שיטות מתוקננת למדידת אינדוקציה של תגובת הלם חום באלבורבדיוטיס

כאן, פרוטוקולים מתוקננת מוצגים כדי להעריך את האינדוקציה של תגובת הלם חום (HSR) בתוך האלגיה Caenorditis באמצעות RT-qpcr ברמה המולקולרית, כתבים פלורסנט ברמה התאית, ו thermorecovery אוד ברמה ארגונית.

תגובת הלם החום היא מסלול תגובת מתח תאי חיוני השומר על פרוטאוסטאזיס ציטופלסמי ונוכל ברמות המולקולריות, התאיות והאורגניזמיות באלגנים ימיים. אנו מציגים סדרה של פרוטוקולים סטנדרטיים ושיטות עבודה מומלצות המייצרים אינדוקציה חזקה של תגובת הלם החום בים elegans על מנת לסייע בשיפור הרבייה בשדה תגובת הלם החום. אנו מראים כי סובלנות תרמו, מוסט אורגניזם נפוץ אינו תלוי בתגובת הלם החום.

במקום זאת, אנו ממליצים להשתמש בהתאוששות תרמית, חקירה אורגניזם כי הוא תגובת הלם חום תלוי. תגובת הלם החום הופכת לחלשה עם תחילת הטלת הביצים. לכן, תזמון התפתחותי הוא משתנה קריטי שיש לקחת בחשבון בניסויי תגובה להלם חום.

התחל ביצירת אוכלוסיית תולעים מסונכרנת. השתמשו בבחירה חוטית פלטינה כדי להעביר כ-10 תולעים בוגרות כבידתיות לצלחת טרייה. הקפד להסיר את כל הביצים או הזחלים שאולי הועברו עם המבוגרים.

אפשר לתולעים להטיל ביצים במשך שעה אחת, ולאחר מכן להסיר את המבוגרים מהצלחת. שמרו על התולעים המסונכרנות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד לשלב ההתפתחותי הרצוי, תוך לקיחת בחשבון כי התזמון ההתפתחותי משתנה בהתאם לכל זן והטמפרטורה שבה גדלים התולעים. כאשר התולעים מוכנות להלם חום, לעטוף את הצלחות עם סרט פרפין ולהשתמש מתלה מבחנה עם משקל עופרת להטביע אותם באמבט מים במחזור ב 33 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.

לשחזר את הצלחות מן אמבט המים ולייבש אותם עם מגבת נייר. הסר את סרט הפרפין ולאפשר לתולעים להתאושש ב 20 מעלות צלזיוס במשך שש עד 24 שעות, אשר יהיה זמן מספיק עבור סינתזה GFP. כדי להכין שקופיות להדמיה, מקם שקופית מיקרוסקופ בין שתי שקופיות אחרות עליהן יש רצועה של קלטת מעבדה.

הפוך תמיסת 3% agarose במים לחמם אותו במיקרוגל עד אגרוז להתמוסס. לאחר מכן השתמש פיפיטה מיליליטר אחד למקם כ 150 microliters של agarose במרכז השקופית. מיד לכסות את השקופית עם שקופית ריקה, הצבת אותו בניצב, כך שהוא נשען על קלטת המעבדה, ולאחר מכן להסיר אותו בזהירות.

כדי לשתק את התולעים, להוסיף טיפה קטנה של levamisole מילימולר אחד, חיץ M9, למרכז כרית אגרוז ולהעביר 10 תולעים לתוך הירידה באמצעות לבחור חוט פלטינה. באופן אופציונלי, להפיץ את levamisole החוצה של כרית agarose וליישר את התולעים עם לבחור כאשר הם הופכים משותקים. מכסים את התולעים עם תלוש כיסוי ומדמיין אותן בהקדם האפשרי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

כדי לבצע בדיקה thermorecovery, לסנכרן את התולעים ולשמור אותם ב 20 מעלות צלזיוס עד השלב ההתפתחותי הרצוי. ואז החום מזעזע אותם במשך שש שעות. מוציאים את הצלחות מהאמבטיה ומאפשרים להם להתאושש ב 20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.

לאחר ההחלמה, לספור את מספר התולעים שיכולים מיד להתכווץ משם לאחר גירוי מכני ללא תנועה קופצנית או שיתוק. כדי לדמיין אינדוקציה של תגובת הלם חום ברמה התאית, נותחו שני זני אלגנס ים של כתב פלואורסצנטי. בדגימות השליטה השליליות ללא הלם חום, כתב hsp-16.2 הראה פלואורסצנטיות אוטומטית נורמלית, אבל לכתב hsp-70 הייתה פלואורסצנטיות מכוננת בשריר הדיכאון האנאלי.

לאחר שעה של הלם חום, פלואורסצנטיות חזקה נצפתה בשני הכתבים כאשר RNAi שימש להפיל hsf-1 לפני מדידת אינדוקציה כתב. פלואורסצנטיות של שני הזנים הופחתה באופן חמור, מה שמצביע על כך שכתבים אלה תלויים ב- hsf-1. כדי לכמת אינדוקציה של תגובת הלם החום ברמה המולקולרית, שני חלבונים הלם חום הילידים נמדדו עם PCR מפתח rt.

נמצא כי שעה אחת 33 מעלות צלזיוס הלם חום תוצאות יותר מ 2, 000 לקפל עלייה ביטוי יחסי של שני הגנים הלם חום. בדיקת ת'רמורקוברי הראתה כי חשיפה להלם חום של שש שעות הובילה לירידה של 20% בתולעים עם תנועה רגילה לאחר התאוששות של 48 שעות. הפלת hsf-1 גרמה לירידה דרמטית בתנועה הנורמלית, עם מעל 95% מהתולעים שהראו תנועה קופצנית או שיתוק לאחר דרבן.

לעומת זאת, להפלת hsf-1 לא הייתה השפעה משמעותית על תוצאות הבדיקה של עמידות תרמו, שבה תולעים חשופות לטמפרטורה רציפה של 35 מעלות צלזיוס ואחוז התולעים בחיים נמדד בנקודות זמן שונות. בעת ביצוע טכניקה זו בפעם הראשונה, הקפד לעטוף את הצלחות עם סרט פרפין פעמיים כדי למנוע מים מלהיכנס הצלחות והורס את הניסוי. ניתן להאריך בדיקות מולקולריות לניתוחים גנומיים באמצעות RNA-seq.

ניתן לכלול מסיונות אורגניזמים אחרים המושפעים מתגובת הלם החום, כגון תוחלת החיים. היכולת הייחודית לתאם את תגובת זעזועי החום המולקולרית, התאית והאורגניזמית באלגנים בים הוכיחה את עצמה כבלתי יסולא בפז להבנת תפקידו של מסלול זה בהתפתחות ומחלות.