מעקב אוטומטי לחלוטין ברגל באופן חופשי חרקים נעים באמצעות לימוד הרגל למידה פילוח ומעקב (FLLIT)
23 באפריל 2020
אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לשימוש ב-FLLIT, שיטת למידה מלאה אוטומטית של מכונה למעקב אחר תנועות של הרגליים באמצעות הזזת דרוסופילה מלאנוגסטר וחרקים אחרים. ניתן להשתמש בפרוטוקולים אלה כדי לכמת את המהלכים הליכה עדינים בהליכה בתנועות מסוג פראי זבובים, מוטציה זבובים ומודלים לטוס של ניוון נוירוסטיות.
FLLIT הוא אלגוריתם המחשב את הרכבי הגוף והרגל של בעל חיים במעקב. וזה שימושי לאפיון המעגלים המהותיים ביסוד התנהגויות הליכה נורמליות ומחלות. הדבר הייחודי ב- FLLIT הוא שהיא אינה דורשת ערכות נתונים מבוארות של משתמש לצורך הדרכה ולכן היא אוטומטית לחלוטין.
אבל גם מנתח באופן אוטומטי את נתוני המסלול המייצרים סדרה של מדידות הליכה, עלילות הליכה להדמיה וסרטון מסלול. הדגמת ההליך תהיה אנימש בנרג'י, פוסט דוקטורנט מהמעבדה שלי. לפני תחילת ניסוי, לאשר כי תחנת ההקלטה יש מצלמה במהירות גבוהה עם במה מעליו להחזיק את תא הזירה.
הנח נוריות LED אינפרא-אדום בחלק העליון של הבמה עם מפזר בין המצלמה לדוגמה. כ-40 דקות לפני תחילת ההקלטה, מעבירים את הזבובים לתועב ריק על קרח למשך חמש עד שבע דקות. בזמן שהזבובים מנודדים, השתמש במים ובנגב כדי לנקות את הזירה ואת מגלשות הזכוכית של התא ולהקליט את אחת מגלשות הזכוכית מתחת לתא.
באמצעות מברשת נקייה, להעביר זבוב הרדמה אחד לתוך התא ולאבטח את התא עם שקופית שנייה וקלטת. לאחר מכן לאפשר לטוס בתא להתאקלם בטמפרטורת החדר במשך 15 עד 20 דקות. כדי ליצור סרטוני וידאו לניתוח FLLIT, תחילה, הפעל את מקור החשמל ופתח את יישום הצופה במערכת המחשב המחוברת.
שנה את קצב מסגרות ההקלטה ל- 1,000 מסגרות לשנייה והגדר את מהירות התריס לאלפית שנייה אחת. מקם את התא עם הזבוב בזירת ההקלטה ולחץ על כפתור LIVE. אישר כי המצלמה מתמקדת טיפים הרגל כאשר הזבוב הולך זקוף על הרצפה של התא ולחץ על הקלט.
תוך כדי הקלטה, ודאו שהעוף הולך במסלול ישר יחסית מבלי לגעת בקצה הזירה, הולך לפחות שלושה צעדים ברגל, לא עוצר במהלך ההליכה, והמרחק ההליכה שווה ערך לפחות לאורך גוף אחד וחצי. בסוף הניתוח לחץ על הקלט בוצע כדי לעצור את ההקלטה ולשמור את הקבצים בתבנית mraw או tiff לתוך התיקיות המתאימות. כדי להתקין את FLLIT, הורד תחילה את התוכנית למערכת הפעלה כלשהי.
חלץ את התוכן של קובץ ה- zip והורד ערכות נתונים לדוגמה. כדי להתקין את FLLIT באובנטו, נווט אל הספריה FLLIT/Compiled ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור פתח במסוף. הורד ערכת נתונים לדוגמה וצור נתוני תיקיה תחת FLLIT-master/Compiled שלתו להם ימוקמו תיקיות ערכת הנתונים.
התקן את ספריות זמן הריצה של MATLAB בבית/MCR. לאחר השלמת התקנת ספריית זמן הריצה של MATLAB, הנפק את הפקודה כדי להבטיח שזכויות ההפעלה יירשמו ב- FLLIT. לאחר מכן הזן את הפקודה לביצוע FLLIT.
עבור פילוח הווידאו, המר את הקובץ לקבצי TIFF בודדים ושמור את הקבצים המומרים בתיקיית הנתונים FLLIT. לאחר שכל הקבצים הועברו, הפעל את FLLIT. בחלון המוקפץ, בחר 0 לביצוע פילוח הרגל בלבד או בחר 1 כדי לכלול מעקב אחר רגליים עם פילוח רגליים.
בחר את התיקיה המכילה את תמונות ה- TIFF של המסגרת אחר מסגרת של הווידאו שיש לעקוב אחריהן ואת קובץ העניין ולחץ על הוסף. לאחר מכן לחץ על בוצע כדי ליזום את הפילוח והמעקב של הווידאו הנבחר. כדי לבדוק את מידת הדיוק של המעקב ולבצע תיקוני שגיאות, לחץ על בחירת תיקיית נתונים ולאחר מכן בחר את התיקיה למעקב.
לחץ על הצג מעקב ובדוק את התיוג עבור כל הרגליים במסגרת הראשונה. אם רגל מסומנת באופן שגוי ונדרש תיקון, לחץ על השהה הצגה והתאם חיזוי. בחלונית 'רגל להתאמה', בחרו ברגל הדורשת תיקון ולחצו פעמיים על המיקום הנכון של רגל זו בחלון התמונה.
לאחר מכן לחץ על שמור וצא. כדי לעבד את הנתונים המפולחים והמעקבים, לחץ על תהליך נתונים. תחילה, חשב את שדה התצוגה בפועל של הווידאו שנלכד כך שניתן יהיה למדוד את פרמטרי השער.
בחלון המוקפץ הזן את מספר המסגרות לשניה שבהן הסרטון מוקלט והזן את שדה התצוגה המחושב במילימטרים. כדי לגשת לתוצאות המעקב, פתח את התוצאות ואת תיקיות המעקב. כדי ליצור וידאו של הזבוב המסוים, בחר צור וידאו.
לאחר פילוח, מעקב ועיבוד נתונים, FLLIT מייצרת באופן אוטומטי נתונים גולמיים עבור מיקומי הגוף, וכל טופר רגל, 20 פרמטרים של הליכה, ועלילות נלוות וסרטונים מסומנים. SCA3 מאופיין על ידי הליכה אטקסית עם סטייה לגוף, מיקום רגל לא יציב, וצעדים קצרים. כדי לאפיין את ההליכה של זבובים SCA3 מוטציה ולחקור אם הם מציגים הליכה דומה לזו של חולים אנושיים, הפרמטרים הרלוונטיים הליכה שנוצר על ידי FLLIT ניתן לנתח.
זבובי SCA3-Q84 מציגים יותר פניות, מיקום רגל לא יציב כפי שהוצג על ידי סדירות טביעת רגל נמוכה, וחפיפה מוגברת של תחום הרגל, תחומי רגליים מוגדלים באורך ובתחום, ואורך צעדים מופחת. FLLIT יכולה גם ליצור סרטון המציג את הזבוב והרגליים המסוימים בנופים המים מרוכזים בזירה ומרכזי הגוף, מסלול הגוף, כיוון הכותרת ותזוזות אנכיות וצידיות של כל רגל. בהשוואה לזבובי SCA3-Q27, זבובי SCA3-Q84 מציגים תחומי רגליים מצטלבים לא סדירים בגדלים שונים, המעידים על הליכה אטקסית פתוחה.
הנתונים הגולמיים עבור תנוחות טופר הגוף והרגל ניתן לנתח עוד יותר עבור תנועות ספציפיות של עניין. לדוגמה, השימוש ב- FLLIT איפשר לקבוצה שלנו לקבוע כי הפנוטיפים הנוקשים המוצגים על ידי מודלים Drosophila של מחלת פרקינסון נגרמות על ידי תפקוד לקוי של נוירון דופאמין.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקולים עבור FLLIT, שיטה לאוטומציה של למידת מכונה למעקב אחר תנועות ציפורני הרגליים ב-Drosophila melanogaster ובחרקים אחרים. השיטה מודדת באופן כמותי תנועות עדינות של דפוסי הליכה במודלים שונים של זבובים, כולל כאלו עם ניוון עצבי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ניתוח התנהגותי
- למידה מכונה
רקע
- FLLIT הוא אלגוריתם אוטומטי לחלוטין למעקב אחר תנועות של בעלי חיים.
- הוא אינו דורש סטים של נתונים עם תוויות שהוכן על ידי משתמש לצורך האימון.
- השיטה מספקת מדידות ויזואליזציות מפורטות של הליכה (gait).
- היא ישימה הן עבור זבובים מסוג בר (wild type) והן עבור זבובים מוטנטים.
מטרת המחקר
- לניתוח כמותי של דפוסי הליכה ב-Drosophila.
- לחקירת חריגות בהליכה במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות.
- לספק פרוטוקול סטנדרטי עבור חוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מערך ההקלטה עם מצלמות במהירות גבוהה.
- שימוש בנורות LED באינפרא-אדום לנראות אופטימלית.
- ניתוח וידאו אוטומטי למעקב אחר הרגליים ומדידת ההליכה.
- עיבוד נתונים להפקת פרמטרי הליכה והדמיות ויזואליות.
תוצאות עיקריות
- FLLIT מייצר נתונים גולמיים עבור מיקומי הגוף והרגליים.
- זוהו חריגות בהליכה בזבובים מוטנטיים של SCA3.
- הודגמו הבדלים בדפוסי ההליכה בין מודלי הזבובים.
- סופקו תובנות לגבי המכניזמים העומדים בבסיס הניוורו-דגנרציה.
מסקנות
- FLLIT הוא כלי רב-עוצמה לניתוח התניידות של חרקים.
- הוא יכול לסייע בהבהרת ההשפעות של מוטציות גנטיות על דפוסי ההליכה.
- השיטה משפרת את הבנתנו לגבי מחלות נוירודגנרטיביות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות אוטומטי של תנועת חרקים מאפשר סריקה פנוטיפית בתושבה גבוהה עבור מודלים של מחלות נוירודגנרטיביות. FLLIT מספקת מדידות אובייקטיביות של ההליכה התומכות בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. זרימת העבודה האוטומטית לחלוטין שלה מפחיתה הטיות של המשתמש ומגבירה את השחזוריות עבור צוותים רב-תחומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות של חריגות בתנועת הרגליים במודלים של מחלות.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות פנוטיפ של הליכה אובייקטיבי וברזולוציה גבוהה.
- ערך ניבוי: מייצר פלטים כמותיים המסייעים במיון פורטפוליו ובזיהוי מובילים (leads).
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר מערכות ביולוגיות סטנדרטיות לסריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- שחזוריות: מספק פרמטרי הליכה כמותיים עקביים בין חזרות ניסיוניות.
- ניתנות להרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עבור קמפיינים של סריקה בספיקת תפוקה גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדגים פנוטיפים של הליכה אטקסית אנושית בזבובים מוטנטיים של SCA3.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאי גילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות נקודות קצה מדידות של ההליכה.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקריטריונים של קידום בהתבסס על פוטנציאל לנורמליזציה של ההליכה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
FLLIT משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי אספקת פנוטיפים כמותיים של התניעות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות מעקב אוטומטי אחר הרגליים.
- סריקה: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה ופלטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק 20 פרמטרי הליכה וויזואליזציות המקלות על השוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית באמצעות חריגות הליכה הרלוונטיות למחלה במודלים של ניוורו-דגנרציה.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כיכולת הניתנת לשימוש חוזר במגוון מודלים של מחלות המבוססים על חרקים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בפנוטיפים של תנועה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות עיבוד אוטומטי מלא.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) באמצעות אספקת מדדי הליכה אובייקטיביים לצורך תיקוף המודל.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון המבוסס על נורמליזציה של ההליכה במודלים של מחלות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתהליכי עבודה של למידת מכונה ובניתוח וידאו.
- דורש תשתית של מצלמהומהירות גבוהה והגדרת תאורה מבוקרת.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך פרשנות נתונים וקביעת סף (threshold).
- כולל שיקולי התאמה בין מיני חרקים שונים ותבניות הליכה.
- תלוי באורך פסיעה מספיק ובמסלול ישר לצורך מעקב מדויק.
שאלות נפוצות בתחומי הביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
System Setup
1:05
Fly Preparation
1:47
Video Generation for Feature Learning Leg Segmentation and Tracking (FLLIT) Analysis
2:52
FLLIT Installation
3:50
Automated Leg Tracking
5:13
Data Processing and Video Generation
7:31
Conclusion
5:54
Representative Results: Automated Leg Movement Tracking in Freely-Moving Insects
