אימונולוקליזציה פלואורסצנטית של חלבונים ערבינוגלקטניים ופקטינים בחומת התא של רקמות הצמח

כמות המידע מניסוי אחד בלבד היא עצומה. אנו יכולים לזהות את נוכחותם של פולימרים אלה דופן התא ולדעת בדיוק איך הם מופצים בתאים ורקמות, ואפילו לקבוע את השפע שלהם. שיטה זו מתוכננת באופן כזה שניתן ליישם אותה כמעט על כל סוג של רקמת צמח מכל מין שתרצה לנתח.

אימונולוקליזציה ברקמות הצמח כרוכה בהרבה עבודה קפדנית, קשה להסביר מבלי לראות מה קורה בפועל. לפני איסוף דגימת רקמת הצמח, למלא בקבוקון זכוכית עם פתרון קיבוע קר מספיק כדי להטביע לחלוטין את כל הדגימות. לאחר מכן בחר את רקמות הצמח להיות מנותח לקצץ את הדגימות לגודל של לא יותר מ 16 מילימטרים רבועים.

מיד לטבול את הדגימות בפתרון התיקון. גלוטאראלדהיד ופורמלדהיד הם שניהם מתקנים מצוינים, אך שניהם מסוכנים ויש לטפל בהם במכסה המנוע של הזרימה. מעבירים את הבקבוקון לתא ואקום ומחילים ואקום לאט לאט.

כאשר הלחץ מגיע פסקלים שליליים של 60 קילו, החומר הצף בבקבוקון יתחיל לשקוע לתחתית. שמור על הלחץ בתא בלא יותר מ 80 קילו פסקלים שליליים. תהליך הטביעה עשוי להימשך עד שעתיים.

לאחר הדגימות כבר בתא ואקום במשך שעתיים, לאט לשחרר את הוואקום. אוטמים את בקבוקון הזכוכית ומכניסים למקרר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר קיבעון הלילה, השלך את כל הדגימות שלא שקעו לתחתית הבקבוקון.

לשטוף את הדגימות הנותרות עם 25 PBS מילימולאר במשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף אותם 25 מאגר צינורות מילימולאר במשך 20 דקות. חשוב מאוד להסיר את כל הדגימות צפות כי סביר מאוד כי התיקון לא חדר את המדגם. לייבש את הדגימות בסדרת אתנול, לטבול את הדגימות במשך 20 דקות בכל ריכוז אתנול.

כדי לעיין בדגימות, להוסיף ריכוזים הולכים וגדלים של שרף LR-לבן באתנול, החל שרף חלק אחד לשלושה חלקים אתנול. בכל ריכוז, דגירה במשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. החלף את שרף LR-לבן עם שרף טרי דגירה את הדגימות במשך 12 שעות נוספות בארבע מעלות צלזיוס.

מכינים את כמוסות הג'לטין ההטבעה, בוחרים כמוסות מעט גדולות יותר מהדגימות, כך שהדגימות יכולות להיות סגורות לחלוטין משרף. תווית תגי נייר עם עיפרון כי דיו יזהם את שף. יש למרוח טיפה אחת של שרף LR-לבן טרי על החלק התחתון של כל כמוסה.

מניחים דגימה בכל כמוסה, ולאחר מכן למלא את הכמוסות לקיבולת מקסימלית עם שרף טרי. שים את הכובע על הקפסולה ולחץ בעדינות כדי לאטום אותו. כדי ל polymerize שרף, לרפא את הכמוסות ב 58 מעלות צלזיוס עד התקשה לחלוטין סביב 24 עד 48 שעות.

לאחר קילוף כמוסת הג'לטין משרף LR-לבן, מניחים את בלוק שרף מתחת למיקרוסקופ סטריאו. באמצעות סכין גילוח חד, חתוך את הבלוק הלבן LR בזווית של 45 מעלות לדגימה. סובב את המדגם ובצע חיתוך שני בזווית של 90 מעלות לראשון.

המשך לחתוך באותו דפוס כדי ליצור פירמידה עם פסגת הפירמידה ישירות מעל אזור העניין של המדגם, ולאחר מכן להתחיל להסיר פרוסות עדינות בניצב לציר הראשי עד משטח החיתוך מגיע המדגם. מדגם היעד צריך להיות מוקף באופן אידיאלי בצורת טרפז. הנח את בלוק ה- resin הגזום במיקרו-tome במיוחד.

כוונן את הזווית בין קצה הסכין לבלוק ההסתעפות. חותכים קטעים מהבלוק בעובי שבין 200 ל-700 ננומטר. השתמש בלולאת תיל כדי להרים בזהירות חלקים מסוימים שנדגמו מהמיקרוטום.

מניחים אותם בטיפה של מים מזוקקים deionized על מגלשת זכוכית. לאדות את המים על ידי הנחת המגלשה על צלחת חמה ב 50 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף טיפת כתם על החלקים. לאחר 30 שניות, יש לשטוף את הכתם ולהתבונן בשקופית מתחת למיקרוסקופ כדי לאמת את המצב הכללי של המקטע וכי מבנה הצמח הרצוי נראה לעין.

הכן שקופית תגובה נקייה על ידי הצבת טיפה של מים מזוקקים deionized בכל באר של המגלשה. מעבירים חלק דגימה אחד או שניים לכל טיפת מים. מניחים את המגלשה בצלחת פטרי מרובעת של 10 ס"מ, מכסים אותה ומניחים לה להתייבש ב-50 מעלות צלזיוס.

כדי להכין תא דגירה למגלשות התגובה, מניחים כמה מגבות נייר מעומעמות בתחתית תיבת טיפים פיפטה ולעטוף את התיבה בנייר אלומיניום. מעבירים את השקופיות מהקופסה לתא הדגירה. פיפטה 50 מיקרוליטרים של פתרון חסימה לתוך כל באר.

לאחר דגירה של השקופית במשך 10 דקות, להסיר את פתרון החסימה, ולאחר מכן לשטוף את כל בארות פעמיים עם PBS במשך 10 דקות בכל פעם. לאחר הכנת פתרונות הנוגדנים העיקריים כמתואר בכתב היד, בצעו שטיפה סופית של הבארות עם מים מזוקקים במשך חמש דקות. פיפטה פתרון הנוגדנים העיקרי לתוך בארות התגובה, ואז פיפטה פתרון החסימה לתוך בארות הבקרה.

סגור את תא הדגירה. תן לו לעמוד במשך שעתיים בטמפרטורת החדר ולאחר מכן במקרר אותו לילה בארבע מעלות צלזיוס. הכינו פתרון של 1% של הנוגדן המשני בחסימת הפתרון.

יהיה צורך בכ-40 מיקרוליטר לבאר. מכסים את הפתרון בנייר אלומיניום. לשטוף את בארות התגובה להחליק פעמיים עם PBS ופעם אחת עם מים מזוקקים deionized במשך 10 דקות בכל פעם.

ודא כי אין פתרון חסימה או הפקדות להישאר בבארות. פיפטה פתרון הנוגדנים המשני לכל הבארות. דגירה את המגלשות בחושך בטמפרטורת החדר במשך שלוש עד ארבע שעות.

שוב, לשטוף את בארות התגובה להחליק פעמיים עם PBS ופעם אחת עם מים מזוקקים deionized, ולאחר מכן להוסיף טיפה של לבן Calcofluor לכל באר. ללא כביסה, מוסיפים טיפת מדיום הרכבה לכל באר ומכסים כל באר עם כיסוי. שים לב למקטעי הדגימה בשקופית התגובה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

עבור כל תצפית, השתמש במסנן UV כדי לזהות קירות תא מוכתמים על ידי Calcofluor ומסנן FITC כדי לזהות immunolocalization. לקבלת תצוגה חזותית טובה יותר של התוצאות, השתמש ב- ImageJ או בתוכנית ניתוח תמונה דומה כדי למזג כל תמונת מסנן UV עם תמונת המסנן המתאימה של FITC. על ידי איתור לוקליזציה של אפיטופים ספציפיים, הפרוטוקול מאפשר אפיון של הרכב דופן התא.

לדוגמה, 1, 5-arabinan הוא בשפע בקיר התא של suber Quercus המתפתח anther. הומוגלקטרוננים מוצהרים בקושי נמצאים בדרך כלל בקצה השורש של עובר Quercus suber המציין תכונות מכניות של האיבר. Xylogalacturonans נמצאים בתאים מנוונים, כגון תא אנדוספרם בשלבים הסופיים של התבגרות בלוט Suber Quercus.

האפיטופים של AGP מוכרים על ידי JIM13 או JIM8 נמצאים על מבנים הקשורים רבייה, כגון קווי תאים הקשורים microgametogenesis ב Arabidopsis תליאנה ואת papillae סטיגמטי מיקרוביאלית של צוללות אנגיוספרם הבסיס Trithuria. בדרך כלל קל לזהות ולזהות טעויות נפוצות ביישום פרוטוקול זה. כאשר מדלגים על הכביסה או על בארות התגובה מותר להתייבש, הנוגדן המשני יופיע בדרך כלל כמריחה.

אגרגטים של פלואורוכרום ירוק ייווצרו אם הנוגדן הראשוני הבלתי מאוגד לא נשטף כראוי. קיפול או ניתוק של החלקים קשור בדרך כלל הידבקות לקויה עקב שימוש שקופיות טמאות או כביסה אגרסיבית. הכנת מדגם היא גם קריטית.

בלוקים שף צריך להיות חופשי סדקים עם צהוב חיוור גלוי בבירור מדגם חום בהיר. דגימות מוטבעות בצורה לא יעילה יציגו כתמים לבנים אבקתיים או אזורים. שמירה על גודל המדגם מתחת לשמונה מילימטרים חיונית לחדירה של הפתרון המקבע.

דגימות קבועות בצורה גרועה יופיעו חום כהה או כמעט שחור. טמפרטורה מוגזמת יכולה לגרום לשרסום להיסדק מה שהופך את ההחלקה של המדגם לבלתי אפשרית. השימוש בטכניקות אימונולוקליזציה פותח מספר כיווני מחקר.

אפשר להמשיך עם טכניקות ספציפיות יותר כגון ניתוח ביוכימי של דופן התא או אפילו להמשיך לגישה מולקולרית. התוצאות המסופקות על ידי טכניקה זו יכולות לעזור להבין את הרכב דופן התא, מבנה מורכב מאוד קשה מאוד לנתח על ידי ניתוח כימי פשוט.