוד שכל שאר פריטי הפירות והירקות לא רשמו פעילות.השוואת תוצאות פולי הסויה לעקומה הסטנדרטית מראה גם שיש להם רמות פעילות אסטרוגניות גבוהות בריכוז זה. תמצית פולי סויה, מקור חזק ידוע לאיזופלבונים, דאידזין וגניסטאין, שימשה גם לקביעת הדילול שהניב אות של 50% למקסימום. תמצית זו דורשת פי 422 יותר דילול כדי לייצר מחצית מהאות של פרוטוקול הדילול הסטנדרטי שלנו.דגימות שזוהו עם פעילות יכולות להישלח לניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לזהות את הכימיקלים הפעילים. באמצעות שיטה אנטגוניסטית, יכולנו גם לקבוע אם המזון הצמחי מכיל כימיקלים המפחיתים את הקישור והפעילות של אסטרוגנים אנדוגניים. טכניקה זו מאפשרת לנו לקדם את ההבנה שלנו עד כמה מזונות אסטרוגניים נפוצים בתזונה של פרימטים, כמו גם כיצד צריכת פיטואסטרוגנים משפיעה על הפיזיולוגיה וההתנהגות כאשר הבדיקה משולבת עם ניתוחי הורמונים צואתיים ונתוני שדה.

screening-for-phytoestrogens-using-cell-based-estrogen-receptor

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מתאר בדיקת כתב מבוססת תאים כדי לקבוע את הפעילות האסטרוגנית של תרכובות שמקורן בצמח. תרכובת בעלת פעילות דמוית אסטרוגן מחקה את קשירתה לקולטני אסטרוגן ומניעה שעתוק גנים של אנזים מדווח במורד הזרם. אנזים הכתב מייצר ביולומינסנציה בתגובה, המציינת את הפעילות האסטרוגנית של התרכובת.

בדיקת פעילות קולטן-מדווח אסטרוגן לבדיקת פעילות פיטואסטרוגן אסטרוגנית

מולקולרי איתות דרך גם אסטרוגן ומייקרו RNA הם קריטיים בהתפתחות סרטן השד וצמיחה. אסטרוגן מפעיל את קולטני האסטרוגן, שהם גורמי שעתוק. גורמי שעתוק רבים יכולים לווסת את הביטוי של מיקרו RNA, והוא יכול להיות צדודית מיקרו RNA מוסדר אסטרוגן תוך שימוש בטכניקות שונות בקנה מידה גדולה.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

שילוב נתונים מניסויי ריצוף גנומי וניסויים מטבולומיים הוא אתגר.  במאמר זה אנו מדווחים, לראשונה, על ייצור, ניתוח ואינטגרציה של נתוני טרנסקריפטום, ציסטרום ומטבולום מתאי סרטן השד שטופלו באסטרדיול.

ביולוגית מערכות ויסות חילוף חומרים על ידי איתות קולטן אסטרוגן לסרטן השד

תרכובות לשבש האנדוקרינית (EDC) להוות סיכון ממשי של הסביבה המימית. מתקני טיהור שפכים עירוניים הם תורמים עיקריים העצמה אסטרוגניים של מים עיליים. המתודולוגיה הניתן במאמר זה מאפשר הערכה של היעילות וההתאמה של תהליכי טיפול בשפכים ביחס להסרת EDC.

שימוש בסוללה של שיטות כימיות Ecotoxicological עבור הערכת היעילות של תהליכי טיפול בשפכים להסיר אסטרוגניים און

פרוטוקול לבדיקת פעילות אנדוקרינית בתמציות אורגניות של דגימות מים, כולל שפכים מטופלים ומים עיליים (מקבלים), הותאם באמצעות בדיקות ביולוגיות של טרנסאקטיביות במבחנה.

סיקור הפעילות האנדוקרינית במים באמצעות מסחרי-זמין<em&gt; במבחנה</em&gt; Transactivation bioassays

מאמר זה מציג על המסך אסטרוגן שמרים ממוטבת עבור לכימות ליגנדים במוצרי טיפוח אישי (PCPs) אשר כובלים אסטרוגן קולטני אלפא (ERα) ו/או בטא (ERβ). השיטה משלבת שתי אפשרויות מצע ערכי צבע מוחלטים, של שישה ימים דגירה בקירור לשימוש בקורסים לתואר ראשון, כלים סטטיסטיים לניתוח נתונים.

זיהוי ליגנדים אסטרוגניים במוצרי טיפוח אישי באמצעות של שמרים אסטרוגן מסך ממוטב עבור המעבדה הוראה לתואר ראשון

אנו מציגים שיטה לניתוח את 4-הידרוקסי-טמוקסיפן-תלוי הקולטן אלפא ליגנד מחייב תחום dimerization פעילות האסטרוגן שימוש בתרבית של שני-היברידית וזמינותו.

זיהוי ליגנד מחייב תחום פעילות Dimerization אלפא קולטן אסטרוגן באמצעות וזמינותו שני-היברידית יונקים

קלינית, מחסור באסטרוגן בנשים בגיל המעבר עלול להחמיר את השכיחות של שיבוש השומנים טרשת עורקים. הקמנו במודל למחסור באסטרוגן vivo על-ידי כריתת אופוקטומיה דו צדדית באמצעות חתך כפול-רוחבי-לרוחב ב-apoE-/- עכברים. מודל העכבר ישים לסינון טיפולי אסטרוגן אקסוגני של בעיות לב וכלי דם לאחר גיל המעבר.

A In Vivo אסטרוגן מחסור בעכבר מודל עבור ההקרנה הטיפולים האסטרוגן אקסודוגני של בעיות לב וכלי דם אחרי גיל המעבר

הנוכחי הוא פרוטוקול מפורט עבור השימוש של עוברי הדגים Tg (vtg1: mCherry) לאיתור אפקטים אסטרוגניים. הפרוטוקול מכסה את התפשטות הדג והטיפול של עוברים, ומדגיש את האיתור, תיעוד, והערכה של אותות פלורסנט הנגרמת על ידי תרכובות משבשים האנדוקרינית (EDC).

שימוש Tg (Vtg1: mcherry) עוברי דג Zebrafish כדי לבדוק את ההשפעות אסטרוגניים של תרכובות משבשי האנדוקרינית

פלואורסצנטיות RNA מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH) היא שיטה לכימות מדויק של רמות ולוקליזציה של RNAs ספציפיים ברמת התא הבודד. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקולי המעבדה המאומתים שלנו לעיבוד ספסל רטוב, הדמיה וניתוח תמונה לכימות תאים בודדים של RNAs ספציפיים.

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

למדו לסנן פיטואסטרוגנים במזונות צמחיים באמצעות מבחן דיווח לקולטן אסטרוגן β בתאים. השיטה מאפשרת לזהות פעילות אסטרוגנית ביולוגית ולחקור השפעות תזונתיות על פרימטים.

הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay

גלה סרטונים נוספים