Name: שימוש בציטומטריית זרימה כדי לזהות ולכמת היווצרות דם שהשתנתה בדגי הזברה המתפתחים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: למדו לכמת תאי דם בזברה מתפתחים באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת לחקור השפעות של שינויים גנטיים על התפתחות הדם ולזהות ליקויי דם ב-Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המימון ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH: R15 DK114732-01 ל- D.L.S.), הקרן הלאומית למדע (NSF: MRI 1626406 ל- D.L.S.), ומתוכנית הכבוד באוניברסיטת קליפורניה צ'יקו (ל- K.F.R.). המחברים מודים לבטסי טמיאטי על ניהול המעבדה וקתי ג'ונס על הסיוע האדמיניסטרטיבי.

הוועדה המייעצת לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה סטייט, צ'יקו, אישרה את כל השיטות המתוארות להלן.
הערה: מומלץ לטפל בעוברים עם 1-פניל 2-תיוריאה (PTU; טבלה 1) ב 24 שעות לאחר ההפרה (hpf) כדי למנוע פיגמנטציה אשר משפיע לרעה על אפליה פלואורסצנטית על ידי cytometry זרימה. כל ההליכים המפורטים להלן מקובלים עבור ציטומטריית זרימה ומיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS). עם זאת, אם המטרה של האדם היא תרבות התאים hematopoietic לאחר FACS, ואז לדבוק בשיטות סטריליות בעת עיבוד דגימות. הפרוטוקול להלבנה והכנת דגימות עובר בצורה סטרילית תואר בעבר12.
1. דקורציה של 48 כ"ס עוברי זברה
<ol><li>עם עוברים (לפחות 5, אבל לא יותר מ 200 עוברים) בצלחת פטרי פלסטיק 10 ס"מ, להטות את המנה, כך העוברים לשקוע לקצה התחתון. הערה: קל להטות את המנה על ידי הסרת המכסה שלה והנחת המכסה מתחת לקצה אחד של צלחת פטרי.</li>
	<li>הסר והשליך כמה שיותר E3 בינוני(טבלה 1)ככל האפשר ולהוסיף 500 μL של פרוטאז dechorionation (10 מ"ג / מ"ל). דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
	<li>לאחר 5 דקות, להרים את צלחת פטרי (שמירה על כל העוברים בקצה התחתון של הצלחת), בעדינות הקש על הצד של צלחת פטרי, המאפשר לעוברים לשפשף בעדינות נגד החלק התחתון של הצלחת כדי להסיר לחלוטין chorions.</li>
	<li>עם בקבוק לסחוט, להוסיף ~ 20 מ"ל של E3 בינוני כדי לדלל פרוטאז. אפשר לעוברים להתיישב ולהסיר את המדיום E3 על ידי decanting.</li>
	<li>חזור על שלב 1.4 3x כדי להסיר את כל העקבות של פרוטאז dechorionation. הערה: עבור כל מדגם בודד לנתח, לפחות 5 עוברים נדרשים. הליך dechorionation זה יכול להכיל עד 200 עוברים לכל צלחת פטרי. ניתן לקבץ דגימות בשלב זה ולהפרידן מאוחר יותר אם תרצה בכך. לחלופין, dechorionation ידני יכול להתבצע על ידי קרע בעדינות את chorions עם מלקחיים של שען. זה יתרון כאשר יש מספר קטן של עוברים. בדרך כלל זברה-פיש יבקעו מהמקהלות שלהם ב-72 כ"ס. עוברים בעלי מבנה פגום קשות לא, עם זאת, וידרשו dechorionation (ידני או כימי) לאחר מכן.</li>
</ol>2. הכנת דגימות עובר לניתוק
<ol><li>באמצעות פיפטה P1000, מקום 5-10 עוברים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה אחד 1.5 מ"ל.</li>
	<li>הסר E3 בינוני עם פיפטה ולהשליך. התראה: פיפטה בזהירות כמו עוברים ניתן להשליך בקלות במהלך השלבים הבאים.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של 10 מ"מ dithiothreitol (DTT) במדיום E3 כדי להסיר את ציפוי ריר המקיף את זברה עוברי11,12,13,14. מניחים את צינור microcentrifuge אופקית, ואת הדגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.</li>
</ol>3. ניתוק עוברים
<ol><li>לשטוף את העוברים 3x עם 1 מ"ל של מלוחים אגירה פוספט של Dulbecco (DPBS) עם Ca2 + ו מ"ג2 + כדי להסיר עקבות של DTT. לאחר הכביסה האחרונה להוסיף 500 μL של DPBS עם Ca2 + ו מ"ג2 + ו 5 μL של 5 מ"ג / מ"ל (26 U / mL) פרוטאז דיסוציאציה. הערה: ניתן להשתמש בפתרונות איזוטוניים אחרים עם אגירה, אך עליהם להכיל Ca2+ ו- Mg2+ כדי שהאנזים דיסוציאציה יפעל כראוי.</li>
	<li>דגימות דגירה ב 37 °C (67 °F) על שייקר מסלולי אופקי ב 185 סל"ד במשך 60 דקות. יש לתהפוך עוברים עם פיפט P1000 עד שהדגימות נותקות לחלוטין. התראה: יש להיזהר לא לעיכול יתר של העוברים; כמה רקמה מוצקה צריכה להיות נוכחת, וזה לא צריך להיות הומוגני לחלוטין. ניתן לעיכול יתר על המידה, מה שישמיד את תאי הדם של המטרה כדי שניתן יהיה לצפות בהם בציטומטר הזרימה(איור משלים 1). הערה: הליך זה פועל בצורה הטובה ביותר עבור 48-72 עוברי hpf. שלבים מאוחרים יותר עשויים לדרוש דגירה ארוכה יותר עם פרוטאז דיסוציאציה. תזמון לשלבים שונים חייב להיקבע באופן אמפירי. ישנן שיטות חלופיות מהירות יותר לניתוק רקמה עוברית, אך נמצא אמפירית כי שיטה זו, למרות שהיא לוקחת 60 דקות, היא עדינה ויסודית מספיק כדי לאפשר בידוד יעיל של תאים hematopoietic חיים.</li>
</ol>4. הכנת עוברים מנותקים לציטומטריית זרימה
<ol><li>פיפטה 5 עוברים מנותקים על המאגר העליון של צינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול התחתון עם כובע מסננת תאים μmM 35.</li>
	<li>יש לשטוף את התאים על ידי הוספת 4 מ"ל של מלוחים עם אגירת פוספט (PBS) ללא Ca2+ או Mg2+ למכסה המסננת של צינור פוליסטירן של 5 מ"ל המכיל את התאים המסוננים. הערה: ניתן להשתמש גם בפתרונות אחרים עם אגירה איזוטונית, אך הם צריכים להיות חסרים Ca2+ או Mg2+ כדי לדלל ולעבד את אנזים הדיסוציאציה ללא יעיל.</li>
	<li>צינורות צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס ו 300 x g במשך 5 דקות כדי גלולות התאים. עם פיפטה, להסיר ולהשליך supernatant. התחדשו בתאים ב 500 μL של PBS (ללא Ca2 + או Mg2 +).</li>
</ol>5. ציטומטריית זרימה
<ol><li>בעדינות מערבולת השעיית התא ולהוסיף 1:1,000 כתם תא מת אדום(שולחן החומרים). הערה: כתם התא המת האדום הוא צבע חדיר לתא המאפשר הדרה של תאים מתים ופסולת מתאי היעד והוא בחירה מצוינת של צבע לאפליה של תאים מתים, מכיוון שהוא מתרגש מהלייזר 633 ננומטר, השונה מהלייזר של 488 ננומטר המשמש לרגש פלואורופורים נפוצים כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו- DsRed. בדרך זו, אין חפיפה ספקטרלית מתאים מתים ותאי דם מהונדסים. Propidium יודיד (PI) ב 1 מ"ג / מ"ל היא חלופה זולה כתם התא המת האדום, אבל הקפד להזמין כמה דגימות מוכתם רק עם PI, כמו גם דגימות רק עם פלואור של עניין כדי להגדיר את פיצוי המכשיר. אחרת, האותות של PI ופלואורופורים כגון GFP יחפפו, וכתוצאה מכך תוצאות חיוביות כוזבות. אם ציטומטר הזרימה יש גם לייזר 405 ננומטר, צבעים אחרים כגון כתם תא אבא כחול הם גם בחירה מצוינת. התראה: בעת ניתוח תאי דם, שים לב כי לאחר 30 דקות סוגי תאים מסוימים יתחילו phagocytose כתם התא המת האדום. שמור על התאים מוגנים מפני אור על הקרח עד ניתוח ולבצע cytometry זרימה בתוך 30 דקות של הוספת הצבע.</li>
	<li>ניתוח ציטומטריית זרימה הערה: כל סיטומטר זרימה הוא קצת שונה, אבל השלבים הבאים יסייעו בהכנת דגימות לניתוח על רוב המכונות. עבור משתמשים חדשים לזרום cytometry, לחפש את עצתו של מישהו שהוא מומחה על פיסת ציוד מסוים. ההוראות הבאות נוגעות לסיטומטר זרימת היתוך FACSAria BD.<ol><li>הפעל את ציטומטר ולאפשר לייזרים להתחמם במשך 20 דקות. מיכל פסולת ריק, למלא מיכל נדן עם הפתרון המתאים (משתנה בהתאם ציטומטר זרימה) ולהתחיל את מערכת fluidics. הערה: בדרך כלל יש הליך הפעלה מסוים עבור כל סוג של ציטומטר זרימה; בצע הליך אתחול זה בזהירות.</li>
		<li>בתוכנת הניתוח, צייר חמש חלקות (איור 1A).<ol>
<li>תמדוד את הנקודה הראשונה של פיזור קדימה (FSC) על ציר x ופיזור צדדי (SSC) על ציר y. הגדר את FSC כליניארי ואת SSC כיומן רישום. הערה: FSC הוא מדידה של גודל התא, ו- SSC הוא מדידה של צפיפות; זה יאפשר אפליה של תאים מהריסות. אוכלוסיות תאי הדם של הזברה העוברית אינן נפרדות לפי גודל וצפיפות באותו אופן כמו תאי דם של דגי זברה בוגרים שתוארו קודם לכן15. במקום זאת הם יופיעו באותה אוכלוסייה עם כל התאים העובריים המתעכלים האחרים.</li>
			<li>הגדר את ההתוויה השניה כדי לבחון את גובה FSC (H) לעומת רוחב FSC (W). הגדר את התוויה השלישית למדידת SSC (H) לעומת SSC (W). הערה: שלב זה משמש כדי לא לכלול כפולים (תאים תקועים יחד כאשר הם עוברים דרך הלייזר).</li>
			<li>הגדר את התוויית הנקודה הרביעית כדי למדוד את כתם התא המת האדום על ציר x (בהתאם לציטומטר זה בדרך כלל שווה ערך למסנן המשמש עבור allophycocyanin [APC]) ו SSC על ציר y. זה יאפשר אפליה של תאים חיים מתאים מתים. הערה: ערכות מסננים של כל ציטומטר יכולות להיות שונות. הקפד להשתמש במסנן הזיהוי הנכון עבור צבע אפליה של תאים מתים.</li>
			<li>העלילה החמישית מודדת את הפלואורופור המועדף. דמיינו זאת כהיסטוגרמה של הפלואורופור (איור 1) או השתמשו בעלילת נקודה(איור משלים 2). הערה: כאשר בוחנים יותר מפלואורופור אחד באותה חיה, מומלץ להשתמש בעליית נקודה כדי להציג את שני הפרמטרים בו זמנית. אם יש סיכוי כלשהו שלפלואורופורים יש חפיפה ספקטרלית זה עם זה(איור משלים 2),מומלץ גם על חלקת נקודה. השתמש בהגדרות Area (A) כדי לחשב את האזור מתחת לעקומה שנוצר על-ידי פעימת הלייזר של הסייטומטר עבור כל הפרמטרים, מכיוון שהם מדויקים יותר.</li>
		</ol></li>
		<li>טען את הדגימה והקטן את קצב הזרימה כך שהדגימה לא תיגמר במהירות. התאם את הגדרות FSC ו- SSC כך שניתן יהיה לראות בבירור את רוב אוכלוסיית התאים (איור 1A).</li>
		<li>צייר שער סביב אוכלוסיית התאים ותייג אותו תאים. בדיקה שהתוויה של הנקודה השניה מגודרת בתאים, אל תכלול זוגות על-ידי תחילה גטינג ב- FSC ולאחר מכן בסינגלים של SSC.</li>
		<li>בחלקה הרביעית להתאים את הגדרות כתם התא המת האדום כך שיש בבירור אוכלוסייה שלילית. צייר שער סביב תאים אלה, ותתייג אותם תאים חיים. בחלקה החמישית, שער על תאים חיים ולבחון תאים שליליים וחיוביים פלואורופור. צייר שער סביב התאים החיוביים. הערה: אסטרטגיית גטינג היררכית זו בוחנת פלואורופור יחיד+ תאים השוכנים בשער התאים החיים, המתגוררים גם בשער התא. היזהר להציב שערים כראוי. שערים אלה ניתנים להתאמה אישית בהתאם לניסוי.</li>
		<li>הפעל כל דגימה, איסוף לפחות 25,000 אירועים סלולריים חיים.</li>
		<li>בצע את הליך הכיבוי כדי לכבות את Fluidics. למלא מיכל נדן ולרוקן את מיכל האשפה. הערה: לעתים קרובות קשה לדמיין תאים פלואורופור+ כאשר ביטוי החלבון נמוך, או אוכלוסיית התא היא נדירה. כדי להבטיח שהפרמטרים מוגדרים כראוי, יש להכין את העוברים האחים לצד ציור נכוןשל שערים והתאמת מתחי לייזר(איור 2 משלים). אם אוכלוסיית תאי היעד נדירה, אסוף יותר מ-25,000 אירועים. עם 5-10 בעלי חיים מעוכלים, אחד צריך להיות מסוגל לאסוף מיליוני אירועים. המספר הכולל של תאים פלואורופור+ ניתן להשיג גם עם נתונים אלה. כל שעליך לעשות הוא לספור את המספר הכולל של תאים במדגם עם hemocytometer ולהכפיל את אחוז פלואורופור+ תאים כדי לקבל את המספר המוחלט של פלואורופור+ תאים לכל דג.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li>
<li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li>
<li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li>
<li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).</li>
<li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li>
<li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li>
<li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li>
<li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li>
<li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li>
<li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li>
<li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+%28HSPCs%29+in+Developing+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836(2017).</li>
<li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. III <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22Essential+Zebrafish+Methods%3A+Cell+and+Developmental+Biology%22">Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2009).</li>
<li>Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDrummond%2C+IA+%22The+Zebrafish%3A+Cellular+and+Developmental+Biology%2C+Part+A%22">The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A</a>. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. I. 100, Elsevier. Boston, MA. 233-260 (2010).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).</li>
<li>Ganis, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li>
<li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery%3A+An+AstraZeneca+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li>
<li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery%3A+principles%2C+applications%2C+and+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li>
<li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li>
</ol>

D.L.S. הוא יועץ מדעי וקיבל פיצוי ממזונות Finless, Inc. ו Xytogen ביוטק, Inc. K.F.R. מצהיר על שום אינטרסים מתחרים.

דגי זברה הם מערכת מודל מצוינת לחקר המטופוזיס פרימיטיבי ומוחלט של בעלי חוליות. במהלך העשורים האחרונים פותחו ושוכללו מבחנים מרובים, המאפשרים לדגי זברה להפוך למודל מהיר וחסכוני לבדיקת תרופות, יצירה ובדיקה של מוטנטים גנטיים, ובסך הכל מאפשרים לחוקרים לנתח מסלולים מולקולריים החיוניים להמטופויזיס. פרוטוקול זה משתמש בזברה עוברית המאפשרת איסוף נתונים מהיר, שימוש בחלל פיזי פחות מבעלי חיים בוגרים ושימוש בפחות תרופות למסכים כימיים בקנה מידה גדול. זה גם מאפשר כמותיות לאחר overexpression של mRNA, הדור של מוטציות CRISPR, והפחתת תעתיק M...

ייצור דם (hematopoiesis) הוא תהליך התפתחותי חיוני שמתחיל לראשונה בעובר המוקדם. תהליך זה מתחיל על ידי יצירת תאי דם אדומים פרימיטיביים מקרופאגים ישירות mesoderm, ומאוחר יותר נע לעבר הייצור של גזע hematopoietic ותאי אב (HSPCs). תאי גזע אלה, שהם רב-פוטנטיים, מייצרים את כל הזנים של תאי דם בוגרים באורגניזם. המערכת, המסוגלת לחדש את עצמה, מתחדשת ללא הרף באמצעות HSPCs אלה. בעוד תהליך זה מתחיל בשלב מוקדם בפיתוח, hematopoiesis ממשיך בחייו של החיה, מתן היכולת להעביר חמצן לאתרים רחוקים של הגוף, להפסיק דימום לאחר פציעה, כדי להגן על הגוף מפני זיהום. ההתפתחות של מערכת מורכבת זו נשלטת זמנית וספטילית במהלך הפיתוח וכל הפרעה בייצור תאי הדם יכולה להיות קטסטרופלית עבור האורגניזם, וכתוצאה מכך אנמיה, תרומבוציטופניה, לויקופניה ולוקמיה.
מודל חיה פופולרי המשמש למחקר hematopoietic הוא דג הזברה (דניו rerio) כי יש להם התפתחות דם דומה בהשוואה לבני אדם. למעשה, רבים מהגנים והמסלולים המולקולריים המשמשים במהלך hematopoiesis נשמרים לאורך האבולוציה החולייתנית, ומאפשרים לנו ללמוד על הגנים האנושיים על ידי לימוד זברה. חשוב לציין, עוברי זברה מתפתחים מחוץ לגוף ובתוך 7 ימים יצרו את סוגי תאי הדם הבוגרים ביותר, המאפשרים הדמיה ישירה של המערכת hematopoietic בתוך זמן קצר. דגי זברה הם גם פוריים ביותר, מה שמאפשר לחוקרים להתבונן במספר גדול יותר של דגימות במסגרת זמן קצרה, שחשובה גם ליצירת נתונים הניתנים לשחזור. זמן הדור הקצר של הזברה ופיתוח חיצוני מספק מניפולציה קלה יותר והתבוננות במהלך מחקרי mutagenesis1,2,3,4,5 ו סינון סמים6,7,8,9,10. זה מאפשר פאנל של תרכובות טיפוליות מבטיחות עבור הפרעות דם אנושי להיבדק במהירות וביעילות.
חשוב לציין, דגי זברה הם גם נוחים מבחינה גנטית, ואת הגנום הוא רצף ביאורים. אחיזה זו מאפשרת לבצע טכניקות גנטיקה הפוכה כגון הפלה בתיווך מורפולינו (MO-) ואבלציה גנטית בתיווך CRISPR. דגי זברה הוכיחו גם את התועלת שלהם כמודל לביצוע מסכים גנטיים קדמיים; גנים ומסלולים חיוניים רבים המעורבים בהיווצרות דם בעלי חוליות התגלו באופן זה. שיטות רבות של התבוננות בתאי דם פותחו גם זברה. בעוד טכניקות כתמים היסטולוגיות מסורתיות קיימות, ניתן גם לבצע במקום הכלאה עבור תעתיקים ספציפיים לדם. חשוב לציין, קווים מהונדסים רבים של דגים קיימים גם לפיה חלבונים פלואורסצנטיים באים לידי ביטוי על ידי מקדמים ספציפיים לשושלת, המאפשר תיוג של תאי דם ספציפיים עם חלבונים פלואורסצנטיים11. זה מאפשר לחוקרים לבצע תצפית עדכנית של בראשית תאי הדם, התרחבות ורגולציה באורגניזם חי לאורך זמן.
בסך הכל, שימור המערכת hematopoietic, נוכחות ופיתוח קל של קווים מהונדסים, הדמיה קלה, וזמן הדור הקצר הפך את דג הזברה מודל חסכוני, מהיר, הסתגלות של hematopoiesis. כדי לשפר את ארגז הכלים של טכניקות הזמינות לחוקרי זברה, פיתחנו את ההסמכה הזו כדי לכמת באופן חזק את מספר תאי הדם בעוברים. השיטה כוללת עיכול בעלי חיים מהונדסים וביצוע ציטומטריית זרימה לתאי דם פלואורסצנטיים. בדרך זו, תאי דם מבעלי חיים מוטנטים, ההשפעה של שינוי MO ו CRISPR, ואת ההשפעה של מולקולות קטנות ניתן לנתח כמותית באופן מהיר לשחזור. מבחנים אלה הם דרכים ידידותיות למשתמש וחסכוניות לספירת תאי דם, המאפשרות בדיקה של הדור שלהם, התפשטות, ותחזוקה לאורך זמן.

<table><tbody><tr><td>שפופרת MCF 1.5 מ"ל</td><td>פישרברנד</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"מ פוליסטירן איזיגריפ צלחת פטרי</td><td>קורנינג פלקון</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינור תחתון עגול מפוליסטירן עם מכסה מסננת תאים</td><td>קורנינג פלקון</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria ציטומטר זרימת היתוך</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiolthreitol (DTT)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>646563 DPBS (10x) עם Ca2+ ו-Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 מ"ל</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-108</td><td></td></tr><tr><td>HyClone PBS (1x)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>sh30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Librease</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>דיסוציאציה פרוטאז</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>11459643001</td><td>dechorionation פרוטאז</td></tr><tr><td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>S34859</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש בציטומטריית זרימה כדי לזהות ולכמת היווצרות דם שהשתנתה בדגי הזברה המתפתחים

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

המגוון של שושלת התאים המרכיבים דם בוגר בבעלי חוליות נובע מההבחנה בין תאי גזע וחולי אב מהמטופויטיים (HSPCs). זהו תהליך קריטי המתרחש לאורך תוחלת החיים של אורגניזמים, ושיבוש המסלולים המולקולריים המעורבים במהלך עובר יכול להיות בעל השלכות קטסטרופליות לטווח ארוך. מסיבות רבות, דג זברה (דניו rerio) הפך אורגניזם מודל ללמוד hematopoiesis. עוברי זברה מתפתחים מבחוץ, ובמשך 7 ימים לאחר ההפרה (dpf) יצרו את רוב תת-הסוגים של תאי דם סופיים שיימשכו לאורך חייהם. בדיקות להערכת מספר התאים ההמטופיאטיים פותחו, בעיקר תוך שימוש בכתמים היסטולוגיים ספציפיים, בטכניקות הכלאה במקום, ובמיקרוסקופיה של בעלי חיים מהונדסים המשתמשים ביחצנים ספציפיים לתאי הדם המניעים את הביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים. עם זאת, רוב מבחני הכתמים ובטכניקות הכלאה באתרו אינם מכמתים במדויק את מספר תאי הדם הקיימים; ניתן לראות בקלות רק הבדלים גדולים במספרי התאים. שימוש בבעלי חיים מהונדסים וניתוח אנשים עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או confocal ניתן לבצע, אבל הכמות של מבחנים אלה מסתמך על ספירה ידנית או ניצול תוכנת הדמיה יקרה, שניהם יכולים לעשות טעויות. פיתוח שיטות נוספות להערכת מספרי תאי הדם יהיה חסכוני, מהיר יותר, ואף יכול להיות אוטומטי כדי להעריך במהירות את ההשפעה של שינוי גנטי בתיווך CRISPR, הפחתת תעתיק בתיווך מורפולינו, ואת ההשפעה של תרכובות סמים המשפיעים hematopoiesis בקנה מידה גדול. זה מבחנים חדשניים כדי לכמת תאי דם מבוצעת על ידי ניתוק עוברי זברה שלמים וניתוח כמות תאי הדם שכותרתו פלואורסצנטית נוכח. מבחנים אלה צריכים לאפשר הבהרות של מסלולים מולקולריים האחראים על ייצור תאי הדם, התרחבות ורגולציה במהלך העובר, אשר יאפשר לחוקרים לגלות עוד יותר גורמים חדשניים ששונו במהלך מחלות דם, כמו גם מסלולים חיוניים במהלך האבולוציה של hematopoiesis בעלי חוליות.

כדי למנות תאי דם אדומים בזברה עוברית, lcr:GFP16 עוברים הוזרקו בשלב אחד עם PBS, 7.0 ng/nL ism1 MO, או 7.0 ng/nL ism1 MO עם 7.0 ng ism1 mRNA12. ב 48 hpf הם התעכלו ונתנו ניתוח cytometry זרימה. לאחר ניתוח אחוז GFP+ כדוריות דם אדומות מכל מדגם (כל מדגם הוא 5 עוברים שנבחרו באופן אקראי; איור 1A), הממוצע של כל קבוצת הביקורת חושב. ממוצע זה הוגדר כ- 1, וכל האח...

בדיקה זו היא שיטה פשוטה לכמת תאים hematopoietic בפיתוח זברה עוברית. תאי דם של דגי זברה מנותקים נתונים לניתוח ציטומטריה זרימה. זה מאפשר גילוי של מומים בדם בבעלי חיים מוטנטים ולאחר שינוי גנטי.

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר הפלה וביטוי יתר של גנים בדג מתפתח, ואת הכמות של אלה השפעות במורד הזרם על תאי הדם. פרוטוקול זה מהיר, קל לביצוע, חסכוני וקל לאוטומציה עם גישה למכשור הנכון. הדגמת הליך זה תהיה קריסטן רוב, חוקרת לתואר ראשון במעבדה.התחל על ידי העברת בין חמש ל 200, 48 שעות לאחר הפריה עוברים לתוך צלחת פלסטיק 10 ס"מ פטרי. להטות את המנה כך העובר לשקוע לקצה התחתון, ולהסיר כמה שיותר E3 בינוני מן המנה ככל האפשר. לאחר מכן להוסיף 500 מיקרוליטרים של פרוטאז dechorionation לעוברים.לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, להטות את כל העוברים לקצה התחתון של הצלחת שוב בעדינות להקיש על הצד של המנה, המאפשר לעוברים לשפשף בעדינות על החלק התחתון של הצלחת כדי להסיר לחלוטין את chorions שלהם. באמצעות בקבוק לסחוט להוסיף כ 20 מיליליטר של E3 בינוני כדי לדלל את הפרוטאז, ולאפשר לעוברים להתיישב. ואז decant המדיום, ולשטוף את העוברים שלוש פעמים נוספות עם מדיום טרי כפי שהוכח רק כדי להסיר את כל העקבות של פרוטאז.כדי להכין את העוברים לניתוק, השתמש בפיפט P1000 כדי להעביר חמישה עד עשרה עוברים לצינור צנטריפוגה אחד, 1.5 מיליליטר מיקרו, ושואף את המדיום E3 שהועבר. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של 10 מילימולאר DTT במדיום E3 לדג הזברה העוברי, והניחו את צינור המיקרוצנטריפוגה במצב אופקי במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את ציפוי הריר. לניתוק עוברים, שטפו את העוברים שטופלו ב-DTT שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של DPBS בתוספת סידן ומגנזיום לכביסה.לפני הוספת 500 מיקרוליטרים של DPBS בתוספת סידן ומגנזיום, וחמישה microliters של חמישה מיליגרם למיליליטר, פרוטאז דיסוציאציה. ואז להדגיר את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי אופקי ב 185 מהפכות לדקה במשך 60 דקות. הקפד לבדוק מעת לעת על העוברים, כך שאתה לא מעל לעכל אותם.כאשר מדגם לא הומוגני לחלוטין עם כמה רקמה מוצקה נוכח ניתן לראות, triturate העוברים עם P1000 פיפטה עד המדגם מנותק לחלוטין. כדי להכין את התאים העובריים של זברה-דג מנותקים לציטומטריית זרימה, העבירו את כל דגימת התא למאגר העליון של צינור תחתונה עגול של 5 מיליליטר פוליסטירן, עם כובע מסננת תאים של 35 מיקרומטר. לשטוף את הכובע עם ארבעה מיליליטר של PBS ללא סידן או מגנזיום, וכדור התאים על ידי צנטריפוגה.ואז resuspend התאים ב 500 מיקרוליטרים של PBS ללא סידן ומגנזיום לכל צינור. לניתוח ציטומטרי זרימה של תאים עובריים זברה, בעדינות מערבולת התא השעיות לפני הוספת דילול של אחד לאלף של כתם תא מת אדום לכל צינור. תוך 30 דקות מיישום כתם התא המת, רוקנו את מיכל הפסולת, מלאו את מיכל הנדן בתמיסה המתאימה, והתחילו את המערכת הנוזלית של ציטומטר הזרימה.בתוכנת הניתוח, צייר חמש חלקות והגדר את העלילה הראשונה למדידה קדימה לעומת פיזור צדדי. הגדר את הפיזור קדימה ליניארי, ואת פיזור הצד ללוגריתמי. הגדר את החלקה השניה כך תמדוד גובה פיזור קדימה לעומת רוחב פיזור קדימה, ואת החלקה השלישית למדידת גובה הפיזור לעומת רוחב הפיזור הצדדי.הגדר את העלילה הרביעית כדי למדוד את כתם התא המת האדום על ציר ה- x, ואת פיזור הצד על ציר y כדי לאפשר אפליה של חיים מתאים מתים. העלילה החמישית צריכה להיות מוגדרת כדי למדוד את הפלואורופור של בחירה. כאשר כל ההתוויות הוגדרו, טען את הדגימה על הסייטומטר והפחת את קצב הזרימה כך שהתאים לא ייגמרו במהירות.התאם את הגדרות הפיזור קדימה וצד כך שניתן יהיה לצפות בבירור בחלק הארי של אוכלוסיית התאים, וצייר שער סביב אוכלוסיית התאים. תייג את תאי השער האלה. עם עלילת הנקודה השנייה מגודרת על התאים, שער על פיזור קדימה ואת סינגלים פיזור בצד כדי לא לכלול כפילויות.בחלקה הרביעית, להתאים את הגדרות כתם התא המת האדום, כך שיש אוכלוסייה שלילית בבירור. צייר שער סביב תאים אלה ולתייג את השער הזה תאים חיים. בחלקה החמישית, שער על התאים החיים ולצייר שער סביב התאים החיוביים, ואז להפעיל כל מדגם איסוף לפחות 25, 000 אירועים תא חי.כאשר כל הדגימות נותחו, בצע את הליך הכיבוי כדי לכבות את fluidics, למלא את מיכל נדן ולרוקן את מיכל האשפה. לאחר ניתוח אחוז תאי הדם האדומים החיוביים של GFP מכל דגימת זברה עוברית, ניתן לחשב את הממוצע של כל קבוצת הביקורת. בדרך כלל, הממוצע מוגדר כאחד וכל האחוזים מחושבים מנקודת התייחסות זו.בניתוח מייצג זה, נקבע כי הפחתת תעתיק ISM1 עם מורפולינו ספציפי, להפחית את מספר תאי הדם האדומים החיוביים GFP נוכח בתוך 48 שעות לאחר הפריה עוברים. הצלת ירידה זו ברמות מורפולינו ISM1 עם mRNA אקסוגני, להחזיר את מספר תאי הדם האדומים לנורמלי. עיכול נכון על הדגימות הוא קריטי.אם אתה מעכל יתר על הערך או מעכל, לא תקבל את התוצאות הנכונות. אם מכשיר פקס זמין, החוקרים יכולים לאסוף את תאי הדם על ידי מיון עבור תרבות במבחנה, רצף RNA ו RT-PCR כמותי.

using-flow-cytometry-to-detect-quantitate-altered-blood-formation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

דרך מהירה לבצע immunostaining לב עוברי דג הזברה הוא תיאר. לעומת הגישה הר שלם immunostaining, שיטה זו מגדילה באופן דרמטי את החדירה של נוגדנים, אשר מאפשר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה החושפים מבנים הסלולר / subcellular בלב תוך זמן עיבוד מופחת בהרבה.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

מאמר זה מציג שיטה לאיסוף הדם באבי העורקים הגב של דג הזברה. כמו כן, מספק הוראות להשגת סרום לשימוש בניתוחים ביוכימיים, כגון בדיקות לקביעת רמות כולסטרול וטריגליצרידים.

הדם אוסף של ניתוח ביוכימי דג הזברה למבוגרים בלבד

הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה כדי quantitate hematopoietic גזע קדמון תאים (HSPCs) בדג זברה עובריים. HSPCs של דג זברה חלופה מועדפת הינם מצופה ב- methylcellulose עם גורמים תומכת, המבדילים לדם בוגרת. פעולה זו מאפשרת הגילוי של דם פגמים ומאפשר סמים הקרנת להתנהל בקלות.

התפתחות במבחנה הנועד Quantitate גזע Hematopoietic, קדמון תאים (HSPCs) בפיתוח עוברי דג זברה

ב vivo הדמיה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הסלולריים בבסיס פיתוח מערכת העצבים. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות באמצעות התווית בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

אנו מתארים פרוטוקול להשתלת קסנו בחלמון של עוברי דגי זברה שקופים המותאם בשיטת היערכות פשוטה ומהירה. ניתוחים לאחר הזרקה כוללים הישרדות והערכת נטל המחלה של תאים מושתלים על ידי ציטומטריית זרימה.

שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה

פרוטוקול זה מתאר שיטת מיקרוסקופ אור בעלות נמוכה להערכת מורפולוגיה ותפקוד לב בעוברי דג זברה, המאפשרת הערכה ניתנת לשחזור של רעילות לב התפתחותית ללא צורך במערכות הדמיה מתקדמות.

הדמיית לב תפקודית בעוברי דג זברה באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית וניתוח וידאו: יישומים במחקר סביבתי וביו-רפואי

במחקר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לביצוע ניתוח צבע כחול של אוונס (EBD) על זחלי דג הזברה.  טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לאפיון שלמות שרירי השלד ותיחום מודלים של דג זברה של ניוון שרירים, והיא שיטה רבת ערך לפיתוח טיפולים חדשים.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

למדו לכמת תאי דם בזברה מתפתחים באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת לחקור השפעות של שינויים גנטיים על התפתחות הדם ולזהות ליקויי דם ב-Danio rerio.

שימוש בציטומטריית זרימה כדי לזהות ולכמת היווצרות דם שהשתנתה בדגי הזברה המתפתחים

גלה סרטונים נוספים