Name: Acyl-PEGyl החליפין גל שינוי שיטת להגדרה כמותית של פלמילציה של חלבונים קרום המוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: חקור את שיטת APEGS לזיהוי פלמילציה בחלבוני קרום מוח עכברים ללא צורך בטיהור אפיניות. שיטה זו מאפשרת ניתוח מהיר ויעיל של שינויים בחלבונים באמצעות שינויים בניידות ג'ל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לג וולפריי לקבלת ייעוץ וכניסה בנוגע לשיטת ה-אפגס. מחקרים אלה היו ממומנים על ידי מענקי מחקר כדי E.D. מן הקרן וייטהול ו NIH-NIMH (1R01MH119347).

כל הליכים בעלי חיים בעקבות ההנחיות שנקבעו על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת קליפורניה, דיוויס.
1. הכנת קרום מוח העכבר
<ol><li>עכבר מערוף את ראשו באמצעות מכשיר הגיליוטינה ולנתח את המוח החוצה במהירות (ב< 1 דקות, אם אפשרי, כדי למזער שינויים בפלמיטלציה שעלולים להתרחש במהלך הליך הניתוח). המגון באופן מיידי ב 10 מ ל של מאגר הומומטר (שולחן 1) בתוך זכוכית הומוגניצר (~ 12 משיכות) על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה לעבור 15 דקות ב 1,400 x g ב 4 ° c. להעביר את הסופרנטאנט. לצינור חדש על הקרח השהה מחדש את הגלולה (~ 6 משיכות) בנפח שווה של מאגר החלשת ההגון וצנטריפוגה ב 710 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>לשלב את supernatants משלב 1.2 ו צנטריפוגה ב 40,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>למחוק את הסופרנטנט (שבר ציטוזה) ולהשעות מחדש את הקרום פלאד (P2) שבר במאגר המגון. הערה: דגימות יכול להיות פלאש קפוא ומאוחסן ב-80 ° c לשימוש מאוחר יותר.</li>
	<li>ביצוע חומצה בבינובית (BCA) שיטת בדיקת רמות החלבון בקוונטייט. עבור הצורך של ה-אפגס, התחל עם ~ 100-200 מ ג חלבון (מקסימום 250 mg) בנפח של 470 μL של מאגר A (טבלה 1) בשפופרת 1.5 mL. Sonicate וצנטריפוגה ב-> 13000 x g עבור 10 דקות ב 25 ° צ' כדי להסיר חלבון לא מסיסים. העבר חלבון מסיסות לצינור חדש 1.5 mL.</li>
</ol>2. שיטת ה-acyl-PEGyl החלפת ג'ל
<ol><li>הפרעה באיגרות חוב דיסולניות וחסום את הקיסטרינס החופשיים.<ol>
<li>לשבש את איגרות החוב קשר דיסולפידי על ידי הארגדירוג ב -25 מילימטר טריס (2-carboxyethyl) פוספטין (tcep; 25 μl, התווסף מתוך פתרון מניות; שולחן 1) עבור 60 דקות ב-55 ° c.</li>
		<li>לחסום cysteines חינם עם 50 mM N-ethylmaleimide (NEM; 12.5 μL, נוסף מתוך פתרון מניות; שולחן 1) בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות. הערה: ניתן להאריך את התגובה למשך הלילה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביצוע כלורופורם מתנול (CM) משקעים.<ol>
<li>העבר את התמיסה חלבון מ 1.5 mL צינור פוליפרופילן או זכוכית צינור שיכול להיות centrifuged ברוטור דלי מנופף במהירות צנועה. שפופרת של 5 מ ל הינה אידיאלית. הוסף ארבעה אמצעי אחסון (2 מ ל) של מתנול (MeOH) ומערבולת בקצרה.</li>
		<li>הוסף שני כרכים (1 מ ל) של כלורופורם ומערבולת בקצרה.</li>
		<li>הוסף שלושה כרכים (1.5 mL) של dH2O ו וורטקס לזמן קצר.</li>
		<li>צנטריפוגה את דגימות ב 3,000 x g עבור 30 דקות ב 25 ° c ב רוטור דלי מנופף.</li>
		<li>הסר והתעלם בזהירות מהשלב העליון.</li>
		<li>להוסיף 3 אמצעי אחסון (1.5 mL) של MeOH ולערבב בעדינות אבל ביסודיות, להיות זהירים לא רסיס פנקייק חלבון אטום.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 10 דקות ב 25 ° c ב רוטור דלי מנופף.</li>
		<li>באמצעות זכוכית הסרת המחמד, להסיר כמה השלב העליון ככל האפשר מבלי להפריע פנקייק חלבון.</li>
		<li>שטפו בזהירות את הגלולה עם 1 מ ל של MeOH.</li>
		<li>האוויר יבש את הגלולה. לפחות 10 דקות הערה: ניתן לאחסן את הגלולה היבשים ב-20 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע מחשוף של הקשר הפלמיאוקסיל-thioester עם הידרוקסילמין (NH2הו, HAM).<ol>
<li>השהה מחדש את מזרז החלבונים ב-125 μL של מאגר A וsonicate בקצרה. צנטריפוגה ב > 13000 x g עבור 10 דקות ב 25 ° צ' כדי להסיר חומר לא מסיסים. העבר חלבון מסיסות לצינור חדש 1.5 mL.</li>
		<li>הוסף 375 μL של מאגר H (HAM +; שולחן 1) או מאגר T (HAM-; שולחן 1) ודגימות הדגירה של 60 דקות ב -25 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על משקעים CM המתוארים בשלב 2.2. הערה: ניתן לאחסן את הגלולה היבשים ב-20 ° c.</li>
	<li>הוסף mPEG לציסטרינס לא מוגנים.<ol>
<li>השהה את הגלולה מחדש ב-100 μL של מאגר A המכיל 10 מ"מ TCEP. . העבר לצינור 1.5-mL הערה: זה נורמלי לאובדן משמעותי של חלבונים שהתרחשו במהלך שלבי משקעים CM. כל השלבים הבאים יבוצעו בצינור 1.5 mL, מגביל את נפח החלבון עד למקסימום של ~ 120-130 μL. זה יפחית את אובדן החלבון בזמן המשקעים הסופיים.</li>
		<li>הוסף 20 מ"מ mPEG-5k (25 μL, נוסף מפתרון מניות; שולחן 1) לדגימת חלבונים ומערבבים באמצעות ליטוף. מודטה עבור 60 דקות ב-25 ° צ' עם סיבוב מהסוף לקצה.</li>
		<li>כדי להסיר mPEG-5k משולב, לבצע משקעים CM כמתואר בשלב 2.2 באמצעות אלה אמצעי אחסון מנוכי: 4 כרכים של MeOH (500 μL), 2 כרכים של כלורופורם (250 μL), ו 3 כרכים של dH2O (375 μl). צנטריפוגה ב > 13000 x g עבור 10 דקות ב 25 ° c.</li>
		<li>הסר בזהירות את השלב העליון כמו לפני, הימנעות פנקייק עבה, לוקקולאנט. הוסף 1 מ ל של MeOH ולערבב בעדינות אבל ביסודיות. צנטריפוגה ב > 13000 x g עבור 10 דקות ב 25 ° c.</li>
		<li>הסירו בזהירות את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה עם 1 מ ל של MeOH. צנטריפוגה ב > 13000 x g עבור 10 דקות ב 25 ° c. . כבשי אוויר יבשה הערה: ניתן לאחסן את הגלולה היבשים ב-20 ° c.</li>
		<li>השהה מחדש את הגלולה מיובשים ב 50 μL של מאגר A (ללא TCEP או כל סוכן הפחתת). שריין 5 μL עבור כימות חלבון BCA. לאחר כימות, להוסיף כמות מתאימה של מאגר לדוגמה 4x Laemmli ו, בהתאם חלבון הריבית, לחמם את הדגימה ל 70-100 ° צ' עבור 10 דקות. הערה: הרתיחה עלולה לגרום לצבירה של כמה חלבונים קרום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ניתוח כתמי האבן המערבי של החלבונים הקשורים
<ol><li>לטעון את המדגם על נתרן dodecyl סולפט פוליאקרילמיד ג'ל (SDS-עמוד) ג'ל13. הערה: בפרוטוקול זה שימש 10% פוליאקרילאמיד.</li>
	<li>השתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים של הפרדה, העברה וזיהוי של14.</li>
	<li>השתמש בdensi,14 כדי לקבוע את הכמויות היחסיות של הפגינן לעומת החלבונים שאינם מפעילים.</li>
</ol>

<ol><li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li>
<li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li>
<li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li>
<li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li>
<li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG1%3A+an+activity-regulated%2C+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li>
<li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability%2C+Localization%2C+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li>
<li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+proteins%3A+purification+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li>
<li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+%28APEGS%29+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li>
<li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li>
<li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science+Education+Database.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG4%2FPrrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li>
<li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca%282%2B%29-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li>
<li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79%2F150%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

בעבודה הקודמת שלנו, אנו משתמשים באותו שיטת אייב כדי להדגים כי SynDIG1 הוא palmitoylated בשני משקעי juxta שימור ממברנה Cys (נמצא כל החלבונים SynDIG חפור) באופן תלוי הפעילות כדי לווסת את היציבות, הלוקליזציה, פונקציה6. מגבלה היא כי שיטת אייב דורש טיהור אהדה עם שרפים agarose מצומת אבידין moieties כשלב הסופי בהליך, וכתוצאה מכך אובדן משמעותי של האות המדסבך את האנליזה הכמותית. יתרה מזאת, שיטת ה-ABE אינה יכולה להבחין אם החלבון הוא מפלאויום או באתרים מרובים.
כאן אנו משתמשים בשיט...

S-palmitoylation הוא שינוי הפיך לאחר השינוי של חלבונים היעד המסדיר האיגוד קרום יציב, סחר בחלבונים, ואינטראקציות חלבונים חלבון1. זה כולל תוספת של 16-פחמן palmitate moiety כדי שאריות ציסטאין באמצעות הצמדה מזרז ההצמדה של palmitoyl (PAT) אנזימים. חלבונים סינפטית רבים במוח הם palmitoylated, כולל האמפא-Rs ו-PSD-95, באופן התלוי בפעילות כדי להסדיר את היציבות, הלוקליזציה והפונקציה2,3,4. שינויים ברמות הסינפטית של AMPARs ב-PSD באמצעות האינטראקציה של גורמי עזר עם הפיגומים הסינפטית כגון PSD-95 ביסוד הפלסטיות הסינפטית; לכן, שיטות לקבוע את מצב הפלמיטלציה של חלבונים סינפטית מספק תובנה חשובה למנגנונים של פלסטיות סינפטית.
בעבר, זיהינו את משפחת SynDIG של ארבעה גנים (SynDIG1-4) קידוד המוח מסוים חלבונים טרנסקרום הקשר עם AMPARs5. ביטוי יתר או להפיל את SynDIG1 בתוך היפואת הנוירונים ההיפוקמא היפוקרטס מגדילה או פוחתת, בהתאמה, מזהה ה-, מספר ה-הסינפסה-R ו-x ב-~ 50% כפי שזוהה באמצעות האימונוציטוכימיה ואלקטרופיזיולוגיה5. אנו מנוצל החליפין acyl-biotin (אייב) מאפשר להדגים כי SynDIG1 הוא palmitoylated בשני שאריות juxta-transממברני (נמצא בכל החלבונים SynDIG חפור) באופן תלוי הפעילות כדי לווסת את היציבות, הלוקליזציה, פונקציה6. השיטת אייב מסתמכת על חילופי ביוטין על cysteines מוגן על ידי שינוי וטיהור אהדה הבאים7. כאן, אנו מתארים גישה ביוכימית חדשנית, שינוי החליפין של ה-acyl-pegyl (אפגס), הקובע8,9,10,11,12, שאינו דורש טיהור אהדה ובמקום זאת מנצל שינויים בניידות ג'ל כדי לקבוע את מספר השינויים עבור חלבון מעניין. הפרוטוקול מתואר לחקירה של חלבונים ממברנה אנדודוגני ממוח העכבר שעבורו נוגדנים מתאימים זמינים.

<table><tbody><tr><td>הידרוקסילאמין (HAM)</td><td>ThermoFisher</td><td>26103</td><td></td></tr><tr><td>מתוקסי-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td><td>NOF</td><td>ME-050MA</td><td>MW ~ 5000 kDa</td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>או ציוד שווה ערך</td></tr><tr><td>N-ethylmalemide (NEM)</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>רעיל מאוד.</td></tr><tr><td>הדמיה אופטית לצפיפות</td><td>Azure</td><td>Biosystems Sapphire Biomolecular Imager</td><td>או ציוד שווה ערך</td></tr><tr><td>צינורות פוליפרופילן עם מכסה</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-1D</td><td></td></tr><tr><td>צנרת סרולוגית (זכוכית)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27D</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td>או ציוד</td></tr> <tr><td>שווה ערךטריס (2-קרבוקסיאתיל) פוספין-הידרוכלוריד (TCEP)</td> <td>EMD Millipore</td><td>580560</td><td></td></tr></tbody></table>

acyl-pegyl החליפין ג'ל שינוי שיטת להגדרה כמותית של פלמילציה של חלבונים קרום המוח

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

שינויים תלויי-הפעילות ברמות קולטני הסינפטיות (AMPARs) בתוך צפיפות הפוסט-סינפטית (PSD) נחשבת לייצוג מנגנון הסלולר ללמידה ולזיכרון. Palmitoylation מסדיר את הלוקליזציה והתפקוד של חלבונים סינפטיים רבים כולל אמפא-Rs, גורמי עזר ומקפלים סינפטיים באופן תלוי-פעילות. זיהינו את הסינפסה המושרה גן (syndig) משפחה של ארבעה גנים (SynDIG1-4) קידוד המוח מסוים חלבונים חלבון טראנסממברנלי השייך ampars ולווסת את הכוח סינפסה. SynDIG1 הוא palmitoylated בשני שאריות ציסטאין הממוקמים במיקום 191 ו 192 באזור juxta-טרנסקרום חשוב עבור פיתוח התפתחות הפעולה התלויית-סינפסה. כאן, אנו מתארים גישה חדשנית ביוכימית, משמרת ג'ל החליפין של acyl-PEGyl (אפגס), כדי לחקור את מצב הפלמיטלציה של כל חלבון של עניין ולהדגים את כלי השירות שלה עם משפחת הסינדיג של חלבונים במוח העכבר lysates.

המוח החיסוני עם נוגדנים נגד חלבון הריבית חושף את המדינה palmitoylated (לא, ביחידים, כפליים, וכו ') במוחו מוחית העכבר כפי שנקבע על ידי משמרת ניידות לעומת דגימות שבהן HAM לא נכלל. קודם לכן, הדגמנו שSynDIG1 הייתה בשני אתרים באמצעות שיטת אייב6; עם זאת, לא יכולנו לקבוע אם שני האתרים שונו ברקמת המוח. כאן אנו מראים כי SynDIG1, SynDIG4/Prrt1, ו Prrt2 הם palmitoylated במוח העכבר וכי יש להם שני אתרים פוטנציאליים הפלמיטציה (איור 1). מעניין, לכל ח...

Palmitoylation כרוך התאגדות של 16-פחמן palmitate moiety לשקעי ציסטאין של חלבונים היעד בצורה הפיכה. כאן, אנו מתארים גישה ביוכימית, השינוי של ה-acyl-PEGyl משמרת ג'ל, כדי לחקור את מצב הפלמיטלציה של כל חלבון של עניין במוח העכבר ליסביטים.

Acyl-PEGyl החליפין ג'ל שינוי שיטת להגדרה כמותית של פלמילציה של חלבונים קרום המוח

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

שיטה ביוכימית זו מאפשרת לקבוע את מצב הפלמיטוילציה של כל חלבון קרום המובע במוח שעבורו זמין נוגדן מתאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת טיהור זיקה ובמקום זאת משתמשת בשינויים בניידות הג'ל כדי לקבוע את מספר השינויים של חלבון מעניין. לאחר ניתוח המוח, הומוגניזציה זה מיד 10 מיליליטר של חיץ הומוגניזציה homogeneizer זכוכית על קרח.באמצעות כ 12 משיכות, צנטריפוגה lysates במשך 15 דקות ב 1400 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס. העבר את העל-טבעי לצינור חדש על הקרח. תן שימוש חוזר את גלולה ב 10 מיליליטר של חיץ הומוגניזציה.הומוגניזציה זה באמצעות כשש משיכות. צנטריפוגה ההשעיה ב 710 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מערבבים את העל-טבעיים ואת הצנטריפוגות ב-40,000 פעמים G ו-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את שבר הממברנה המוגלתי במאגר הומוגניזציה על-ידי פירוק גלולה עם קצה פיפטה וצנרת למעלה ולמטה. בצע בדיקת ABCA לכמת את רמות החלבון. כדי לבצע את בדיקת APEGS, מקם 470 מיקרוליטרים של מאגר A בצינור של 1.5 מיליליטר והוסף כ-100 עד 200 מיליגרם חלבון.Sonicate הצינור ולאחר מכן להפריד את החלבון מסיסים על ידי צנטריפוגה הצינור ב 25 מעלות צלזיוס ומינימום של 13, 000 פעמים G במשך 10 דקות. מעבירים את החלבון המבודד לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. ראשית, לשבש את הקשרים disulphide על ידי דגירה חלבון מסולובל ב 25 microliters של TCEP במשך 60 דקות ב 55 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, לחסום ציסטאינים חינם על ידי דגירה הפתרון עם 12.5 microliters של פתרון המלאי של NEM במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להתחיל את התהליך של משקעים מתנול כלורופורם. מעבירים את ת פתרון החלבון מצינור 1.5 מיליליטר לצינור פוליפרופילן או זכוכית שניתן לצנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד במהירות צנועה.מוסיפים שני מיליליטר של מתנול ומערבולת לזמן קצר. הוסף מיליליטר אחד של כלורופורם ומערבולת בקצרה. לאחר מכן להוסיף 1.5 מיליליטר של מים deionized ומערבולת בקצרה שוב.במידת הצורך, להפוך את הצינור כדי להבטיח ערבוב יסודי. צנטריפוגה הדגימות ב 3000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות רוטור דלי מתנדנד. בזהירות להסיר ולזרוק את השלב העליון של הפתרון בצינור.הוסף 1.5 מיליליטר של מתנול. מערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך עדין של הצינור, נזהרים לא לפצל את פנקייק החלבון אטום. צנטריפוגה המדגם ב 3000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות רוטור דלי מתנדנד.באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית, להסיר כמה שיותר של השלב העליון של הפתרון ככל האפשר מבלי להפריע פנקייק חלבון. בזהירות לשטוף את גלולה עם מיליליטר אחד של מתנול ולאפשר לו אוויר יבש לפחות 10 דקות. עם משקעים מתנול כלורופורם להשלים, להתחיל את המחשוף של הקישורים thioester palmitoyl על ידי שימוש חוזר את החלבון לזרז 125 microliters של חיץ A.Transfer לצינור חדש 1.5 מיליליטר.Sonicate הצינור לזמן קצר ולאחר מכן צנטריפוגה זה ב 13, 000 פעמים G ומעלה ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להסיר חומר מסיס. מעבירים את החלבון המבודד לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר ומוסיפים 375 מיקרוליטרים של חיץ H או חיץ T.לאחר הדגירה של הדגימות במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר, חזרו על משקעים כלורופורם מתנול. כדי להוסיף m-PEG לציסטאין לא מוגן, התחל על ידי שימוש חוזר את גלולה ב 100 microliters של חיץ A המכיל 10 מיליון או יותר TCEP.ואז להעביר את ההשעיה לצינור 1.5 מיליליטר. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תוסף M-PEG 5K למלאי וערבבו לפי צינורות. דגירה בטמפרטורת החדר עם סוף על סיבוב סוף.לאחר 60 דקות של דגירה, להסיר m-PEG 5K מאוגד על ידי ביצוע משקעים מתנול כלורופורם שוב. צנטריפוגה מעל 13, 000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בזהירות להסיר את השלב העליון כמו קודם, הימנעות עבה, פנקייק flocculent.מוסיפים מיליליטר אחד של מתנול ומערבבים בעדינות אך ביסודיות. צנטריפוגה מעל 13, 000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בזהירות להסיר את supernatant ולשטוף את גלולה עם מיליליטר אחד של מתנול.שוב, צנטריפוגה מעל 13, 000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר ייבוש האוויר את גלולה, resuspend אותו 50 microliters של חיץ A ללא TCEP או כל סוכן צמצום. שמור 5 מיקרוליטרים של הפתרון עבור כימות חלבון BCA.לאחר כימות, להוסיף כמות מתאימה של מאגר מדגם 4x Laemmli. טען את הדגימה לג'ל דף SDS. השתמש בפרוטוקולי העברה וזיהוי סטנדרטיים של הפרדה עבור כתמים מערביים.כדי לחקור את מצב palmitoylation של חלבוני SynDIG, שברי קרום P2 ממוחות עכבר הומוגניים היו נתונים לבדיקת APEGS. הפרדה ובדיקת נוגדנים הראו כי SynDIG1, SynDIG4 Prrt1, ו Prrt2 הם palmitoylated במוח העכבר. מטרת משקעים מתנול כלורופורם היא למנוע כימיקל אחד, כגון NEM, להפריע לשלב הבא של הפרוטוקול.משקעים מתנול כלורופורם נאות יסיר כימיקלים לא רצויים תוך מזעור אובדן חלבון. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על lysates המוח מעכברים בגילאים שונים או מאזורי מוח שונים כדי לחקור את התקנות המרחביות-זמניות של palmitoylation.

acyl-pegyl-exchange-gel-shift-assay-for-quantitative-determination

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

הסרטון מדגים את ניתוח מצב הפלמיטוילציה של חלבוני קרום התא המבודדים מרקמת מוח העכבר. התהליך כולל חשיפת הציסטאין הלא-פלמיטוילטי וחסימתם, ולאחר מכן שימוש בפולימר שנקשר לציסטאין הפלמיטוילטי, ומסייע בהערכת מצב הפלמיטוילציה של החלבונים המבודדים.

הערכת מצב הפלמיטוילציה של חלבוני קרום התא מרקמת מוח של עכבר

בנוסף ההפיך של Palmitate לחלבונים הוא רגולטור חשוב של סחר בחלבונים תאי. זו היא עניין מיוחד בתאי עצב שבו חלבונים סינפטיים רבים palmitoylated. אנו משתמשים בשיטה ביוכימית פשוטה לזהות חלבונים בתאי עצב בתרבית palmitoylated, שניתן להתאים למספר רבים של סוגי תאים ורקמות.

איתור של palmitoylation חלבון בנוירונים ביפוקמפוס מתורבתים ידי immunoprecipitation וacyl-Exchange ביוטין (אייב)

סחר קרום עצבי דינמי שולט זמינה פלזמה קרום חלבון ומשמעותי עצבית משפיע. נכון להיום, זה כבר מאתגר למדוד סחר endocytic עצבי בנוירונים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה מאוד, כמוני למדידת שינויים מהירים בביטוי חלבון פני השטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

Acyl-מירוץ (acyl-שרף בסיוע לכידת) הוא רגיש מאוד, אמין וקל לבצע שיטה לזיהוי שינוי השומנים הפיך של שאריות ציסטאין (S-acyl) במגוון של דגימות ביולוגיות.

זיהוי חלבון S-אכלציה באמצעות לכידת הסיוע Acylation-שרף

מוצג כאן מבחן פלואורסצנטי רגיש לניטור פעילות אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז באמצעות פפטיד דיאצילגליצריל ואלקין-פוספוליפידים כמצעים עם כימיה של קליקים.

בדיקה פלואורומטרית מבוססת קליק-כימיה עבור אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז מאיפיון אנזים ועד סינון תפוקה גבוהה

המחקר של acylation שומן יש השלכות חשובות אינטראקציות חלבון הסלולר ומחלות. מוצג כאן הוא פרוטוקול שונה כדי לשפר את זיהוי הכימיה קליק של חלבונים acylated שומן, אשר ניתן ליישם בסוגי תאים שונים בשילוב עם בדיקות אחרות, כולל מרדף דופק ספקטרומטריית מסה.

שילוב ממוטב של אנלוגים לחומצת שומן אלקיניל לגילוי חלבונים אצטט שומניים באמצעות כימיה קליק

כאן, אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות חיישני שומנים פלואורסצנטיים וליפוזומים כדי לקבוע אם חלבון מחלץ ומעביר פוספטידילסרין או פוספטידילינוזיטול 4-פוספט במבחנה.

מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות

אנו מתארים שיטה לשימוש בציקלודקסטרין כדי לתווך חילופי שומנים של קרום הפלזמה עם ליפידים אקסוגניים. ניתן לשלב טכניקה זו עם ניסויים החוקרים חלבונים טרנסממברניים, המתנהגים באופן שונה בסביבות דמויות רפסודת שומנים מאשר בסביבות שאינן דמויות רפסודה.

בדיקת חילופי שומנים בתאים חיים

מחקר זה מתאר שיטות ניסוי לאפיון ביוכימי של GFAP והמוטציות הגורמות למחלות, תוך התמקדות בהרכבת פילמנט, הצבירה ושינוי פוסט-תרגום. נבדקו בחלבוני GFAP טהור גבוה, וחשפו תובנות לגבי מנגנוני מחלת אלכסנדר שעשויים לספק מסגרת לחקר מטרות טיפוליות פוטנציאליות ולהבנת מוטציות GFAP והפרעות נלוות.

גישות ניסיוניות לניתוח ביוכימי של חלבון חומצי סיבי גליאלי ושל וריאנטים הקשורים למחלה

חקור את שיטת APEGS לזיהוי פלמילציה בחלבוני קרום מוח עכברים ללא צורך בטיהור אפיניות. שיטה זו מאפשרת ניתוח מהיר ויעיל של שינויים בחלבונים באמצעות שינויים בניידות ג'ל.

Acyl-PEGyl החליפין ג'ל שינוי שיטת להגדרה כמותית של פלמילציה של חלבונים קרום המוח

גלה סרטונים נוספים