הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay

אנו משתמשים בבדיקה זו כדי להעריך אם מזונות צמחיים מכילים פיטוסטריודים, שיכולים להשפיע על תהליכים פיזיולוגיים בבעלי חיים, כמו גם על התנהגות והצלחת רבייה. בדיקה זו מספקת שיטה פשוטה ואמינה לקביעה אם צמחים מייצרים תרכובות אסטרוגניות בעלות פעילות ביולוגית. שיטה זו פותחה בתחילה כדי לסנן תרופות בעלות פעילות קסנואסטרוגן ליישומים ברפואה.

לדוגמה, עיכוב התפשטות תאים. אנו משתמשים בו כדי לספק תובנות על אקולוגיה ואבולוציה של פרימטים. חשוב להתאמן בעבודה עם טכניקה אספטית בסביבה נקייה לפני ניסיון בדיקה זו, מכיוון שהיא רגישה מאוד לזיהום.

התחל בייבוש בהקפאה של פריטי הצמחים הטריים עם הליופילייזר, ולאחר מכן טחן אותם דק באמצעות טחנת טחינה עם רשת של 0.85 מילימטר. אחסן את הדגימות הטחונות בשקיות בחושך עד למיצוי. כדי לחלץ פיטוסטרואידים פוטנציאליים בצמחים, הוסף דגימה מיובשת לבקבוק בגודל מתאים, ואז במתנול בדרגת HPLC.

מכסים את תמיסת המתנול הצמחית בנייר אלומיניום ומגדירים אותה להסתובב ב-100 סל"ד למשך שלושה ימים על שייקר מסלולי. לאחר שלושה ימים, השתמש בנייר סינון כדי לשפוך את הסופרנט ולתוך מערכת סינון טפטוף. יבש את תמצית הצמח עם מאייד סיבובי עד שהיא מסמיכה, אך ניתנת למזיגה בבקבוק תחתון עגול של 300 מיליליטר.

יוצקים את הדגימה לבקבוק של 50 מיליליטר ושוטפים את הבקבוק הגדול בכמות קטנה של מתנול, ואז ממשיכים לייבש את הדגימה בבקבוק הקטן עד שהמתנול מתאדה לחלוטין. בסיום, שקלו את שאריות הדגימה באיזון אנליטי ורשמו את המסה. ממיסים את תמצית הצמח ב-DMSO בריכוז של 0.1 גרם תמצית לשני מיליליטר DMSO ומערבלים אותה עד להומוגניזציה.

DMSO אינו רעיל בפני עצמו, אך הוא כלי המאפשר לחומרים אחרים לחצות ממברנות. מכיוון שאיננו יודעים אם הצמחים שלנו מכילים כימיקלים רעילים, מתייחסים לכולם כאילו הם מסוכנים. אל תאפשר לתמיסה לגעת בעור, החלף כפפות אם מזוהמות, ולנעול נעליים עבות וסגורות ומעילי מעבדה.

אחסן את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס בבקבוקוני זכוכית ענבר עד שתהיה מוכנה לשימוש. מערבל את הדגימות, ולאחר מכן הוסף ארבעה מיקרוליטר מכל דגימה ל-496 מיקרוליטר של מדיום סינון תרכובות כדי להניב תמיסת DMSO של 0.8%. יש לחטא את המשטח החיצוני של צינור מדיום לשחזור תאים שחומם מראש עם אתנול 70% ולהעביר 10 מיליליטר מהמדיום לתוך צינור של תאי דיווח קפואים כדי להפשיר אותם.

סגור את הצינור של תאי המדווח והנח אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות. לאחר החזרת התאים מאמבט המים, הפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים כדי לפרק אגרגטים של תאים ולייצר תרחיף הומוגני, ולאחר מכן נקה את פני הצינור עם 70% אתנול. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוציא 100 מיקרוליטר מתרחיף תא המדווח לכל באר של צלחת 96 בארות, ולאחר מכן לחלק 100 מיקרוליטר של דגימות בשלוש פעמים לבארות המתאימות.

דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 22 עד 24 שעות. רגע לפני סיום הדגירה של הצלחת הסר את מצע הזיהוי ואת מאגר הזיהוי מהמקרר והנח אותם באזור תאורה חלשה עד לאיזון לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הפוך בעדינות כל צינור כדי לערבב את התמיסות. מיד לפני השלמת הדגירה של הצלחת, שפכו את כל תכולת מאגר הזיהוי לתוך הצינור של מצע הזיהוי כדי ליצור מגיב לזיהוי לוציפראז.

מערבבים את הצינור בעדינות כדי לא לייצר קצף. השליכו את תכולת לוחית הדגימה למיכל פסולת לא מתאים והקישו עליה בעדינות על מגבת נייר סופגת נקייה כדי להסיר את הטיפות האחרונות מהבארות. הוסף 100 מיקרוליטר של מגיב זיהוי הלוציפראז לכל באר ואפשר ללוחית הבדיקה לנוח בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ולאחר מכן כמת את הזוהר באמצעות לומינומטר קריאת צלחת 96 בארות.

22 תמציות של פירות וירקות הנמצאים בדרך כלל בתזונה אנושית נבדקו לנוכחות תרכובות אסטרוגניות. פעילות אסטרוגנית מוצגת בצורה איכותית סידורית של פעילות גבוהה, בינונית, נמוכה או ללא פעילות. פולי סויה אורגניים ולא אורגניים נבדקו ברמות פעילות גבוהות, בעוד שכל שאר פריטי הפירות והירקות לא רשמו פעילות.

השוואת תוצאות פולי הסויה לעקומה הסטנדרטית מראה גם שיש להם רמות פעילות אסטרוגניות גבוהות בריכוז זה. תמצית פולי סויה, מקור חזק ידוע לאיזופלבונים, דאידזין וגניסטאין, שימשה גם לקביעת הדילול שהניב אות של 50% למקסימום. תמצית זו דורשת פי 422 יותר דילול כדי לייצר מחצית מהאות של פרוטוקול הדילול הסטנדרטי שלנו.

דגימות שזוהו עם פעילות יכולות להישלח לניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לזהות את הכימיקלים הפעילים. באמצעות שיטה אנטגוניסטית, יכולנו גם לקבוע אם המזון הצמחי מכיל כימיקלים המפחיתים את הקישור והפעילות של אסטרוגנים אנדוגניים. טכניקה זו מאפשרת לנו לקדם את ההבנה שלנו עד כמה מזונות אסטרוגניים נפוצים בתזונה של פרימטים, כמו גם כיצד צריכת פיטואסטרוגנים משפיעה על הפיזיולוגיה וההתנהגות כאשר הבדיקה משולבת עם ניתוחי הורמונים צואתיים ונתוני שדה.