הפוך תמלול לולאה בתיווך איזותרמי הגברה (RT-מנורה) שיטת הזיהוי הספציפי והמהיר של וירוס אמנון לייק
18 במאי 2020
אנו מציגים שיטת RT-מנורה לגילוי של TiLV בדגים אמנון באמצעות כלים פשוטים על פני תקופה קצרה יחסית של זמן לעומת טכניקות RT-PCR קונבנציונאלי. פרוטוקול זה עשוי לעזור לשלוט על התפשטות המגיפה של TiLVD, במיוחד במדינות מתפתחות.
נגיף אגם אמנון הוא וירוס מתפתח ופתוגנים מדבקים, הגורמים לתמותה גבוהה בא אמנון והמינים ההיברידיים שלו. כמו אמנון הוא מקור החלבון העיקרי עבור מדינות מתפתחות רבות, זיהום הנגיף החדש יש השפעה רבה על חקלאות ימית אמנון, וגם מאיים על ביטחון המזון העולמי. פיתוח שיטה מהירה, מדויקת ורגישה לגילוי הנגיף ברקמת הדג, תסייע לבקרת המחלה ותצמצם את השפעת הנגיף.
בסרטון זה, אנו נראה את ההגברה isothermal מתווך לולאת שעתוק הפוך, או RT-LAMP בדיקה, לגילוי מהיר של וירוס אגם אמנון בדגימות דגים. חלק שני, חילוץ רנ"א. ראשית, להוסיף 3250 מיליגרם של רקמת הכבד לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר, המכיל 600 עד 1000 מיקרוליטר חומצה guanidinium-פנול בסיס רגנט, וטחון עד הומוגנית.
צנטריפוגה ב 10, 000 RCF במשך 30 שניות, ולהעביר את supernatant לתוך צינור חדש. מוסיפים נפח שווה של 95% אתנול לצינור, ומערבבים היטב. העבר את הפתרון לתוך עמוד ספין, ממוקם בצינור איסוף, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 10, 000 RCF במשך 30 שניות.
השלך את הזרימה והעבר את העמודה לצינור איסוף חדש. הוסף 400 microliters של RNA PreWash לתוך העמודה, צנטריפוגה ב 10, 000 RCF במשך 30 שניות. השלך את הזרימה דרך, וחזור על שלב זה.
הוסף מאגר שטיפת RNA 700 מיקרוליטר לתוך העמודה, וצנטריפוגה ב 10, 000 RCF במשך שתי דקות. לאחר מכן, להעביר את העמוד לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר. לבסוף, החלק את ה-RNA למטריצת העמודים עם מים נטולי 100 מיקרוליטר, נטולי גרעין וצנטריפוגה ב- 10,000 RCF למשך 30 שניות.
חלק שלישי, עיצוב פריימר. PrimerExplorer גרסה 4 הוא כלי הביואינפורמטיקה הנפוץ ביותר לעיצוב מנורה יעילה, או פריימרים RT-LAMP, שבו מדריכים טובים עבור התוכנה זמינים באתר האינטרנט שלהם. כאן, ארבעה פריימרים ספציפיים, המורכבים משני פריימרים פנימיים ושני פריימרים חיצוניים, תוכננו לזהות שישה אזורים נפרדים בקטע 3 של TiLV, שמקורם בתאילנד.
לאחר הכניסה לאתר האינטרנט, שבו הקישור מוצג בסרטון, לחץ על PrimerExplorer V4. בחר את הקובץ המכיל את הרצף של קטע 3 של TiLV, בפורמט FASTA, מאוחזר ממספר GenBank לגשת, KX631923, או tilapia אגם וירוס TV1 קטע 3, ולאחר מכן לחץ על לחצן עיצוב פריימר. לאחר לחיצה על לחצן צור, התוכנה תעבד, והתוצאות יופיעו. לאחר אופטימיזציה של הרצפים עבור הגברה LAMP, בסך הכל, זוג אחד של פריימרים חיצוניים, ושני זוגות של פריימרים פנימיים, נבחרו למחקר זה, כדי לזהות את הזיהום TiLV.
סט זה של פריימרים מוצגים כאן. חלק רביעי, הדגמה של RT-LAMP. התמהיל הראשי עבור RT-LAMP ספציפי עבור וירוס אגם אמנון, כולל את הכימיקלים הבאים.
הכינו תערובת אב באמצעות הכימיקלים המוצגים בטבלה. לוותר על 22 מיקרוליטרים של תערובת אב לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף שלושה microliters של תבנית RNA לתוך צינור התגובה.
לשליטה שלילית, יש להשתמש במים מזוקקים במקום בחומרי רנ"א, ולערבב היטב. הדגירה את התגובות ב 65 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, ואחריו 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר הדגירה במשך 30 דקות, השינויים הקלורימטריים נצפו חזותית על ידי עיניים עירומות.
במידת הצורך, אנו יכולים לאשר את תוצאות הבדיקה של RT-LAMP, על ידי ביצוע אלקטרופורזה ג'ל על 1.5% ג'ל אגרוז, פועל עם קבוע 100 וולט, במשך 40 דקות, לפיה סולם DNA בגודל מולקולרי של קילו-באז נטען יחד כסמן כדי לקבוע את גודל השבר. חלק חמישי, תוצאות מייצגות ופרשנות. לאחר הדגירה במשך 30 דקות, תגובת פלואורסצנטיות התבואה המצביעה על הגברה חיובית של TiLV ברקמות דגים, נצפו כמובן בדגימות נגועות תחת אור UV באורך גל של 365 ננומטר, בעוד אלה של שליטה שלילית היה פתרון ברור וחסר צבע מעט.
בהתאמה, ההגברה של מוצרי RT-LAMP אושרה על אלקטרופורזה ג'ל agarose, מראה בגדלים שונים של הגברות מרובות של חזרות DNA הפוכות, יצירת מבנים לולאת גזע תחת מנורת UV בדגימות נגועות TiLV, ואילו לא להקות הוצגו בארות של הבקרה השלילית, שם התוצאות היו בהתאם לאלה של ASSAY RT-LAMP. לכן, כדי להפחית את התפשטות וירוס אגם אמנון, סינון מיידי של דגים נגועים אלה, בשיטת אבחון יעילה, הוא אחד המפתחות החשובים. לכן, הבדיקה RT-LAMP שפותחה לאחרונה צריכה להציע כלי אבחון מהיר ורגיש כדי להיות מיושם בתהליך של אמצעי אבטחה ביולוגית.
ניתן להשתמש בהגם במעבדה, או במתקנים באתר. אנו מקווים כי השיטה תיושם כדי לסנן אוכלוסיית דגים נגועים שיכולה להוביל להפחתת התפשטות נגיף אגם אמנון.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג בדיקת RT-LAMP מהירה לזיהוי נגיף אגם הטילאפיה (TiLV) בדגי טילאפיה, המהווה חלופה מהירה יותר לשיטות RT-PCR קונבנציונליות. הפרוטוקול נועד לסייע בבקרה על התפשטות TiLV, במיוחד במדינות מתפתחות שבהן הטילאפיה מהווה מקור חלבון חיוני.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- וירולוגיה
- חוות דגים
- זיהוי פתוגנים
רקע
- נגף אגם הטילאפיה (Tilapia lake virus) הוא פתוגן מידבק הגורם לתמותה גבוהה בדגי טילאפיה.
- הנגף מהווה איום משמעותי על חקלאות דגי הטילאפיה ועל הביטחון התזונתי העולמי.
- שיטות הגילוי הנוכחיות הן לרוב ממושכות ומורכבות.
- שיטת גילוי מהירה חיונית לבקרה יעילה על המחלה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהירה ורגישה לזיהוי TiLV ברקמות דגים.
- הפחתת ההשפעה של TiLV על גידול טילאפיה.
- מתן פתרון מעשי לניהול מחלות במדינות מתפתחות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקת הגברה איזותרמית מתווכת לולאה עם שעתוק הפוך (RT-LAMP).
- הפקת RNA מרקמת כבד של אמנונית (tilapia).
- שימוש במכשירים פשוטים לבדיקה מהירה.
- השוואה לטכניקות RT-PCR קונבנציונליות.
תוצאים עיקריים
- בדיעת ה-RT-LAMP מספקת זיהוי מהיר ומדויק של TiLV.
- שיטה זו פשוטה ומהירה יותר מ-RT-PCR מסורתי.
- ניתן ליישם אותה בסביבות עם משאבים מוגבלים.
- הפרוטוקול עשוי לסייע בצמצום התפשטות ה-TiLV באוכלוסיות של דגי טילאפיה.
מסקנות
- בדיקת RT-LAMP היא כלי מבטיח לזיהוי TiLV.
- היא תומכת במאמצי הבקרה על המחלה בחקלאות ימית.
- מחקרים עתידיים עשויים לשפר את יישומה במסגרות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
זיהוי מהיר וספציפי של פתוגנים ויראליים מתהוותים, כגון נגיף אגם הטיליה (TiLV), הוא קריטי להגנה על ייצור חקלאות המים ועל ביטחון התזונה העולמי. בדיקת RT-LAMP מאפשרת זיהוי מוקדם של זיהום TiLV ברקמת דג, ובכך תומכת בהתערבות מוקדמת ובצעדי ביו-אבטחה. גישה זו מפחיתה את ההסתמכות על שיטות מולקולריות עתירות עבודה ומאפשרת סריקה רחבה בסביבות עם משאבים מוגבלים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר זיהוי ספציפי של TiLV RNA, ובכך תומך באישור המטרה הוויראלית ברקמות מאכסן נגועות.
- ערך תפעולי: מספק שיטה מהירה להגברה איזותרמית שאינה דורשת ציוד למחזורי תרמיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות ויזואליות או פלואורומטריות בתוך 60 דקות, מה שמאפשר הערכה מהירה של נוכחות נגיפית.
- ערך תפעולי: משתמש במינימום ציוד וניתן להטמעה בסביבות שטח או במעבדה לצורך סריקה בקיבולת גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים ישימות לסוגי דגימות שאינן קטלניות, כגון ריר, ובכך מאפשר ניטור אורך של העומס הויראלי.
- ערך תפעולי: תומך במחקרי אורך במודלים של בעלי חיים ללא הקרבת הנבדקים, מה שמשפר את התכנון הניסויי ומפחית את השונות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
בדיקת ה-RT-LAMP משתלבת ברצף הגילוי על ידי אספקת כלי זיהוי שניתן להשקיע בשטח, לאחר שלב הגדרת ההשערה ולפני מחקרים של התערבות טיפולית או מניעתית.
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת באימות נוכחות נגיפית בדגימות ביולוגיות, ובכך תומכת במחקרים מכניסטיים של פתוגנזה של TiLV.
- סריקה: מאפשרת הערכה מהירה של מצב הזיהום בקרב קבוצות דגימות, ובכך משפרת את מוכנות הבדיקה להערכת תרכובות אנטי-ויראליות.
- אנליזה: מספקת תוצאות כמותיות או חצי-כמותיות באמצעות עכירות ויזואלית, פלואורסצנציה או אלקטרופורזה של ג'ל, ובכך מסייעת בניתוח השוואתי.
- מחקר טרנסלציונלי: תומכת ברצף מהזיהוי הראשוני ועד להערכה פרה-קלינית של אסטרטגיות התערבות במודלים רלוונטיים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה מודולרית לזיהוי חומצות גרעין, הניתנת להתאמה לפתוגנים עולה אחרים במערכות חקלאות ימית או בעלי חיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה באמצעות זיהוי ספציפי ורגיש של RNA ויראלי.
- ערך תפעולי: מציע תאימות לנקודת הטיפול (point-of-care) ללא צורך בציוד, עם תוצאות הניתנות לקריאה בעין בלתי מזוינת או באמצעות מאיר אחורי (transilluminator) פשוט.
- ערך אסטרטגי: מקצר את הזמן לקבלת תוצאה בסריקת זיהומים, מה שמאפשר קבלת החלטות מהירה יותר לגבי המשך התקדמות המחקר.
- השפעה על הפורטפוליו: משפר את הערכת הסיכונים בתוכניות פרה-קליניות על ידי אספקת נתונים מהימנים על מצב הזיהום, ובכך מפחית משתנים מתערבים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית ובתכנון פריימרים עבור בדיקות מבוססות LAMP.
- דורש גישה לערכות הפקה של RNA, מקבץ מים או בלוק חימום, וכלי ויזואליזציה (למשל, אור UV או אלקטרופורזה של ג'ל).
- דורש סטנדרטיזציה של פרוטוקולים להכנת דגימות על פני סוגי רקמות שונים (למשל, כבד, ריר) כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור.
- כולל תיקוף של סגוליות הבדיקה אל מול פתוגנים קרובים כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות.
- מוגבל על ידי הצורך בסטים של פריימרים שעברו אופטימיזציה והסתייגות פוטנציאלית ממשבכים ביולוגיים מורכבים.
