Name: אינדוקציה של שינוי תאי לטומנאנואל באמצעות הזרקה בתוך החלק האחר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: למד שיטת הזרקה תוך-חדרית עם מחט כפופה לעריכת גנים ספציפית בתאי הלפטומנינגיאל בעכברים. טכניקה זו מאפשרת מחקר תפקודי במחלות נוירולוגיות תוך מזעור נזק לרקמות עצביות סמוכות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים מן המועצה למחקר שוודי, האגודה לסרטן שוודי, הקרן השבדית למחקר אסטרטגי, קנוט ו אליס וולנברגים Stiftelse ואת תוכנית המחקר האסטרטגי בתאי גזע ורפואה רגנרטיבית Karolinska (StratRegen).

הליכים כירורגיים שהוצגו בזאת אושרו על ידי Stockholms Norra Dnförssetiska Nämnd ובוצע בהסכמה עם מפרטים שסופקו על ידי מכון המחקר (Karolinska מכון, שוודיה).
הערה: הזרקת התאיים ניתן להתאים בגמישות למטרות מחקר מרובים. אנו מציגים להלן הליך שפותח ביעילות תווית לטומטואנגים לפני מיפוי הגורל מבוסס על הזרקה של אנדוקסיפן בקו העכבר הטרנסגניים נושאת R26R-tdTomato12 ו creer, האחרון תחת Cx30 יזם13. ניתן להשיג התוויות של אוכלוסיה זו של תאים באמצעות הזרקה של מבנים ויראליים באמצעות אותו ההליך המתואר להלן. לבסוף, גישה זו יכולה להיות מועסק עבור מעקב אחר זרימת נוזל מוחי שדרתי, על ידי אינפוזיה של מעוקב פלורסנט.
1. הכנת מערכת ההזרקה
הערה: אנו ממליצים לבצע את ההליך בחדר ניתוח מתאים, ובתנאים אספטי. כלים כירורגיים יכולים להיות מעוקר באמצעות חום (החיטוי, מעקר זכוכית מחוטא) או מחוטא באמצעות חיטוי כימי ברמה גבוהה אם הם רגישים לחום. לשטוף את המכשירים לפני השימוש בעת העסקת חיטוי כימי או לאפשר להם להתקרר כאשר מחוטא עם חום.
<ol><li>באמצעות מלקחיים, לכופף את המחט של מזרק הזריקה כדי 30 ° ב 3 מ"מ מהקצה. הערה: השתמש מזרקים המילטון עם מחט משופע 30 G.</li>
	<li>הכינו 1 מ"ג/mL של פתרון אנדוקסיפן, מדולל 10% dmso ו-ילוי רקע את המזרק עם המחט הכפופה. הערה: מנהל 5 μL של המתחם כדי להבטיח חשיפה נרחבת של תאים ממנגים בעכבר C57Bl/6j למבוגרים (ca. 25-30 g), למרות ניסויים פיילוט כי בדיקת ריכוזים שונים אמצעי אחסון הזרקה עשוי להיות נחוץ בעת טיפול בבעלי חיים של גילאים שונים וזנים.</li>
	<li>כוונן את מחזיק ראש העכבר כך שפיסת הפה תהיה בערך 30 ° מהמשטח של השולחן הכירורגי. הערה: ניתן להשתמש במסגרת סטריאוטקטיקה עם קיבוע של שלוש נקודות (כלומר, אוזניים ושפה) עבור הליך זה. אולם, במקרה זה, החיה תהיה קבועה רק עם פיסת הפה, בעוד שפסי האוזן יכולים להיות מורחבים תחת העצמות של בעל החיים ולשמש לתמיכה בגוף החיה במהלך ההליך.</li>
</ol>2. אינדוקציה של הרדמה
<ol><li>לזריקות הרדמה, להשתמש בריכוזים ובמצבי הניהול המומלצים על ידי היחידה הוטרינרית במוסד המקומי.</li>
	<li>למכשיר הרדמה, כגון isof, הכינו את יחידת הניהול בהתאם למפרט היצרן.</li>
	<li>. ב -4% לצורך הרדמה</li>
	<li>אספקת אוויר בקצב של 400 mL/min.</li>
	<li>אפשר ליחידת ההרדמה למלא את החדר עם ההרדמה לכמה דקות ולמקם את העכבר בתא לאחר מכן. הערה: עבור הניסויים הנוכחיים, השתמשנו במבוגר (> 2 חודשים ובערך 30 g) עכברים מעבר זכר ונקבה הנושאים Cx30-CreER ו R26R-tdTomato, והתרבו על רקע C57Bl/6j.</li>
	<li>לעקוב אחר החיה במהלך אינדוקציה של הרדמה. דפוס הנשימה אמור להאט כאשר העכבר נמצא תחת הרדמה מלאה.</li>
	<li>הסר את בעל החיים מהתא ובדוק אם הדיכוי של הרפלקס בכף היד מצבטת בעדינות את הכפות האחוריות. הערה: ייתכן כי הרפלקס עדיין קיים אך מתעכב כמה שניות. אם זה המקרה, מניחים את בעל החיים בחדר עד שהדחקה המוחלטת של הרפלקס של הכפה הושגה.</li>
	<li>ניהול כאבים (למשל, Carprofen, 5 מ"ג/ק"ג באמצעות הזרקה תת עורית) כדי לסייע ניהול לאחר הניתוח כאב.</li>
</ol>3. מיקום בעל החיים לפרוצדורה
<ol><li>התקן את ראשו של בעל החיים על מחזיק הראש. כדי לשפר את הנגישות cisterna מגנה, למקם את הגוף של החיה על כ 30 ° מהמשטח של השולחן ואת הראש שכותרתו כלפי מטה, כדי ליצור זווית של 120 ° עם שאר הגוף ולהאריך את גב הצוואר כדי להקל על הגישה לcisterna מגנה (איור 1א).</li>
	<li>הוסיפו מגבות נייר מתחת לבעל החיים כדי לתמוך בגופה לאורך כל התהליך.</li>
	<li>מאובטח משלוח הרדמה דרך פיסת הפה ולהפחית את הריכוז isof, כדי 2.5% ומשלוח האוויר 200 ml/min.</li>
	<li>החלת משחה אופטלמולוגית.</li>
</ol>4. חשיפת הCisterna מגנה
<ol><li>לגלח את העורף של החיה ולחטא את האזור עם 70% אתנול ובטאדין.</li>
	<li>באמצעות מספריים כירורגי, לבצע חתך באמצע הדרך (ca. 7 מ"מ באורך) החל ברמה של עצם העורף והרחבת אותו באופן פוקטילי.</li>
	<li>להפריד בעדינות רקמת חיבור שטחית ושרירי הצוואר משיכת הצידה מן הקו האמצע עם מלקחיים טיפים עדינים. זה יחשוף את קרום ריר מעל הנחת הcisterna מגנה, בצורת משולש הפוך.</li>
	<li>השתמש בחניתות ספיגה סטרילית או בתחבושות כותנה כדי לשלוט על כל דימום התוצאה.</li>
	<li>מיקום מפריד כירורגי קטן כדי לשמור על שרירי הצוואר משכה הצידה ולאפשר ויזואליזציה של cisterna מגנה במהלך ההליך.</li>
</ol>5. הזרקה בתוך ההחדרה
<ol><li>כדי לקבל גישה cisterna מגנה, לזהות את קצה caudal של עצם העורף ולהכניס את המחט כי היה כפוף בעבר מיד מתחת. הערה: תהיה ירידה פתאומית ההתנגדות כמו קרום ריר מנוקב. עם זאת, קצה המחט יחדור מעט מתחת לפני השטח של המננגיאל, תודות לצורתו המכורה.</li>
	<li>לאחר מחורר השכבה, הניחו לקצה העקום של המחט לחדור מתחת לפני השטח הריר על-ידי משיכת המזרק בעדינות כלפי מעלה ובמקביל לגוף החיה, כדי "לחבר" את המחט לגולגולת (ראה איור 1ב). זה יבטיח יציבות טובה יותר ותמנע את המחט מלחדור עמוק יותר, ובכך למנוע את הסיכון של פגיעה המוח החסר הבסיסית או לשד.</li>
	<li>הכנס לאט את התרכובת כדי למנוע הפרעות בזרימה הטבעית של נוזל השידרה. הערה: בהתאם למטרת הניסוי, קצב העירוי עשוי להשתנות. אם שיעור העירוי האיטי והיציב נדרש (למשל, בעת שימוש בהליך למעקב אחר תנועת נוזל השדרה השדרתי), ייתכן שמומלץ להשתמש במערכת מיקרואינפוזיה יצרנית בשילוב עם המזרק.</li>
	<li>לאחר ההזרקה, תן את המחט לנוח באתר 1 דקות ובזהירות להסיר אותו. השתמש מלקחיים עצה עדין כדי לסייע לנסיגה של המחט מן העמדה מכורה שלה. הערה: השימוש במחט דקה (למשל, 30 G) אינו מוביל לנזק משמעותי של קרום המנאינאל, והזרימה הזורמת של נוזל השדרתי. אם יש צורך במידות מחטים גדולות יותר, אנו ממליצים לעצור את דליפת הנוזלים על-ידי הפעלת לחץ באתר ההזרקה באמצעות קצה כותנה סטרילי.</li>
</ol>6. הסכם הליך וטיפול שלאחר הניתוח
<ol><li>להסיר את המפריד ולאפשר לשרירים לחזור למיקום המקורי שלהם הנחת קרום ריר.</li>
	<li>סגרו את חתך העור באמצעות מספר טיפות של דבק ציאנואקרילי. הערה: לחילופין, יש להשתמש בתפרים נספגים (למשל, 5-0 תפרים ולאחר תפר) ולסגור את חתך העור בתפרים מקוטע.</li>
	<li>החל הרדמה מקומית (למשל, 100 μL של 5% לידוקאין) באתר החתך.</li>
	<li>הסר את בעל החיים מן המחזיק ומקום בכלוב נקי ממוקם על כרית חימום. לעקוב אחר בעל החיים עד שהוא חוזר להכרתו. הערה: הנוהל אינו צפוי לגרום לכאב או למצוקה ארוכי-טווח בבעלי החיים. עם זאת, על העכבר להיות מנוטר באופן מדוק עבור הימים הראשונים של הניתוח ואמצעי הסיוע לכאב ניתן לעשות בכל פעם שהוא נראה הכרחי, ובהתאם להמלצות שסיפק היחידה הוטרינרית במוסד שלך.</li>
</ol>

<ol><li>Vanlandewijck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+atlas+of+cell+types+and+zonation+in+the+brain+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature.</a> Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).</li>
<li>Whish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+CSF-brain+barrier%3A+developmentally+controlled+access+to+the+brain+via+intercellular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 16(2015).</li>
<li>Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meninges+as+barriers+and+facilitators+for+the+movement+of+fluid%2C+cells+and+pathogens+related+to+the+rodent+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).</li>
<li>Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+morphogenic+signaling+initiated+by+the+meninges+controls+corpus+callosum+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation.</a> Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).</li>
<li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139 (3), 597-609 (2009).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenic+Radial+Glia-like+Cells+in+Meninges+Migrate+and+Differentiate+into+Functionally+Integrated+Neurons+in+the+Neonatal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex.</a> Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).</li>
<li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces%3A+a+role+for+connexins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li>
<li>Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisterna+Magna+Injection+in+Rats+to+Study+Glymphatic+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function.</a> Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).</li>
<li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes%2C+including+amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li>
<li>Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+journey+into+the+brain%3A+insight+into+how+bacterial+pathogens+cross+blood-brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+intersectional+targeting+of+neural+sensors+and+effectors+with+high+specificity+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance.</a> Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).</li>
<li>Slezak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+conditional+gene+manipulation+in+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells.</a> Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).</li>
<li>Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Neisseria+meningitidis+with+cells+of+the+human+meninges%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges.</a> Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).</li>
<li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meningococcal+ABC-Type+L-glutamate+transporter+GltT+is+necessary+for+the+development+of+experimental+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).</li>
<li>Ricci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+matrix+metalloproteinases+attenuates+brain+damage+in+experimental+meningococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis.</a> BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

הפרוטוקול המתואר כאן מציג הליך פשוט וברור לתייג תאים לטומאנציאל מיפוי הגורל. אנו משתמשים הזרקה תאיים של אנדוקסיפן, מטבוליט פעיל של טממוקסיפן, כדי לגרום לביטוי של כתבת פלורסנט tdTomato ב Cx30-CreER; . R26R. עכברים12,13-
לעומת פרוטוקולים אחרים המשמשים לקבלת גישה לנוזל שדרתי באמצעות cisterna מגנה9, הגישה שלנו מבטיחה מנהל ידני בטוח הודות לשימוש של מחט מכופף כי ניתן לייצב את עצם העורף של הגולגולת. לאחר הקרום הריר של ...

תאים לטומאננטאל הם האוכלוסייה הדומה ביותר של תאים מאורגנים בשכבה דקה על ידי הנחת המוח וביטוי גנים מעורבים קולגן הקישור (g., dcn ו לאם), ובהקמת מחסום מאנקרום המוח (g, Cldn11)1,2. תאים לטומניניאל מעורבים במגוון רחב של תפקודים פיזיולוגיים, החל משליטה קפדנית על ניקוז נוזל השדרה השדרתי3 להדרכה של ושלתי עצביים במוח המתפתח4,5. מחקר שנערך לאחרונה הציע גם כי לפטטואנגים ב היילוד עשוי הנמל הרדיאלי של התאים הרדיאליים להגר למוח בתוך מתוך מעגל ולהתפתח נוירונים בקליפת כליה6.
תאים לטומאנציטים ממוקמים בסמיכות לפני השטח אסטרוציטים ולשתף איתם, כמו גם בנוסף astrochymal אסטרוגליה, ביטוי של קונשין-30 (Cx30)7. הליך כירורגי המתואר להלן מאפשר התוויות נרחב וספציפי של התאים האלה מנאינטיים באמצעות מסירה חד פעמי של אנקסיפן לתוך cisterna מגנה של עכברים טרנסגניים מותנית ביטוי tdTomato ב Cx30+ תאים (כלומר, באמצעות creer-loxp מערכת עבור מיפוי הגורל). אנדוקסיפן הוא מטבוליט פעיל של טמוקסיפן ומעורר שילוב של תאים של מבטא CreER באותו אופן כמו טממוקסיפן. זה, עם זאת, את הפתרון המומלץ עבור יישום אקטואלי כי הוא מתמוסס ב 5-10% DMSO, במקום ריכוזים גבוהים של אתנול. בנוסף, אנדוקסיפן אינו חוצה את מחסום המוח, ובכך מאפשר שילוב מיוחד של תאי לפטומאל, ללא תיוג של אוכלוסיית Cx30+ astroglial המשמשת כבסיס (ראה תוצאות מייצגות).
הטכניקה המוצגת כאן מכוונת באופן ידני ובטוח להזריק את המתחם בנוזל השדרתי, דרך גישה ישירה לcisterna מגנה. שלא כמו אחרים, הליכים פולשניים יותר הדורשים פתיחת גולגולת, גישה זו מאפשרת להשרות תרכובות מבלי לגרום נזק לגולגולת או המוח מכימומה. כך, הוא אינו משויך אינדוקציה של תגובות דלקתיות המופעל על ידי הפעלת תאים של המוקף מעקב. בדומה לאסטרטגיות הזרקה אחרות שתוארו לפני8,9,10, הגישה הנוכחית מסתמך על חשיפה כירורגית של קרום ריר העורף של atlanto-העורפית המכסה את cisterna מגנה, לאחר ניתוח קהה של שרירי הצוואר כיסה נחת. עם זאת, בניגוד להליכים אחרים, אנו ממליצים על שימוש במחט כפופה לקצה, אשר ניתן לייצב נגד עצם העורף במהלך הממשל. זה ימנע את הסיכון של המחט חודר עמוק מדי ופוגע המוח החלק האחורי ואת לשד.
הליך כירורגי זה תואם לחקירות מעקב אחר שושלת היוחסין המטרתן לבצע מיפוי שינויים בזהויות תאים ובנתיבי הגירה באמצעות שכבות של מסלולים. זה יכול גם להיות מותאם למחקרים הגנטי אבלציה שבכוונתך לחקור את התפקיד של תאים לטומאנאינאל בריאות ומחלות, כגון תרומתם להתפתחות קורטיקלית5 או התפשטות של דלקת קרום העין של חיידקים3,11. לבסוף, זה יכול להיות מנוצל כדי לעקוב אחר תנועת נוזל השדרה השדרתי כאשר בשילוב עם משלוח של מעוקב פלורסנט בחיות מסוג wildtype.

<table><tbody><tr><td>יחידת הרדמה</td><td>Univentor 410</td><td>8323102</td><td>שלם של וופורייזר, תא וצינורות המתחברים לתא ולמחזיק ראש עכבר</td></tr><tr><td>הרדמה (איזופלורן)</td><td>בקסטר רפואי AB</td><td>000890</td><td></td></tr><tr><td>בטדין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>קרפרופן</td><td>אוריון פארמה AB</td><td>014920</td><td>שם מסחרי דבק Rymadil</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate</td><td>קארל רוט</td><td>0258.1</td><td>השתמש בתפרי משי 5-0, בחלופה</td></tr><tr><td>דבק רקמות</td><td>Medbond Stoelting</td><td>50479</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>אנדוקסיפן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E8284</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 70%</td> <td>היסטולאב</td><td>01370</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון (מחט משופעת 30 גרם)</td><td>המילטון</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק ראש עכבר Lidocaine</td><td>Aspen Nordic</td><td>520455</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige International</td><td>SGM-4</td><td>עם פיה לאנסטטיקה בשאיפה. לחלופין, השתמש במסגרת סטריאוטקטית</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>Fine Science Tools</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>מכונת גילוח</td><td>Aesculap</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>חניתות ספיגה סטריליות</td><td>Fine Science Tools</td><td>18105-01</td><td>ספוגיות כותנה סטריליות הן גם אופציה טובה</td></tr><tr><td>מפריד כירורגי</td><td>מכשיר דיוק עולמי</td><td>501897</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Dumont</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>ויסקוטירס</td><td>באוש & לומב נורדי AB</td><td>541760</td><td></td></tr></tbody></table>

אינדוקציה של שינוי תאי לטומנאנואל באמצעות הזרקה בתוך החלק האחר

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר כיצד להזריק בביטחה ובאופן ידני פתרונות דרך הcisterna מגנה תוך סילוק הסיכון לנזק על הבסיס הבסיסי. פרוטוקולים שפורסמו בעבר ממליצים באמצעות מחטים ישר כי יש להוריד למקסימום של 1-2 מ"מ מהמשטח ריר. ירידה פתאומית התנגדות פעם קרום ריר כבר נוקב מקשה לשמור על המחט במצב קבוע. השיטה שלנו, במקום זאת, מעסיקה מחט כפופה לקצה שניתן לייצב כנגד עצם העורף של הגולגולת, ובכך למנוע ממזרק לחדור לתוך הרקמה לאחר ניקוב הקרום הריר. הנוהל הוא פשוט, מנוכל, ואינו גורם לאי נוחות ארוכת טווח בבעלי החיים המופעלים. אנו מתארים את אסטרטגיית ההזרקה תאיים בהקשר של מיפוי הגורל הגנטי של תאי כלי דם ללפטואנגים. אותה טכניקה יכולה, יתר על כן, להיות מנוצל כדי להתמודד עם מגוון רחב של שאלות מחקר, כגון בדיקה את התפקיד של לטומאנטינוגים ב-נוירופיתוח והתפשטות של דלקת קרום המוח בקטריאלי, באמצעות צריבה גנטית של גנים מעורבים בתופעות אלה. בנוסף, ההליך יכול להיות משולב עם מערכת אינפוזיה יצרנית עבור מסירה קבועה משמש למעקב אחר התנועה נוזל מוחי באמצעות הזרקה של מולקולות המסומנת באופן פלואורוסקופים.

הזרקה התאיים של אנדוקסיפן בעכברים טרנסגניים המבטא CreER תחת Cx30 יזם13 ו עיתונאי פלורסנט inducible מאפשר שילוב מסוים של תאים לטומאנואנציטים ללא תיוג השכנה Cx30-המבטא השכנות ו-משטח astrochymal בקליפת המוח (איור 1). על מנת לקבל גישה לcisterna מגנה, בעל החיים מורדם ממוקם עם הגוף והראש שלה בזווית של כ 120 °, ובכך, המאפשר את גב הצוואר שלה להיות נמתח (איור 1א). החלק atlanto-העורף של קרום ריר הוא...

אנו מתארים הזרקה תאיים כי מעסיקה מחט כפוף בקצה כי ניתן לייצב את הגולגולת, ובכך לחסל את הסיכון של נזק על הבסיס הבסיסי. הגישה יכולה לשמש למיפוי הגורל הגנטי ומניפולציות של תאים לטומאנעיים ולמעקב אחר תנועת נוזל מוחי שדרתי.

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...

ההליך הכירורגי שלנו מאפשר עריכת גנים ספציפית של תאים לפטוטומניים כדי לחקור את תפקודם במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים כגון התפתחות עצבית והתפשטות של דלקת קרום המוח חיידקית. כדי למזער את הנזק במהלך הלידה תוך גולגולתית של אנדוקסיפן, אנו משתמשים במחט מכופפת שניתן לאבטח כנגד הקצה caudal של הגולגולת כדי למנוע ממנו לחדור עמוק יותר ברקמה. ההליך יכול לשמש כדי לחקור את התפקיד של גנים המבטאים תאים leptomeningeal באמצעות אובדן ולהשיג ניסויים פונקציה.זה יכול גם להיות מאומץ כדי לעקוב אחר זרימת הנוזל השדרתי. הדגמה חזותית של שיטה זו תבטיח זיהוי מוצלח של אתר ההזרקה להזרקה תוך-ירתית והבנה כיצד לאבטח את המחט כנגד עצם העורף. התחל על ידי הכנת מזרק המילטון עם מחט משופעת 30 מד להזרקה.השתמש מדפים לכופף את המחט ל 30 מעלות שלושה מילימטרים מה קצה. לאחר מכן, לדלל אנדוקסיפן ב 10%DMSO לריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר ולמילוי אחורי של המזרק. הרדמה את החיה בתא isoflurane.לאחר מכן התאימו את מחזיק ראש העכבר כך שהמשופר יהיה בזווית של כ-30 מעלות מפני השטח של השולחן הכירורגי ותקנו את ראש החיה על המחזיק. כדי לשפר את הנגישות לאגנה cisterna, למקם את הגוף של החיה על כ 30 מעלות מפני השטח של השולחן עם הראש מוטה כלפי מטה אשר יבסס זווית של 120 מעלות עם שאר הגוף ולהרחיב את החלק האחורי של הצוואר כדי להקל על גישה מגנה cisterna. לאחר החיה ממוקמת כראוי, להחיל משחה עיניים, לגלח את החלק האחורי של צווארו, ולחטא את האזור עם מגבונים אלכוהול Betadine.השתמש מספריים כירורגיים כדי להפוך חתך קו האמצע החל ברמה של עצם העורף ומתרחב אחורי. הפרד בעדינות את רקמת החיבור השטחית ואת שרירי הצוואר על ידי משיכת הצידה מקו האמצע עם פינצטה עדינה שתחשוף את קרום dural overlying מגנה cisterna. מקם מפריד כירורגי קטן כדי לאפשר הדמיה של מגנה cisterna לאורך כל ההליך.לזהות את הקצה caudal של עצם העורף ולהכניס את המחט כפופה בעבר מיד מתחת. לאחר שהדורה מחוררת, אפשר לקצה הכפוף של המחט לחדור מתחת לפני השטח על ידי משיכת המזרק בעדינות כלפי מעלה ובמקביל לגוף החיה שתבטיח יציבות טובה יותר. להזריק את המתחם לאט כדי למנוע הפרעה עם הזרימה הטבעית של נוזל השדרתי.לאחר הזריקה, תן את המחט לנוח בפנים במשך דקה אחת, ולאחר מכן להסיר אותו בזהירות בעזרת מדפים קצה בסדר. סגור את העור עם כמה טיפות של דבק cyanoacrylate ולהחיל הרדמה מקומית באתר ההזרקה. מוציאים את החיה מהמחזיק ומ מניחים אותה בכלוב נקי על משטח חימום.לאחר מכן הקפד לפקח על החיה עד שהיא חוזרת להכרה. הזרקה תאית של אנדוקסיפן בעכברים מהוססים המבטאים CreER תחת מקדם Cx30, כתב פלואורסצנטי בלתי ניתן לחיסון מאפשר קומבינציה ספציפית של תאים לפטומננינגאליים מבלי לתייג את Cx30 השכן המבטא אסטרוציטים פני השטח ואסטרוציטים על-טבעיים בקליפת המוח. פרוטוקול הזרקה זה מנצל את התנועה הפיזיולוגית של הנוזל השדרתי כך פתרון אנדוקספין מופץ בכל החלל התת-ארוקנואידי ביעילות recombine leptomeningeal תאים כיסוי נורות הריח, קליפת המוח, ו המוח הקטן.הפתרון אינו חוצה את מחסום קרום המוח במוח או בא במגע עם תאים אסטרוגליאליים של parenchyma לעומת ניהול מערכתי באמצעות gavage אוראלי. רקומבינציה של תאים לפטוניים לאחר הזרקת תאיות זוהתה באמצעות תגובתיות Pdgfr-אלפא בעוד אסטרוציטים פני השטח ועל-טבעי המבטא Gfap נשארו ללא תותבת. בעת ניסיון ניסוי זה, חשוב לאתר את אתר ההזרקה למסירה תוך-ירתית.הדגמה חזותית זו מספקת את היידע הטכני לבצע את ההליך תוך מזעור הסיכון לפגיעה ברקמה העצבית שתחתיו. מחקרי אבלציה ג'ין יכול להתבצע עם טכניקה זו כדי לחקור את התפקיד של תאים leptomeningeal ב corticogenesis ורגולציה של היווצרות נוזל השדרתי ולזהות אתרים נוספים להתפשטות של חיידקים בחלל subarachnoid.

induction-leptomeningeal-cells-modification-via-intracisternal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Zamboni, M., et al., אינדוקציה של שינוי תאי לפטומנינגיאלי באמצעות הזרקה תוך-ציסטרנלית. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את ההליך של העברת תרופה משרה לבור המים של עכבר מורדם. ההזרקה גורמת באופן סלקטיבי לביטוי סמן פלואורסצנטי בתאי פני המוח הנגישים באמצעות נוזל מוחי שדרתי, שאושר על ידי הדמיה פלואורסצנטית.

מתן תרופות ממוקד במודל עכבר באמצעות הזרקת Cisterna Magna

בסרטון זה אנו מתארים את ההליך להעברת תאים סרטניים שמקורם בבני אדם לתוך עצם העצם במוחו של עכבר. מודל העכבר האורתוטופי יכול לשמש לחקר התפשטות גרורתית של סרטן לקרומי המוח הגולגולתיים.

הזרקת Cisterna Magna כירורגית: שיטה למתן תאי גידול ישירות למערכת העצבים המרכזית של מודל Murine

בסרטון זה, אנו מדגימים את המסירה התוך-ציסטרנלית של Neisseria meningitidis לתוך מודל עכבר כדי ליצור זיהום דלקת קרום המוח.

העברה תוך ציסטרנלית של מנינגוקוק למודלים עכבריים כדי לגרום לדלקת קרום המוח מנינגוקוקית

הסרטון מדגים שיטה ליצירת מודל חולדה עם דמיאלינציה מוחית נרחבת בקליפת המוח. זה כרוך בשיבוש מחסום הדם-מוח על ידי הזרקת ציטוקינים מעודדי דלקת לעכברים עם חלבון נדן מיאלין רקומביננטי. תהליך זה מקל על חדירת תאים חיסוניים, וכתוצאה מכך demyelination קליפת המוח נרחבת.

יצירת דמיאלינציה קליפת המוח הנפוצה במודל חולדה

בסרטון זה, מודל עכבר של טרשת נפוצה נקבע באמצעות אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE). העכבר מוזרק עם תחליב המכיל פפטיד עצבי ואדג'ובנט, המפעיל תגובה חיסונית המפעילה תאי T אוטוריאקטיביים. לאחר מכן מתבצעת הזרקה של רעלן שעלת (PTX) כדי להגביר את חדירות מחסום הדם-מוח, מה שמאפשר לתאי T האוטו-תגובתיים לחדור למוח. חדירה זו יוזמת מפל איתות שבסופו של דבר גורם לנזק למיאלין, המחקה את המצב הדה-מיאלינציה של טרשת נפוצה.

אינדוקציה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכבר

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר רבייה של חיקוי נרחב של חומר אפור של שתי ההמיספרות הקליפתיות בחולדות אגוטי אפלות זכריות בוגרות. השיטה כוללת השתלה תוך-מוחית של קטטר, חיסון תת-אקליני נגד מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין, והזרקה תוך-מוחית של תערובת ציטוקינים פרו-דלקתית דרך הצנתר המושתל.

מודל חולדה של דמיאלינציה קליפת המוח הנרחבת הנגרמת על ידי הזרקה תוך מוחית של ציטוקינים פרו דלקתיים

כאן, אנו מתארים שיטה לגרום דלקת קרום הגרון דרך מסלול הזיהום התאיים בעכברים למבוגרים. אנו מציגים צעד אחר צעד פרוטוקול של דלקת קרום הגרון מתוך הכנת האיסיס לזיהום התאיים; לאחר מכן להקליט את ההישרדות בעלי חיים ולהעריך את העומסים חיידקי ברקמות murine.

גרימת דלקת קרום הגרון הקבוצה C בעכברים באמצעות משלוח התאיים

כאן, אנו מתארים מודל קסנוגרפט מורין הדומה מבחינה תפקודית למאגר Ommaya בחולים. פיתחנו את מורין אומאיה כדי לחקור טיפולים חדשניים למחלת לפטומינגיאל הקטלנית באופן אוניברסלי.

מודל קסנוגרפט של מורין אומאיה לחקר טיפול ישיר ממוקד במחלת לפטומינגיאל

הפרוטוקול הנוכחי מתווה הוראות שלב אחר שלב לביצוע זריקות תוך-תיקליות בעכברים יילודים לצורך עריכת גנים והעברת תרופות.

הזרקה תוך-תטית של עכבר שזה עתה נולד לצורך עריכת גנום ואספקת תרופות

הפרוטוקול מתאר שיטה להזרקת תאי גידול דרך מסלול הניקוב המלעורי לתוך ציסטרנה מגנה הגורמת בעוצמה לגרורות לפטומנינגיאליות בעכברים, ומפחיתה את הטראומה ואת עומס הגידול החוץ-גולגולתי.

מודל הזרקת Cisterna Magna זעיר פולשני למחקרי גרורות לפטומנינגיאליות בעכברים

כאן מוצג פרוטוקול להערכת כלי הלימפה של קרום המוח בעכברים (MLVs), הממלאים תפקיד חשוב במחלות נוירולוגיות מרובות. מטרת הפרוטוקול היא לספק שיטה משולבת המאפשרת הן הערכה פונקציונלית של ניקוז העוקבים והן אפיון מורפולוגי מפורט של רשת ה-MLV הגב.

פרוטוקול משולב להערכת לימפות מנינגיאל: הזרקת סיסטרנה מגנה, הדמיית בלוטות לימפה, כריתת מנינגיאל וצביעה שלמה

למד שיטת הזרקה תוך-חדרית עם מחט כפופה לעריכת גנים ספציפית בתאי הלפטומנינגיאל בעכברים. טכניקה זו מאפשרת מחקר תפקודי במחלות נוירולוגיות תוך מזעור נזק לרקמות עצביות סמוכות.

אינדוקציה של שינוי תאי לטומנאנואל באמצעות הזרקה בתוך החלק האחר

גלה סרטונים נוספים