Name: זיהוי חלבון S-אכלציה באמצעות לכידת הסיוע Acylation-שרף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: למד את שיטת Acyl-RAC לזיהוי S-אכלציה של חלבונים בדגימות ביולוגיות שונות. שיטה זו מאפשרת איתור רגיש ואמין של שינויים ליפידיים בחלבונים בתאים חיים, רקמות ראשוניות ודגימות קפואות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות 5R01GM115446 ו-1R01GM130840.

עכברים המשמשים בפרוטוקול זה הורדמים על פי הנחיות NIH. הוועדה לרווחת בעלי חיים באוניברסיטת טקסס מדעי הבריאות המרכז ביוסטון אישר את כל העבודה בעלי חיים.
1. הכנת ליקוטים סלולריים
<ol><li>הכן את מאגר הליזה כמתואר בטבלה 1. כדי 10 mL של PBS, להוסיף 0.1 g של n-dodecyl β-D-מלטוסייד אבקת כביסה (DDM) ולסובב להתמוסס. הוסף 100 μL של קוקטייל פוספאטאז מעכבי 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 מ"מ) ו מעכב פרוטאז קוקטייל (1x) ולצנן את המאגר על הקרח לפני השימוש.</li>
	<li>העברת מדיה נדרש המכיל תאים מהאינקובטור לתוך 15 מ"ל או 50 mL מצינורות ותאי ספין ב 350 x g עבור 5 דקות ו-מדלל כדי להיפטר כל פסולת תא. הערה: השתמשנו 1 x 107 תאים עבור כל תגובה מירוץ acyl להתבצע.</li>
	<li>לשטוף את הגלולה על ידי השעיית מחדש ב 5 מ ל של PBS ו ספינינג ב 350 x g עבור 5 דקות. הערה: בצע את השלב 1.3 במהירות כדי להימנע מפירוק תאים עקב הדגירה המורחבת ב-PBS.</li>
	<li>הוסף 600 μL של מאגר הליזה שהוכן בשלב 1.1 לגלולה ו lyse אותו על ידי טלטול ב 1500 rpm ב שייקר תרמית עבור 30 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>ברור lysates על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g ב 4 ° צ' עבור 30 דקות כדי כדור ניקוי-חומרים לא מסיסים. לאסוף נקי ליפוסט בקירור טרום מקורר 1.5 מ"ל microfuge mL ולשמור אותם על קרח.</li>
	<li>בצע ברדפורד/BCA שיטת הערכת ריכוז החלבון. זה קריטי להבטיח את אותה כמות של חלבון על פני דגימות שונות לפני ביצוע הניסוי. אנו ממליצים להשתמש לפחות 500 μg של חלבון לכל תגובה. הערה: בניסויים המתוארים, השתמשנו בתאי השימוש בתרבית (ג'ורקאט) והטחול הראשוני מרקמת העכברים. שיטת הליזה שתוארה לעיל יכולה להיות מאומצת גם לסוגי תאים אחרים. ריכוז החלבון הממוצע המתקבל עבור סוגי תאים הנ ל הוא כ 500 μg לכל 1 x 107 תאים. תאים ג'ורקאט היו שמרו ב-RPMI-1640 בינוני שונה להכיל 2 מ"מ L-גלוטמין, 10 מ"מ HEPES, 1 mM נתרן פירובט, 4,500 mg/L גלוקוז, ו 1,500 mg/L נתרן ביקרבונט יושלם עם 10% FBS ב 37 ° צ' עם 5% CO2. השתמשנו ב-1 x 107 . בתאי ג'ורקאט לכל תגובה הטחול הראשי מבודדים מרקמת הטחול של העכבר כמתואר26. בקצרה, רקמת הטחול היה מיצה על קרח, ואחריו הליזה של אריתרופוציטים בפתרון היפוטון והפרדה מ לימפוציטים על ידי צנטריפוגה. השתמשנו 1 x 107 תאים ראשוניים לכל תגובה.</li>
</ol>2. acyl מירוץ: חסימת של הקבוצות תיול חינם
הערה: ניתן לבצע את כל השלבים הבאים בטמפרטורת החדר (RT).
<ol><li>העברת ליפוסט לתוך שפופרת טריים 1.5 mL microfuge ולבצע כלורופורם-מתנול (CM) משקעים כמתואר להלן.<ol>
<li>הוסף מתנול (MeOH) ו כלורופורם (CHCl3) אל הליפוסט ביחס הסופי של Lysate: Meoh: chcl3 של 2:2:1 ולנער במרץ כדי ליצור השעיה הומוגנית.</li>
		<li>ספין ב 10,000 x g עבור 5 דקות כדי ליצור גלולה ("פנקייק") בשלב בין שלבים מימית ואורגני.</li>
		<li>להטות את הצינור ומכה ממיסים ככל האפשר באמצעות מחט או טיפ טעינת ג'ל.</li>
		<li>האוויר יבש את הגלולה חלבון במשך כמה דקות בעדינות לשטוף אותו על ידי הוספת 600 μL של MeOH ו ערבוב בעדינות כדי להימנע מפירוק הגלולה</li>
		<li>הסר בזהירות את הנותרים MeOH ויבש את הגלולה חלבון על הספסל במשך כ 5 דקות.</li>
		<li>אופציונלי לבצע צעד צנטריפוגה נוסף כדי לסובב את כל הגלולה שבורה לאחר שטיפת MeOH כדי למנוע אובדן של דגימת. הערה: ניתן לעצור את הניסוי לאחר משקעים של CM. לאחר הגלולה מושגת, זה יכול להיות מאוחסן ב 500 μL של MeOH ב-20 ° c עד שבוע.<ol>
<li>מפזר את החלבון גלולה ב 200 μL של מאגר 2SHB על ידי vortexing ב 42 ° צ'/1500 סל ד ב שייקר תרמית עד התחתית התפרקה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>אופציונלי דגירה של 5 – 10 דקות באמבט מים sonicating כדי לפזר את הגלולה. הערה: אורך הsonication משתנה בהתאם לסיסות החומר. עם זאת, sonication ממושכת עלולה לגרום לירידה בחלבון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו 0.2%% מתיל מתיונין (v/v) ב-2SHB על-ידי הוספת 2 μL של MMTS ל 998 μL של מאגר 2SHB. הערה: השימוש הטרי 0.2% MMTS עבור כל ניסוי.</li>
	<li>הוסף 200 μL של 0.2% MMTS ב 2SHB לכל צינור לריכוז סופי של 0.1% MTS. מודטה עבור 15 דקות ב 42 ° c עם טלטול ב 1500 סל ד ב שייקר תרמית.</li>
</ol>3. מירוץ מפוספס: הידרוקסילמין (בשר חזיר) מחשוף ולכידת חלבונים של S-acylated
<ol><li>חזור על הקפיצות של 4 x ס"מ כמתואר לעיל כדי להסיר MMTS. הסרת MMTS יכול להיות מוערך על ידי חוסר ריח ברור של MMTS. אחרי כל משקעים, לפזר את הגלולה ב 100 μL של מאגר 2SHB ידי vortexing ב 42 ° צ'/1500 סל ד ב שייקר תרמית עד הגלולה מתמוסס, ולאחר מכן לדלל עם 300 μL של מאגר A.</li>
	<li>לאחר משקעים סופיים, התמוססות דגימות ב-200 μL של מאגר 2SHB כמתואר לעיל ולדלל עם 240 μL של מאגר A.</li>
	<li>במקרה של השוואת שינויים ב-S-acylation בתגובה לתנאי טיפול מספר, למדוד ריכוז חלבון שוב ולהמשיך עם כמות שווה של חלבון עבור כל תנאי.</li>
	<li>שמור על 40 μL מכל אחת מהדוגמאות כבקרת קלט.</li>
	<li>פיצול דגימות לשני חלקים שווים של 200 μL ו לסמן צינורות כמו "+ HAM" ו "-HAM". הוסף 50 μL של מוכן טרי 2 עם נקניק (pH 7.0-7.5) לריכוז הסופי של 400 מ"מ לאחד הצינורות (+ HAM) ו 50 μL של נייטרלי 2 M הנאל השני (-HAM), אשר ישמש כפקד שלילי. המשך לתוספת חרוזי thiopropyl-ספרד (TS). הערה: ניתן לעצור את הניסוי לאחר כל אחד מצעדי המשקעים של ס מ. לאחר הגלולה מושגת, זה יכול להיות מאוחסן ב 500 μL של MeOH ב-20 ° c עד שבוע. החומציות הנייטרלית של 2 M HAM מבטיחה את הסלקטיביות שלה לקשר של האקאיל-cysteine, ויש להתאימו בקפידה. יש לנקוט טיפול בעת טיפול בדגימות במאגר 2SHB כדי למנוע אובדן של מדגם עקב קצף מוגזם. כל השלבים הבאים הם זהים עבור-HAM ו + HAM דגימות.</li>
	<li>הוסף 30 μL של TS חרוז-ליטר כל צינור לסובב את הצינורות עבור 1-2 h ב RT.</li>
	<li>שוטפים את החרוזים 4x עם 1% SDS במאגר A כדי להסיר שיורית HAM.<ol>
<li>בעדינות לסובב את כל דגימות חרוז באמצעות microfuge עבור 1 דקות ובזהירות מזהם את supernatant.</li>
		<li>השהה מחדש את החרוזים ב-500 μL של 1% SDS במאגר A.</li>
		<li>חזור על שלב 3.7.1 – 3.7.2 שלוש פעמים. הערה: מופעל thiopropyl-ספרד (TS) מסופק להקפיא מיובש בנוכחות תוספים שיש לשטוף בתוך pH נייטרלי לפני צימוד. מים מזוקקים מומלץ לנפיחות ולכביסה. שוקלים 0.1 גרם של חרוזים ולהשעות מחדש 1 מ ל של מים מזוקקים ולאפשר לו להתנפח תוך כדי סיבוב עבור 30 דקות-1 h ב RT. לשטוף חרוזים 1x עם מאגר A ולהכין משקה עם מאגר A, ביחס של 50% בינונית התיישבו על 50% מאגר. TS נפוחות ניתן לאחסן ב-pH נייטרלי בנוכחות של 20% אתנול ב 4 ° c עד שבוע. אין להשתמש בנתרן עזידה כסוכן בקטאוסטטי, מאחר שאזידה יונים מגיבים עם הקבוצות הדיסולטיות בשתי הפירידיל. ליעילות גבוהה יותר, הכינו חרוזים טריים. בזמן הטיפול החרוזים, קצה של טיפ P200 tte ניתן לגזור מעט כדי למנוע נזק כלשהו. הערה: ניתן לעצור את הניסוי בכל שלב לאחר משקעים בעלי ס מ. הגלולה עשויה להיות חנות ב-500 μL של MeOH ב-20 ° c עד שבוע.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הימנעות מגילוי חלבונים של S-acylated
<ol><li>לאחר השטיפה האחרונה, בעדינות לסובב את החרוזים כפי שמתואר לעיל ומכה את הסופר supernatant ככל האפשר מבלי להפריע את החרוזים.</li>
	<li>לשחזר את החלבונים מחרוזים עם 4 x SDS מאגר לדוגמה עם DTT.<ol>
<li>הוסף 50 μL של 4 x SDS מאגר לדוגמה חרוזים ו-הדגירה ב 80 ° צ', 1500 rpm עבור 15 דקות ב שייקר תרמית. . תן לחצוצרות להתקרר</li>
		<li>צנטריפוגה את החרוזים ב 5,000 x g עבור 3 דקות כדי לחלוטין הגלולה החרוזים ולהעביר את החלבונים משחרל שפופרת טריים 1.5 mL באמצעות עצה טעינת ג'ל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל SDS-עמוד ולנתח S-אכלציה של החלבון (של) של העניין על ידי בלוק המערבי.</li>
</ol>

<ol><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li>
<li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li>
<li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li>
<li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina%2C+heart%2C+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li>
<li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li>
<li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li>
<li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li>
<li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archive%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206(2008).</li>
<li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+palmitoylation%2C+raft+localization%2C+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li>
<li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li>
<li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwissPalm%3A+Protein+Palmitoylation+database%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).</li>
<li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+%5B3H%5Dpalmitic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li>
<li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+are+IntechOpen+%2C+the+world%27s+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists%5BTitle%5D)+AND+%22Intech%22%5BJournal%5D)">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li>
<li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li>
<li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li>
<li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li>
<li>Rami, N., Hannoush, N. A. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+lipidome%3A+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li>
<li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li>
<li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li>
<li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li>
<li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li>
<li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+protein+S-acylation%3A+spotlight+on+structure%2C+mechanisms%2C+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li>
<li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li>
<li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+EBV-genome+negative+%22null%22+and+%22T%22+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li>
<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li>
<li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li>
<li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li>
<li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+%28PAG%29%2C+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein%2C+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li>
<li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li>
<li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystals%22%5BJournal%5D)">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li>
<li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+%28LYPLA1%29+and+lysophospholipase+2+%28LYPLA2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Probe+Reports+from+the+NIH+Molecular+Libraries+Program%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li>
<li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li>
</ol>

אין קונפליקטים של עניין מוצהר.

כאן, אנו מנוצל בהצלחה את הבחינה מירוץ acyl כדי לזהות S-אכלציה של חלבונים שנבחרו בתאי האדם התרבותי הן התאים הראשוניים הנגזרים מרקמת העכבר. שיטה זו היא פשוטה, רגישה, ניתן לבצע בקלות עם דרישות ציוד מינימלי באמצעות טכניקות ביוכימיה סטנדרטית. שיטה זו הוצגה בהצלחה לזהות חלבונים S-acylated הרומן כגון β-subunit של המערכת חלבון האיתור (Sec61b), חלבון הריבוזומS11 (Rps11), ו מיקרוזומיום הגלוטתיון-S-transferase 3 (MGST3)22. רגישות והסתגלות של מירוץ acyl הופך אותו מתאים ללמוד חלבון S-אכלציה במגוון של ...

S-אכלציה הוא שינוי הפיך לאחר ההעברה מעורבים תוספת של שרשרת acylation שומן לשאריות ציסטאין פנימי על חלבון היעד באמצעות בונד לבנה thioester1. הוא דווח לראשונה כשינוי של חלבונים עם palmitate, חומצה שומן רווי 16 פחמן2, ולכן שינוי זה מכונה לעתים קרובות S-palmitoyלציה. בנוסף palmitate, חלבונים יכולים להיות שונה למדי על ידי מגוון רחב יותר וקצר יותר רווי (myristate ו stearate), חד (oleate) ו רב בלתי רווי (ארכאידיט ו eאיסאופנטאנואט) חומצות שומן3,4,5,6,7. בתאי איקריוטית, S-אכלציה הוא מזרז על ידי משפחה של אנזימים המכונה acyltransferחלבונים החלבון ואת התגובה הפוכה של ציסטאין דאכלציה הוא מזרז על ידי חלבון החלבונים, שרובם עדיין להישאר המסתורית8.
היכולת של הקשר thioester עושה את זה שינוי השומנים הפיך, המאפשר לו להסדיר באופן דינאמי באשכולות חלבון, פלזמה ממברנה לוקליזציה, סחר תאיים, אינטראקציות חלבונים חלבון ויציבות חלבון9,10. כתוצאה מכך, S-אכלציה נקשר להפרעות מספר כולל מחלת הנטינגטון, מחלת אלצהיימר ומספר סוגים של סרטן (ערמונית, קיבה, שלפוחית השתן, ריאות, המעי הגס), אשר מחייב פיתוח של שיטות אמינות לזהות את שינוי החלבון הפוסט-טרנסלסטי11.
מטבולית תיוג עם רדיואקטיבי ([3H],[14ג] או [125אני]) palmitate היתה אחת הגישות הראשונות שפותחו כדי לשנות את החלבון S-אכלציה12,13,14. עם זאת, שיטות מבוססות רדיואולבלינג מציגים חששות בריאותיים, הם לא רגישים מאוד, זמן רב, ורק לגלות lipidation של חלבונים שופע מאוד15. חלופה מהירה ולא רדיואקטיבית radiolabeling היא תיוג מטבולית עם בדיקה חומצות שומן bioorthogonal, אשר משמש באופן שגרתי כדי שיטת הדינמיקה של חלבון S-אכלציה16. בשיטה זו, חומצת שומן עם כתב כימי (הקבוצה האלבית או עזידה) משולבים בחלבון S-acylated על ידי חלבון acyltransferase. התגובה של עזידה-אלקין (לחץ על כימיה) יכולה לשמש לחיבור קבוצה פונקציונליזציה, כגון fluorophore או biotin, לחומצת השומן המשולבת המאפשרת זיהוי של חלבון ה-S-acylated17,18,19.
Acyl-ביוטין החליפין (אייב) היא אחת השיטות הביוכימי בשימוש נרחב לכידה וזיהוי של חלבונים S-acylated העוקף כמה חסרונות של תיוג מטבולית כגון חוסר התאמה לדגימות רקמות15. ניתן ליישם שיטה זו לניתוח S-acylation במגוון מגוון של דגימות ביולוגיות, כולל רקמות ודגימות תאים קפואים20,21. שיטה זו מבוססת על מחשוף סלקטיבי של הקשר בין הקבוצה acyl ושאריות ציסטאין על ידי הידרוקסילאמין נייטרלי. הקבוצות המשוחררות שוחררו לאחר מכן באמצעות הנגזרת הביוטין התגובתית. חלבונים biotinylated שנוצר לאחר מכן מטוהרים אהדה באמצעות streptavidin agarose ונותחו על ידי החיסונית.
גישה חלופית הנקראת acyl שרף בסיוע לכידת (acyl מירוץ) הוצגה מאוחר יותר להחליף את הצעד biotinylation עם בניינים ישירים של cysteines חינם על ידי שרף thiol-תגובתי22,23. שיטה זו יש פחות צעדים לעומת אייב ובאופן דומה ניתן להשתמש כדי לזהות חלבון S-אכלציה במגוון רחב של דגימות1.
Acyl-מירוץ מורכב 4 צעדים עיקריים (איור 1), 1. חסימת קבוצות תיול חינם; 2. מחשוף סלקטיבי של בונד של ציסטאין thioester עם הידרוקסילין נייטרלי (HAM) לחשוף את הקבוצות ציסטאין. 3. לכידת cysteines הליפינס עם שרף מגיב thiol; 4. העשרה סלקטיבית של חלבוני S-acylated לאחר הימנעות עם הפחתת מאגר.
את החלבונים שנתפסו ניתן לנתח על ידי חיסוני או נתון המסה ספקטרומטריה (MS) מבוסס פרוטאומניקס להעריך את S-acylated פרוטדום במגוון מגוון של מינים ורקמות22,24,25. אתרים בודדים S-אכלציה ניתן גם לזהות על ידי טריפסין העיכול של חלבונים שנתפסו ניתוח של פפטידים הנובעים על ידי LC-MS/MS22. כאן, אנו מדגימים כיצד acyl מירוץ יכול לשמש זיהוי סימולטני של S-האכלציה של חלבונים מרובים הן בקו התא וגם דגימת רקמה.

<table><tbody><tr><td>cOmplete מעכב פרוטאז טבליות קוקטייל</td><td>סיגמא</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה אפנדורף 5424</td><td>אפנדורף</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקסילאמין (HAM)</td><td>סיגמא</td><td>159417</td><td></td></tr><tr><td>מתיל מתנתיוסולפונאט (MMTS)</td><td>סיגמא</td><td>64306</td><td></td></tr><tr><td>מיני מסובב צינור</td><td>LabForce</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ML211</td><td>Cayman</td><td>17630</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl & -D-maltoside (DDM)</td> <td>Sigma</td><td>D641</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פוספטאז 2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>תיופרופיל-ספרוז 6B (TS)</td> <td>Sigma</td><td>T8387</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonics Quantrex Sonicator</td><td>L &; ר</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי חלבון s-אכלציה באמצעות לכידת הסיוע acylation-שרף

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

חלבון s-אכלציה, המכונה גם S-palmitoylation, הוא שינוי הפיך לאחר ההעברה של שאריות ציסטאין עם חומצות שומן ארוכות בשרשרת באמצעות בונד לבנה thioester. S-אכלציה, המתעוררים כמנגנון הרגולציה הנרחב, יכול לווסת כמעט את כל ההיבטים של הפעילות הביולוגית של חלבונים, מפני היווצרות מורכבים לסחר בחלבונים ויציבות חלבונים. ההתקדמות האחרונה להבנת התפקוד הביולוגי של חלבון S-אכלציה הושגה בעיקר בשל התפתחות הכלים הביוכימיים החדשניים המאפשרים גילוי חזק ורגיש של חלבון S-אכלציה במגוון דגימות ביולוגיות. כאן, אנו מתארים לכידה בסיוע של acyl שרף (Acyl-מירוץ), שיטה שפותחה לאחרונה מבוסס על לכידת סלקטיבי של חלבונים S-acylated על ידי החרוזים הספרדית thiol-תגובתי. לעומת הגישות הקיימות, Acyl-מירוץ דורש פחות שלבים והוא יכול להניב תוצאות אמינות יותר כאשר ביחד עם ספקטרומטר המסה לזיהוי מטרות הרומן S-אכלציה. מגבלה מרכזית בטכניקה זו היא חוסר יכולת להפלות בין מינים של חומצת שומן המחוברים לציסטרינס באמצעות אותו קשר.

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, השתמשנו הראשון acyl-מירוץ כדי לזהות בו S-אכלציה של כמה חלבונים בתאים ורנל, קו תא T הונצח במקור נגזר דם היקפי של חולה לוקמיה של תא T27. החלבונים של תא T הרגולציה שזוהו בעבר כ-S-acylated9,28,29 נבחרו כדי להדגים את כלי השירות של שיטה זו. כפי שמוצג באיור 2a, טירולך קינאז lck ניתן להבחין ב lysates שטופלו עם נייטרלי 2 M הידרוקסילין כדי לדבוק את הקשר th...

Acyl-מירוץ (acyl-שרף בסיוע לכידת) הוא רגיש מאוד, אמין וקל לבצע שיטה לזיהוי שינוי השומנים הפיך של שאריות ציסטאין (S-acyl) במגוון של דגימות ביולוגיות.

זיהוי חלבון S-אכלציה באמצעות לכידת הסיוע Acylation-שרף

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Acyl-resin בסיוע לכידה או Acyl-RAC היא שיטה רגישה ואמינה שניתן להשתמש בה כדי לזהות S-acylation חלבון במגוון של דגימות ביולוגיות. פרוטוקול זה עוקף חלק מהמגבלות של תיוג מטבולי ותיוג רדיו, ומאפשר זיהוי בו זמני של S-acylation של חלבונים מרובים. לא רק תאים חיים אלא גם רקמות ראשוניות ודגימות קפואות.S-acylation יכול לווסת מגוון רחב של תהליכים תאיים כגון סחר בחלבון, מיקוד קרום פלזמה, העברת אותות, הובלת ברזל, אינטראקציות חלבון חלבון. חשוב להשתמש בתתכונת הידרוקסילאמין טרי עם pH מותאם בקפידה עבור כל ניסוי כדי להבטיח מחשוף יעיל וסופקסי של הקשר thioester. עם הדגמה של שיטה זו זה קריטי עבור צעדים כמו כלורופורם, משקעים מתנול.גלולת צורת פנקייק שהושגו במהלך שלב זה צריך להיות להתמודד בזהירות רבה. זה יכול להיות שביר ואובדן חלקי של המדגם במהלך השלב יכול להוביל להתאוששות מדגם אחיד. הפגנת ההליך תהיה סוואנה ווסט, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו.כדי להשיג ליאזטים התא, לאסוף את התאים של עניין לתוך צינור צנטריפוגה חרוט. ולהסיר כל פסולת תא על ידי צנטריפוגה. לשטוף את גלולה ב 5 מיליליטר של PBS.ומיד תן שימוש חוזר בתאים ב-600 מיקרוליטרים של מאגר תיזה טרי. להתסיס את המדגם ב 1, 500 מהפכות לדקה בשייקר תרמו במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לפני ניקוי lysates, חומר ניקוי גלולה מסיסים על ידי צנטריפוגה.בסוף הצנטריפוגה, לאסוף את lysate פינה בצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש 1.5 מיליליטר על קרח. ולבצע בדיקה של ברדפורד או חומצה ביצינצ'ונית כדי להעריך את ריכוז החלבון לפי פרוטוקולים סטנדרטיים. הוסף מתנול וכלורופורם כדי לתפורם ביחס של 2:1.לנער בקפדנות כדי ליצור השעיה הומוגנית צנטריפוגה המדגם כדי לאסוף גלולת חלבון בממשק בין שלבים מיוירי ואורגני. הטיית הצינור, להשתמש במחט או קצה טעינת ג'ל כדי לשוות כמה שיותר ממס. אוויר לייבש את גלולת החלבון במשך כמה דקות.לפני ערבוב עדין של תכולת הצינור עם 600 מיקרוליטרים של מתנול, דואג לא לשבור את גלולה. לאחר הסרת מטנול בזהירות לשטוף, לייבש את גלולת החלבון על ספסל העליון במשך כחמש דקות. לאחר מכן, לחץ מחדש על גלולת החלבון ב-200 מיקרוליטרים של חיץ 2SHB.ומערבולת ב 42 מעלות צלזיוס ו 1, 500 מהפכות לדקה בשייקר תרמו. כאשר גלולה מומס, להוסיף 200 microliters של 0.2%MMTS ב 2SHB לדגימה. ולהדקר את החלבון במשך 15 דקות ב 42 מעלות צלזיוס ו 1, 500 מהפכות לדקה בשייקר תרמו.בסוף הדגירה, לבצע 3:4 כלורופורם-מתנול משקעים כפי שהוכח. כדי להסיר את MMTS, להמיס את גלולה ב 100 microliters של חיץ 2SHB טרי עם מערבולת. ולדלל את המדגם עם 300 microliters של חיץ A לאחר כל משקעים.לאחר המשקעים הסופיים, להמיס את הדגימות ב 200 microliters של חיץ 2SHB לדלל עם 240 microliters של חיץ A.Measure ריכוז החלבון שוב להפריש 40 microliters מכל מדגם כמו פקדי קלט. לפצל דגימות לשני כרכים שווים של 200 מיקרוליטרים. ולסמן את הצינורות כמו בתוספת הידרוקסילאמין ומינוס הידרוקסילאמין.הוסיפו 50 מיקרוליטרים של הידרוקסילאמין ניטרלי טרי לריכוז סופי של 400 מילימולאר לצינור פלוס הידרוקסילאמין. ו-50 מיקרוליטרים של נתרן כלורי ניטרלי שני טוחנים לשליטה השלילית, צינור הידרוקסילאמין מינוס. לאחר מכן להוסיף 30 microliters של תרחיף חרוזים TS לכל צינור.ולסובב את הצינורות במשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה לשטוף את חרוזים ארבע פעמים עם 1% SDS במאגר A כדי להסיר כל הידרוקסילאמין שיורית. לאחר הכביסה האחרונה, לשטוף את כל דגימות חרוזים עם שלושה microcentrifugations דקה אחת עדינה.שאפו בזהירות את העל-טבעיים והתלכלו מחדש את חרוזים ב-500 מיקרוליטרים של 1%SDS במאגר A בכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, בעדינות לסובב את חרוזים כפי שהוכח. ושואפים כמה שיותר על-טבעי מבלי להפריע לעליזים.כדי לשחזר את החלבונים מהחרוזים, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של חיץ דגימת 4%SDS לכל צינור והדגירה את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס ו-1,500 מהפכות לדקה למשך 15 דקות בשייקר תרמו. בסוף הדגירה, תן את הדגימות להתקרר לפני צנטריפוגה לחלוטין גלולה את חרוזים. לאחר מכן השתמשו בקצה טעינת ג'ל כדי להעביר את החלבונים האלודים לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר.ולהפעיל את הדגימות על ג'ל SDS-PAGE כדי לנתח את S-acylation של חלבונים של עניין על ידי כתמים מערביים. טירוסין קינאז Lck ניתן לזהות בליזטים שטופלו ניטרלי שני הידרוקסילאמין טוחן. כדי לחשוף את הקשר thioester בין שאריות ציסטאין ואת moiety חומצת שומן.הפשטה ו reprobing עם נוגדנים נגד חלבונים Fyn ו LAT להדגים כי acyl-שף סייע ללכוד assay ניתן להשתמש כדי לנתח S-acylation של חלבונים מרובים בו זמנית. בנוסף, S-acylation של Lck, Fyn, ו LAT ניתן לזהות בקלות טחול העכבר הראשי. המציין כי שינוי זה שמור בין שני מינים.בנוסף לזיהוי של חלבונים S-acylated הרומן, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך שינויים S-acylation חלבון בתנאים ביולוגיים שונים. מספר החלבונים החדשים שזוהו S-acylated גדל מאוד לאחר כפול למעלה פירושו טכניקה מהירה ואמינה כגון Acyl-RAC. בנוסף לזיהוי של חלבונים S-acylated הרומן, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך שינויים S-acylation חלבון בתנאים ביולוגיים שונים.

detection-of-protein-s-acylation-using-acyl-resin-assisted-capture

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

תרכובות לכידת הם מולקולות קטנות trifunctional כדי להפחית את המורכבות של proteome על ידי תפקודית אינטראקציה הפיך מולקולות חלבון קטן ואחריו crosslinking-צילום טיהור. כאן אנו משתמשים מתחם לכידת...

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

חלבונים בתא שטח הם חשובים מבחינה ביולוגית וglycosylated באופן נרחב. אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד לsolubilize, להעשיר, וdeglycosylate חלבונים אלה לניתוחי proteomic מבוססים LC-MS קליל.

Glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הנדרשים לביצוע בדיקות דה-אצטילציה במבחנה וב-vivo על מנת לבסס את תפקידם של חלבונים כמצעי דה-אצטילציה ספציפיים עבור סירטואינים ולחקור עוד יותר את תפקידו של הפיך - אצטילציה של ליזין כשינוי לאחר תרגום.

Deacetylation מבחנים כדי לפענח את יחסי הגומלין בין סירטואינים (SIRT2) ו-מצעי חלבון מסוימים

אנו מתארים שיטה ליצירת לוקליזציה וטיהור זיקה (LAP) קווי תאים יציבים הניתנים להשראה לחקירת תפקוד חלבון, לוקליזציה תת-תאית מרחבית-זמנית ורשתות אינטראקציה בין חלבון-חלבון.

LAP-tagged מושרה שורות תאים יציבות על תפקוד החלבון חוקר, Spatiotemporal לוקליזציה רשתות אינטראקציה חלבון

חומצה sialic היא אופיינית חד-סוכר-יחידה נמצאו ב- glycoconjugates. זה מעורב שפע של אינטראקציות מולקולרית, תאית. כאן אנו מציגים שיטה כדי לשנות את תא השטח חומצה sialic הביטוי תוך שימוש glycoengineering מטבולית עם N- acetylmannosamine נגזרים.

Glycoengineering מטבולית של חומצה Sialic באמצעות N-acyl השומן-שונה Mannosamines

חוקרים רבים, שינויים post-translational אנדוגני על חלבון המטרה יכול להיות מאוד מאתגר. טכניקות המתוארים כאן לנצל את פירוק ממוטבת מאגר ומסנן מערכת שפותחה עם ספציפי PTM פילוח, מטריצות זיקה לזהות את השינויים זרחון acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 וטירוזין עבור מטרה חלבון באמצעות מערכת יחיד, יעיל.

ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

כאן, אנו מציגים כימות לא משוחדת של חלבון ספציפי לאתר acetylation ו/או succinylation תפוסה (סטויכיומטריה) של פרוטאום כולו באמצעות ניתוח רציומטרי של שינויים אנדוגני שינויים שהוכנסו לאחר כמותיים acylation כימי באמצעות anhydrides התווית על-ידי איזוטופ יציב. בשילוב עם ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים רגישים, מתקבלים באתר מדויק תפוסת מדידות.

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

זרימת עבודה זו מתארת את ביצועי הזמן והעשרת העלויות היעילות של שינויים מרובים בחלבון שלאחר ההעברה (לפטין) בו זמנית עבור ניתוח פרוטמית גלובלי כמותי. הפרוטוקול מנצל את העשרה ברמת הפפטיד PTM עם נוגדנים מרובה מצוחים, ואחריו נתונים עצמאיים רכישה המסה ניתוח ספקטרומטר מאסה כדי לקבל תובנות ביולוגיות לתוך הוצלב PTM.

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

המחקר של acylation שומן יש השלכות חשובות אינטראקציות חלבון הסלולר ומחלות. מוצג כאן הוא פרוטוקול שונה כדי לשפר את זיהוי הכימיה קליק של חלבונים acylated שומן, אשר ניתן ליישם בסוגי תאים שונים בשילוב עם בדיקות אחרות, כולל מרדף דופק ספקטרומטריית מסה.

שילוב ממוטב של אנלוגים לחומצת שומן אלקיניל לגילוי חלבונים אצטט שומניים באמצעות כימיה קליק

לחמצון חלבון תיול יש השלכות משמעותיות בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים רגילים. אנו מתארים את הפרטים של שיטת פרוטאומיקה כמותית של חמצון-חיזור, המשתמשת בלכידה בסיוע שרף, תיוג איזוברי וספקטרומטריית מסה, ומאפשרת זיהוי וכימות ספציפיים לאתר של שאריות ציסטאין מחומצנות באופן הפיך של חלבונים.

לכידה בסיוע שרפים בשילוב עם תיוג תג מסת טנדם איזוברי לכימות מרובב של חמצון חלבון תיול

למד את שיטת Acyl-RAC לזיהוי S-אכלציה של חלבונים בדגימות ביולוגיות שונות. שיטה זו מאפשרת איתור רגיש ואמין של שינויים ליפידיים בחלבונים בתאים חיים, רקמות ראשוניות ודגימות קפואות.

זיהוי חלבון S-אכלציה באמצעות לכידת הסיוע Acylation-שרף

גלה סרטונים נוספים