תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet
21 במאי 2020
צוואר בקבוק במחזור ' עיצוב-לבנות בדיקה ' של הנדסת חיידקים היא המהירות שבה אנחנו יכולים לבצע מסכי פונקציונלי של זנים. אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה לסינון המתח המוחל על מאות אלפי תאים שמרים לכל ניסוי העושה שיטה ברצף RNA מבוסס droplet.
ICO, או ICO-seq הוא ההתאמה הראשונה של רצף RNA בתפוקה גבוהה למיקרואורגניזמים. שיטה זו העריכה את התפקוד המיקרוביאלי בקנה מידה גנום רחב. עבור מיקרואורגניזמים מהונדסים, שיטה זו יכולה להבהר כיצד שינויים בגנום המיקרוביאלי יכולים לטרטר את תפקודיו.
להשיג שמרים מתרבות השעיה, ולספירת התאים באמצעות hemocytometer. להשעות מחדש את התאים PBS בריכוז של כ 750, 000 תאים למיליליטר. לאחר מכן, מערבבים נקודת התכה אולטרה-נמוכה התעוררו ב- PBS, ומחממים את התערובת ב -90 מעלות צלזיוס, עד שהתעוררות נמסה.
טוענים את תערובת ההתעוררות למזרק, עם מסנן 0.22 מיקרון מצורף. מניחים משאבת מזרק מול תנור חלל להגדיר 80 מעלות צלזיוס ולה מניחים את המזרק במשאבה. ממלאים מזרק שני בהשעיית השמרים, וממלאים מזרק שלישי בשמן פלואורי, עם 2% פלואורו-אורפקט יוני.
העמיסו את שני המזרקים לתוך משאבות המזרק. חבר את הצינורות מהמזרקים למכשיר A.Place צינור חרוט 15 מיליליטר בדלי קרח, ולהנחות את צינור השקע לתוך הצינור חרוט. הגדר את קצב הזרימה עבור כל מזרק, ולאסוף כמיליליטר אחד של אמולסיה בצינור חרוט 15 מיליליטר.
לאחר המתנה של חמש דקות עד שהתעוררה בצינור, הוסיפו נפח שווה של 20% פרפלואורו-אוקטנול בשמן פלואורי לאמולסיה. מערבבים את אמולסיה ואת perfluoro-octanol על ידי היפוך הצינור חרוט כמה פעמים. צנטריפוגה אמולסיה שבורה ב 2, 000 פעמים G במשך שתי דקות.
ודא הידרוג'ל יש גלולות מעל שלבי שמן ו- PFO. הסר את שלבי השמן וה- PFO. הוסף שני מיליליטר של מאגר tet(W) כדי להשעות מחדש את ההידרוגלים.
העבר את ההשעיה לצינור חרוט חדש של 15 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור שוב ב 2, 000 פעמים G במשך שתי דקות. הסר את העל-טבעי והשהה מחדש את ההידרוגלים ב- tet(W)again.
לאחר ספינינג במורד הידרוג'ל ב 2, 000 פעמים G במשך שתי דקות, להשעות מחדש את הידרוג'לים בשני מיליליטר של תרבות שמרים בינוני. דגירה הצינור לילה ב 30 מעלות צלזיוס, עם רעידות. כל זנים גדלים בשיעורים שונים.
בחירת זמן מדיה ודגירה מתאים היא חיונית כדי להבטיח כי השמרים לגדול בתוך הידרוג'ל, אבל לא לגדול יתר על כן, המוביל תאים לברוח לתוך התקשורת. ראשית, להעביר את הידרוג'ל לצינור חרוט 15 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 2, 000 פעמים G במשך שתי דקות.
לשטוף את הידרוג'לים פעמיים עם PBS ולאחר מכן פעם אחת במאגר spheroplasting. בצע דילול פי 40 של אנזים spheroplasting במאגר spheroplasting. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של האנזים מדולל הידרוג'לים.
דגירה הצינור של הידרוג'ל ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. השמרים המטופלים ייראו שקופים יותר. מהצינור המכיל את ההשעיה הידרוג'ל, למשוך 0.8 מיליליטר של ההשעיה מתחתית הצינור, ולהעביר אותו למזרק אחד מיליליטר לא מנוצל.
מניחים את המזרק במחזיק המזרק המודפס בתלת-ממד. צנטריפוגה המזרק והמחזיק ב 2,000 פעמים G במשך שתי דקות. לפני שתמשיך, ודא כי הידרוג'ל ארוזים היטב בחלק התחתון של המזרק.
מניחים 240, 000 בחנוזי טיפה-סק בצינור חרוט 15 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 1, 000 פעמים G לדקה אחת. הסר את supernatant, ולהשעות מחדש את חרוזים בשני מיליליטר של חיץ תזה שמרים 0.9x, עם 500 מילימולר נתרן כלורי.
מכניסים בר ערבוב, ומעבירים את ההשעיה של חרוז למזרק של שלושה מיליליטר. הכינו מזרק נוסף, המכיל כמה מיליליטר של חומר שטח PFPE-PEG בשמן פלואורי. השג את המזרק שהוכן בעבר של שיבוט שמרים הידרוג'ל ארוז.
לפנות את ראש הזיכוי, ולכסות את המזרק. הכנס את שלושת המזרקים, ההידרוגלים, מתלי חרוזים, ואת השמן למשאבות מזרק. חבר את המזרקים באמצעות צינורות למכשיר B, התקן אנקפסולציה.
מניחים את קצה צינור השקע לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר על קרח. הגדר את קצב הזרימה עבור כל מזרק. לאסוף כ 1, 000 מיליליטר של אמולסיה, או להפעיל את המכשיר עד שלא נותרו הידרוג'לים.
לאחר מכן בצע את פרוטוקול רצף הירידה עבור סינתזת cDNA, הכנת ספריה וריווח. באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, תאי שמרים היו אנקפסולציה טיפות 160 מיקרומטר. מפצל פי שמונה חילק את טיפות אלה לשמונה טיפות 60 מיקרומטר.
הדגירה הלילית גרמה למושבות שמרים איזוגניות לגדול בתוך חלק מההידרוגלים. לפני טעינת הידרוג'ל השמרים לתוך המכשיר microfluidic השני, הם נשטפו ושקעו בתמיסה לעכל את קירות התא. עיכול נכון אומת על ידי מיקרוסקופיה, עם תאי שמרים מטופלים שיש מורפולוגיה רפלקטיבית יותר.
זרם של חבילות לכידת mRNA במאגר תיזה היה מעורבב עם זרם של הידרוג'ל שמרים קרוב לפני צומת טיפה עושה של המכשיר microfluidic השני. באמולסה שנוצרה, כ-10% מהטפות שנאספו הכילו חרוז אחד עם מושבה lysed. זרימת עבודה זו של רצף מושבה isogenic שימש כדי לנתח את התגובה מיתוג אטום לבן של C.albicans.
הרכיב העיקרי, המחשב האישי, הניתוח והפחתת ממדי tSNE הצביעו על קונקורדיות כללית בין ערכת הנתונים לדוגמה לבין ערכת נתוני הפניה. ניתוח TSNE חשף שלושה אשכולות של תאים. בעוד אשכול 2 היה מורכב בעיקר של תאים מתוך ערכת הנתונים לדוגמה, אשכולות אפס ואחד היו מורכבים תאים משתי הדגימות.
שכבת-על של ביטוי WH11 ב- tSNE הצביעה על כך שאשכול אחד הכיל ככל הנראה מושבות לבנות. ביטוי STF2 גדל באשכול אחד, בהתאם לנתונים שהושגו בעבר. באשכולות אפס ושניים, WH11 ו- STF2 היו מוסדרים באופן משמעותי בהשוואה לאשכול 1.
למיקרואורגניזמים אנדרוגנים יש פוטנציאל הולך וגדל לייצור ביולוגי המוני לטיפול במגוון רחב של מחלות. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם מגוון כלים ביואינפורמטיים כדי לנתח עוד יותר את נתוני רצף.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לסריקת זנים בעלת תפוקה גבוהה בהנדסה מיקרובלית, המשתמשת באופן ספציפי בריצוף RNA מבוסס טיפות לניתוח תאי שמרים. השיטה מאפשרת הערכות פונקציונליות של מיקרובים מהונדסים בקנה מידה של גנום שלם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- הנדסה מיקרוביאלית
- סריקה בשפיות גבוהה
- ריצוף RNA
רקע
- סריקה תפקודית של זני מיקרואורגניזמים היא לעיתים קרובות איטית ולא יעילה.
- שיטות בעלות תפוקה גבוהה יכולות להגביר משמעותית את מהירות ההערכות הללו.
- ריצוף RNA מבוסס טיפות מציע גישה חדשנית להערכת תפקודים מיקרוביאליים.
- הבנה של הפרעות גנומיות יכולה להנחות אסטרטגיות להנדסה מיקרוביאלית.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לסריקה מהירה של זני שמרים באמצעות ריצוף RNA.
- הבנת ההשפעות הפונקציונליות של שינויים גנומיים במיקרובים מהונדסים.
- שיפור היעילות של מחזור התכנון-בנייה-בדיקה (design-build-test) בהנדסה מיקרובית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תאי שמרים תורגבו והוכנו בריכוז ספציפי.
- מיקרופלואידיקה מבוססת טיפות שימשה לכלילה של תאי השמרים.
- ביצוע ריצוף RNA לתאים המכוללים בוצע כדי להעריך ביטוי גנים.
- כלים ביו-אינפורמטיים יושמו לצורך ניתוח נתוני הריצוף.
תוצאות עיקריות
- השיטה הצליחה לכלוס תאי שמרים בטיפות לצורך ניתוח בסביבה בעלת תפוקה גבוהה.
- הופקו מושבות איזוגניות אשר נותחו לבדיקת דפוסי ביטוי גנים.
- ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) חשף אשכולות מובחנים של ביטוי גנים.
- הממצאים הצביעו על הבדלים משמעותיים בביטוי הגנים הקשורים למורפולוגיית המושבות.
מסקנות
- שיטה בעלת תפוקה גבוהה זו משפרת את היכולת לסרוק זנים מיקרוביאליים באופן יעיל.
- התובנות שיירכשו עשויות להנחות הנדסה עתידית של מיקרואורגניזמים ליישומים ביוטכנולוגיים.
- הגישה ישימה למגוון מינים מיקרוביאליים מעבר לשמרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
סריקה של זנים ברזולוציה גבוהה נותרה צוואר בקבוק בהנדסה מיקרוביאלית למרות ההתקדמות בעריכה גנומית. שיטה זו של ריצוף RNA מבוסס טיפות מאפשרת הערכה פונקציונלית רחבה של הגנום עבור זני שמרים מהונדסים, ובכך נותנת מענה ישיר לפשרה שבין תפוקת המידע לבין קיבולת הסריקה. על ידי אספקת הסקה פנוטיפית מתוך פרופילים של שעתוק, היא תומכת בביטחון חיזוי בבחירת זנים ומאיצה את מחזור התכנון-בנייה-בדיקה (design-build-test) לייצור ביולוגים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור שינויים גנומיים לפנוטיפים תפקודיים באמצעות קריאות של כלל התסריפטום.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות פרופיל ביטוי גנים כמותי המבהיר השפעות ברמת המסלולים של עריכות גנטיות.
- ערך ניבויי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי זנים עם חתימות ביטוי רצויות הקשורות למסלולים המכוונים, ובכך מפחית את ההסתמכות על בדיקות בעלות תפוקה נמוכה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר מושבות שמרים איזוגניות סטנדרטיות המעטפות בטיפות, המתאימות לסריקה פנוטיפית הניתנת לשחזור המבוססת על RNA-seq.
- יכולת הרחבה (Scalability): מעבד אלפי זנים שונים גנטית במקביל, ובכך מתגבר על מגבלותיהם של שיטות מסורתיות של בידוד מושבות ושיטות מבוססות מערכים.
- איכות נתונים: מפיק מדידות כמותיות ומרובות (multiplexed) של ביטוי גנים, המאפשרות השוואה חסונה בין ספריות זנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: יושם על מעבר בין מצבי white-opaque ב-Candida albicans, פנוטיפ הקשור לאלימות (virulence), ובכך הוכיח את יעילותו באפיון זנים פתוגניים.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין שינויים גנטיים לתוצאות פנוטיפיות באמצעות סממנים ביולוגיים של ביטוי (למשל, WH11, STF2), ובכך תומך בבחירת זנים המותאמת לסממנים ביולוגיים.
- הפחתת סיכונים בשלב הפרה-קליני: מאפשר זיהוי מוקדם של זנים שאינם תפקודיים או זנים חריגים, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבי הפיתוח הבאים.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי הנדסת זנים מיקרוביאליים, החל מבניית ספריות ועד לאימות תפקודי, ומאפשרת תיעדוף זנים מונחה טרנסקריפטום לפני זיהוי המועמדים המובילים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי חשיפת האופן שבו הפרעות גנומיות משפיעות על ביטוי גנים גלובלי ברקעים איזוגניים.
- סריקה: מספק מערכות מיקרוביאליות סטנדרטיות ומוכנות לבדיקה, בעלות תפוקות שעתוק הניתנות לשחזור, לצורך בדיקת תגובה לתרכובות או לתנאים.
- אנליטיקה: מספקת מקבצי ביטוי המופקים מ-PCA ו-tSNE והנחות של גני סמן המאפשרים סיווג פנוטיפי והשוואה בין זנים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין גנוטיפים של זנים למצבים פנוטיפיים באמצעות סמנים שמורים, ובכך תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית לסריקת ספריות של שמרים וזנים מיקרוביאליים אחרים על פני פרויקטים ותחומי טיפול מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי במערכות יחסי זן-תפקוד על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות נתוני ביטוי בקנה מידה גנומי.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות הכנסה במיקרופלואידיקה וצמיחת מושבות מבוקרת על בסיס הידרוג'ל.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות של קבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת תהליך (go/no-go) ואת הקצאת ההון, על ידי מתן אפשרות להערכה מהירה של זנים במספר פרמטרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי זיהוי זנים עם פרופילים מולקולריים המעידים על פנוטיפים רצויים בשלב מוקדם של הפיתוח.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרופלואידיקה, גנטיקה של שמרים והכנת ספריות לריצוף RNA של תא בודד.
- תלוי בגישה למכשירי יצירת טיפות, שמנים פלואוריים, חומרים פעילי שטח ותשתיות לריצוף וביואינפורמטיקה בשלבים הבאים.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים להכנת הידרוג'ל, ספרופלסטינג (spheroplasting) וצימוד חרוזי כדי להבטיח תוצאות עקביות.
- כולל אופטימיזציה של זמן הדגירה והמצע למניעת צמיחת יתר של ההידרוג'ל ובריחת תאים, תהליך התלוי בזן.
- מוגבל על ידי הצורך בביומרקרים תעתוקיים עם קשרי פנוטיפ ידועים, כדי לאפשר הסקת מסקנות פנוטיפיות מדויקות מנתוני RNA-seq.
