Name: במודל חוץ גופית של עורית האדם יפרטרופית צלקות באמצעות הצפיפות Macromolecular (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: למד ליצור מודל חוץ גופית של עורית אנושית היפרטרופית באמצעות טכניקת הצפיפות המקרומולקולרית. שיטה זו מחקה את הסביבה הצפופה של רקמות עור ומאפשרת חקר התנהגות פיברובלסטים בסביבה דומה לתנאים פיזיולוגיים אמיתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מימון של הסוכנות של סינגפור למדע, טכנולוגיה ומחקר "SPF 2013/004: ביולוגיה של העור מחקר בסיסי" ואת "טיפוח הפצע חדשנות עבור הטרופיקס" חיל האוויר-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. המחברים הכירו בהכרת תודה ובסיוע ד ר פאולה בני וד ר מיכאל ראע'בט.

1. תרבית תאים
<ol><li>שמירה על hHSFs ושריפוטות העור הרגיל נגזר מרקמת שאינו פתולוגי (hNSFs) ב בינונית שונה של הנשר של דולבקה (DMEM) המכיל 10% סרום עגל עוברי (FCS) ו 1% v/v פניצילין/סטרפטומיצין פתרון (P/S) ב 37 ° c בחממה עם 5% CO2/95</li>
	<li>רכישה של Ficoll 70, פיקדול 400 וחומצה אסקורבית מהחברות המתאימות.</li>
</ol>2. בניית יפרטרופית של MMC מודל צלקת
<ol><li>הזרע את ה-hHSFs או hNSFs (50,000/טוב) לצלחת 24 המכיל 1 מ ל של מדיה בכל באר.</li>
	<li>מניחים בחממה 37 ° c ב 5% CO2 ולעזוב את הלילה.</li>
	<li>הכן את מדיית MMC. בהתבסס על הנפח הכולל הנדרש עבור הניסוי, לייצר 10% FCS/DMEM מדיה על ידי ערבוב Ficoll 70 (18.75 mg/mL), פיקדול 400 (12.5 mg/mL), ו חומצה אסקורבית (100 μM).</li>
	<li>מניחים את התערובת לתוך מרחץ מים 37 ° c עבור 1 כדי לפזר את הקרודרים לתוך הפתרון, ולאחר מכן לעקר את מדיית MMC באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר.</li>
	<li>לסחוט את התקשורת המושקע ולהחליף עם מדיה MMC שנעשו טרי.</li>
	<li>מודטה את התאים 6 ימים ב 37 ° c ו 5% CO2, שינוי התקשורת כל 3 ימים.</li>
</ol>3. ביטוי הסכום הכולל של קולגן
<ol><li>הכינו את הפתרון האדום של סיריוס (0.1% w/v). לפזר 0.2 g של ישיר אדום 80 אבקה ב 200 mL של מים מזוקקים מזוקק (ddH2O) עם 1 מ ל של חומצה אצטית.</li>
	<li>משף את מדיית MMC ומוסיף 300 μL של הפתרון של סיריוס Red לתוך כל באר. מודטה ב 37 ° c עבור 90 דקות.</li>
	<li>לשטוף בעדינות את הפתרון סיריוס אדום עם מים ברז ולאפשר את הצלחת להתייבש באוויר לילה.</li>
	<li>לחלץ את סיריוס אדום הכתם על ידי הוספת 200 μL של נתרן הידרוקסיד (0.1 M) לתוך כל טוב. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית עבור 5 – 10 דקות כדי לחלץ במלואו את הכתם האדום של סיריוס.</li>
	<li>העבר 100 μL של הכתם שחולצו סיריוס אדום לתוך 96 לוחית שקופה היטב ולמדוד את ספיגת ב 620 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלייט.</li>
</ol>4. ביטוי של קולגן אני (כתמים חיסוני)
<ol><li>שטוף את הבארות באמצעות 200 μL של תמיסת מלח פוספט באגירה (PBS, pH = 7.35).</li>
	<li>תקן את התאים באמצעות מתנול (500 μL/ועוד) ב 4 ° צ' עבור 10 דקות.</li>
	<li>חסימת אינטראקציות שאינן ספציפיות עם 3% סרום באלדק להסרת 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>מנושף את פתרון החסימה ואת הדגירה עם 200 μL של אנטי קולגן אני נוגדן (10 μg/mL) עבור 90 דקות ב RT.</li>
	<li>מנושף את הנוגדן העיקרי ולשטוף 3x עם PBS עבור 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>דגירה עם 200 μL של עז אנטי ארנב-FITC נוגדן משני (1:400 דילול) ו 4', 6-diamidino-2-פניינילידול (dapi; 1:2000 דילול) עבור 30 דקות ב RT. לכסות את הצלחת עם רדיד אלומיניום.</li>
	<li>להיפטר הן נוגדן משני DAPI ולשטוף 3x עם PBS עבור 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>המחש את הקרינה הפלואורסצנטית. ישירות מתחת למיקרוסקופ</li>
</ol>5. כתמים מערביים
<ol><li>שטוף את התאים 2x עם PBS.</li>
	<li>הוסף 40 μL של מאגר הליזה לתוך כל באר ומגרד את שכבת התא עם קצה של פיפטה. מאגר הפירוק מכיל מאגר ריפה, מעכב פרוטאז קוקטייל (PIC), 2 מ"מ vanadate נתרן, ו 10 מ"מ נתרן פלואוריד.</li>
	<li>להעביר את החלבון ליפוסט לצינורות מיקרוצנטריפוגה ולמדוד את ריכוז החלבון באמצעות שיטת חלבון לפי הוראות היצרן16.</li>
	<li>טען 10 μg של חלבון של כל קבוצה לתוך הבארות של 4% – 12% Bis-Tris חלבון. ביצוע נתרן dodecyl סולפט אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (sds-עמוד) ב 200 V עבור 30 דקות.</li>
	<li>להעביר את החלבון כדי ניטרוצלולוזה על ידי הפעלת כתם מערבי ב 90 V עבור 90 דקות. להימנע היווצרות של בועות אוויר בין ג'ל ו ניטרוצלולוזה קרום.</li>
	<li>חסימת הקרום עם 10 מ ל של מאגר חסימה.</li>
	<li>דגירה עם נוגדנים הראשי ב 4 ° c לילה. נוגדנים עיקריים הם: אנטי קולגן אני, אנטי קולגן השלישי, אנטי קולגן IV, נגד αSMA, anti-MMP-1, נגד-MMP-2, anti-MMP-9, נגד-MMP-13, ו נגד גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (מגנד).</li>
	<li>לשטוף את הקרום עם 0.1% TBS-רצף 20 (5x עבור 5 דקות כל אחד). TBS/יצירת רצף 20 (1 L) מכיל את הפרטים הבאים: 50 mL של 1 M טריס (pH = 7.4), 30 מ ל 5 מ נתרן כלוריד, 1 מ ל של רצף 20, ו 920 mL של ddH2O.</li>
	<li>דגירה עם מין נוגדן משני המתאים ב RT עבור 1 h.</li>
	<li>חזור על שלב 5.8 והמחש את הקרינה הפלואורסצנטית באמצעות מערכת דימות.</li>
</ol>6. RT-PCR
<ol><li>לאסוף את ה-RNA הכולל באמצעות מאגר הליזה מעורבב עם 2-mercaptoethanol כלולים בערכת שיטת החילוץ RNA.</li>
	<li>לטהר את ה-RNA לפי הוראות היצרן17.</li>
	<li>למדוד את ריכוז RNA באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרוvolume.</li>
	<li>בצעו את הסינתזה הראשונה של cDNA באמצעות ערכת סינתזה של cDNA לפי הוראות היצרן.</li>
	<li>בדים מותאמים אישית מסופקים (מצופה מראש) ב96 לוחות היטב. מערבבים 100 ng של דגימות cDNA עם 10 μL של SYBR ירוק שילוב לתוך לוחית אישית.</li>
	<li>הגדל את אמצעי האחסון הכולל ל-20 μL/היטב באמצעות ddH2O.</li>
	<li>הפעל RT-PCR באמצעות ציקלייר תרמית בעקבות ההוראות של היצרן: 40 מחזורים של הרפתקאות ב 98 ° c עבור 15 s וריפוי/הארכה ב 60 ° c עבור 60 s. הגנים שנבדקו ב-RT-PCR כוללים: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4 , SMAD7, IL1A, IL1B , IL6, IL8 , MMP1 , MMP2 , MMP3 , TGFB1 , ו-והוא .</li>
</ol>

<ol><li>vander Veer, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+cellular+and+molecular+causes+of+hypertrophic+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation.</a> Burns. 35 (1), 15-29 (2009).</li>
<li>Linge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+Scar+Cells+Fail+to+Undergo+a+Form+of+Apoptosis+Specific+to+Contractile+Collagen%5Bmdash%5DThe+Role+of+Tissue+Transglutaminase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).</li>
<li>Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+TGF-beta+family+in+wound+healing%2C+burns+and+scarring%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Burns+and+Trauma%22%5BJournal%5D)">The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review.</a> International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+correlation+of+in+vivo+burn+scar+contraction+with+the+level+of+alpha-smooth+muscle+actin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression.</a> Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).</li>
<li>Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle-depleted+fetal+bovine+and+human+sera+have+reduced+capacity+to+support+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373(2015).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+enhancement+of+collagen+matrix+formation+and+crosslinking+for+applications+in+tissue+engineering%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study.</a> Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).</li>
<li>Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+macromolecular+crowding+can+do+to+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">What macromolecular crowding can do to a protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).</li>
<li>Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li>
<li>Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+Crowding+Directs+Extracellular+Matrix+Organization+and+Mesenchymal+Stem+Cell+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior.</a> PloS one. 7 (5), 37904(2012).</li>
<li>Chen, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Scar-in-a-Jar%3A+studying+potential+antifibrotic+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+%22macromolecular+crowding%22+in+vitro+to+investigate+the+naphthoquinones+shikonin%2C+naphthazarin+and+related+analogues+for+the+treatment+of+dermal+scars%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars.</a> Chemico-Biological Interactions. 310, 108747(2019).</li>
<li>Canty, E. G., Kadler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procollagen+trafficking%2C+processing+and+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis.</a> Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).</li>
<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+Excluded+Volume+Interaction+between+an+Unfolded+Protein+and+Rigid+Macromolecular+Cosolutes%3A+Macromolecular+Crowding+and+Protein+Stability+Revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).</li>
<li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Linearization of the bradford protein assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), e1918(2010).</li>
<li>Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+RNeasy+Mini+Kit+to+obtain+high-quality+total+RNA+from+sessile+cells+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Medical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).</li>
<li>Xue, M., Jackson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Matrix+Reorganization+During+Wound+Healing+and+Its+Impact+on+Abnormal+Scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+wound+care+%28New+Rochelle%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring.</a> Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).</li>
<li>Rohani, M. G., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+remodeling+by+MMPs+during+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrix remodeling by MMPs during wound repair.</a> Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).</li>
<li>Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+in+patients+with+different+types+of+scars+and+keloids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plastic%2C+Reconstructive+%26+Aesthetic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids.</a> Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).</li>
<li>Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Implications+of+the+IL-6+Signaling+Pathway+in+Keloid+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).</li>
<li>Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+scar+formation+by+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor.</a> Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).</li>
<li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+use+for+polyvinylpyrrolidone+as+a+macromolecular+crowder+for+enhanced+extracellular+matrix+deposition+and+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).</li>
<li>Lago, J. C., Puzzi, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+aging+in+primary+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The effect of aging in primary human dermal fibroblasts.</a> PloS one. 14 (7), 0219165(2019).</li>
<li>Cigognini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding+meets+oxygen+tension+in+human+mesenchymal+stem+cell+culture+-+A+step+closer+to+physiologically+relevant+in+vitro+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis.</a> Scientific Reports. 6, 30746(2016).</li>
<li>Cuttle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porcine+deep+dermal+partial+thickness+burn+model+with+hypertrophic+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring.</a> Burns. 32 (7), 806-820 (2006).</li>
<li>Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+potential+of+Shikonin+as+a+novel+hypertrophic+scar+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment.</a> Journal of Biomedical Science. 22, 70(2015).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shikonin+reduces+TGF-beta1-induced+collagen+production+and+contraction+in+hypertrophic+scar-derived+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts.</a> International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).</li>
<li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte-Fibroblast+Interactions+in+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

פרוטוקול זה נועד למטב ולאמת שיפור: צלקת-in-a-צנצנת מודל בלתי מתורבת לרקמת צלקת אנושית. מחקרים קודמים דיווחו על היישום של הטכניקה של MMC לריאות האדם פיברותקיעות12, מח עצם האדם mesenchymal גזע התאים23, ואת הגוף האנושי פיברופיצוצים23 באמצעות תוספי12, ficoll12, ו PVP23 כקרודרס. במחקר שדווח כאן, הפרוטוקול שפורסם בעבר עבור יפרטרופית צלקת שנגזר העור האדם פיברותקיעות היה אופטימיזציה עם F...

רקמת צלקת מייצגת את נקודת הקצה של תיקון רקמות. עם זאת, אנשים רבים, במיוחד אלה הסובלים כוויות או טראומה1, הצטלקות יכולה להיות מוגזמת ולהטיל השפעות לא רצויות על מורפולוגיה ותפקוד של העור נרפא. למרות המנגנון המדויק של פתולוגי (צלקות יפרטרופית ו keloids) היווצרות צלקת לא מובנים לחלוטין, הפקדת מוגזמת של קולגן במהלך ריפוי הפצע הוכח להיות תרומה חיונית2.
הוא מבוסס היטב כי שינוי גורם הצמיחה ביתא 1 (tgf-β1) ו אלפא שריר חלק שרירים אקטין (αSMA) לשחק תפקידי מפתח בהיווצרות של יפרטרופית צלקות. הראיות מצביעות על כך מוגבה TGF-β1 ישירות מעוררת הפקדת מוגזמת של קולגן באמצעות ויסות SMAD איתות מסלול3. בנוסף, αSMA נמצא לתרום היווצרות צלקת יפרטרופית על ידי ויסות התכווצות התא והאפיתל בתהליך ריפוי הפצע4. היעדר מתאים בתוך מבחנה ומודלים vivo הוא מכשול גדול כלפי פיתוח והערכת התערבויות וטיפולים לשיקום צלקת. מטרת מחקר זה היא לנצל את הטכניקה הקיימת של MMC כדי לבנות "בvivo כמו" יפרטרופית צלקת מודל המתאים להערכת הרומן המתעוררים צלקת התערבויות הקשורות.
שחזור רקמות החיים מחוץ לגוף היה מטרה במשך שנים בקהילה המדעית. התפתחות בטכניקות החוץ-גופית בתחילת המאה ה-20 השיגה מטרה זו. הנוכחי טכניקות מבחנה התפתחו מעט מן ההפגנה המקורית של רו כי תאים עובריים יכולים לשרוד לשעבר vivo למשך מספר ימים בתמיסת מלח חם5. עם זאת, במתודולוגיות חוץ-גופית מוגבלים בעיקר לסוגי תאים בודדים המעובדים ב-2-D ואינם מvivo באופן מדויק רקמות בלתי מוגבלות. בעוד שימושי לבדיקת ביוכימיה תא, פיזיולוגיה וגנטיקה, רקמות מקוריות הן תלת-ממד ולשלב סוגי תאים מרובים. 2-D פשוט במערכות מבחנה הנושאים תאים מיונקים לסביבות מלאכותיות מאוד שבו הארכיטקטורה המקורית ספציפית רקמות הוא איבד6. בתורו, זה משפיע על אירועים תאיים ומסחטות, וכתוצאה מכך מורפולוגיה התא נורמלי, פיזיולוגיה, התנהגות7.
הריבית מאחורי פרוטוקול זה טמונה בפיתוח וניהול קליני של צלקות יפרטרופית ו keloids. בעוד הוא מבוסס היטב כי העור שפיברותקיעות אחראים במידה רבה לייצור שופע של collagens הנוכחי ברקמת צלקת, טיפוח פיברותקיעות העור באמצעות 2-D במערכות מבחנה נכשלת לשכפל את תחלופת הקולגן נצפתה ב vivo8. מודרני בשיטות מבחנה עדיין למעשה להשתמש "מלוחים חמים", סביבה שונה לחלוטין מזה ברקמות החיים. רקמות בvivo הם צפופים מאוד, עם חלבונים, חומצות גרעין, הריבונצירופדים, ו פוליסכרידים, הכובש 5% – 40% של נפח הכולל. כפי שאין שתי מולקולות יכול לכבוש את אותו החלל באותו זמן, יש מעט שטח פנוי זמין והעדר כמעט מוחלט של מים חינם9.
טכניקת ה-MMC מטילה אילוצים המשפיעים על המאפיינים התרמודינמיים של הנוזל הציטוזול והביניים. אינטראקציות מולקולריות, מכלולי קולטן לליטרים ואותות, אנזימים ואורגלים, מוגבלים ומוגבלות מאינטראקציה באופן חופשי9. אינטראקציות בתוך הסביבה הפראיסלנדי (כלומר, interstitium) גם הן מאולצת. הראיות האחרונות מאשרות כי ריכוזים גבוהים של קרו אינרטי פתרונות צפופים perturb דיפוזיה, האגודה הפיזית, צמיגות ונכסים הידרודינמיים10.
מעניין, מספר סוכני הצפיפות הפופולריים (כלומר, Ficoll dextran, polyvinylrolidone [PVP], ו נתרן 4-styreneסולפיאט [PSS]) אינם שקולים כאשר מוחלים על סוגי תאים שונים ובהגדרות שונות. במחקר קודם, פיקדול דווח להיות פחות ציטוטוקסיים עבור תאי גזע mesenchymal לעומת PVP. תוצאות אלו הפרדרו להיות תוצאה של המטען הנייטרלי ורדיוס הידרודינמי קטן יחסית11. לעומת זאת, המחקר השני מצא כי תוספי יעיל יותר בגירוי קולגן אני התצהיר על ידי הריאות האדם פיברופיצוצים לעומת ficoll12. נתונים מתוך המחקר שלנו עולה כי Ficoll מגביר את התצהיר הקולגן על ידי יפרטרופית הצלקת נגזר פיברופיצוצים, בעוד PVP הוא רעיל תאים אלה13.
הוכח כי ההמרה של procollagen לקולגן הוא מהיר יותר בסביבה מאוד vivo14, בעוד שיעור התגובות הביולוגי מתעכב במערכת התרבות 2-D מדולל15. יש לנו אופטימיזציה בפרוטוקול מבחנה כאן, שילוב של MMC כדי להראות את הטיפוח של הכדורים העורי משמש כמו יותר "בvivo-כמו" מודל פיברוזיס העורי והיווצרות צלקת. בניגוד למערכת התרבות הדו המשותפת, טיפוח ה-hHSFs עם MMC מעורר את הביוסינתזה והפקדת הקולגן באופן משמעותי13. בעיקר, מאפיינים אחרים של סיסטיק (כלומר, ביטוי מוגבר של מטריקס מטאלוטיות [MMPs] ו ציטוקינים proinflammatory) ניכרים גם תחת פרוטוקול MMC זה אופטימיזציה13. כאשר מעובד בשיטה זו, הוא מוצג כי התאים העורי לכידה של הפרמטרים הפיסיולוגיים, ביוכימיים, פונקציונלי הנמדד vivo.
MMC אופטימיזציה בפרוטוקול מבחנה שימש כדי להעריך את הביטוי של קולגן ו חלבונים ecm אחרים על ידי העור פיברותקיעות מבודדים מיפרטרופית צלקת דרמיס ולא מעורב דרמיס הסמוכים. כאשר מעובדים בסביבות MMC בתוך מבחנה, זה כבר נצפתה כי hHSFs לבטא מאפיינים מסוימים (כלומר, mRNA, ביוכימיה, פיזיולוגיה, ו-פנוטיפ) דומה יפרטרופית רקמת צלקת בvivo. הראיות מצביעות על כך שתכונות פיזיות וכימיות הן שיקולים חשובים בעת בחירת מקרודרים ואופטימיזציה של תנאי MMC לצורך טיפוח-תרגול.
לצורך הוכחת העיקרון, פרוטוקול MMC מוחל כאן כדי להעריך ולכמת את היכולת של Shikonin ואת האנלוגיות שלה כדי לגרום אפופטוזיס. זה מאפשר הערכה של יישומים פוטנציאליים של אלה באופן טבעי-נגזר הרפואה הסינית המסורתית (TCM) תרכובות עבור ניהול עורי הצטלקות13. על אף, הפשטות, העלות והאפקטיביות והדייקנות של זה בפרוטוקול MMC מספק גם את התקנות האחרונות לחיסול ניסויים ביונקים על ידי הדירקטיבה של האיחוד האירופי 2010/63/האיחוד האירופי וארה ב. הסוכנות להגנת הסביבה (EPA).

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu; m filter</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21076</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 800</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11371</td><td></td></tr><tr><td>אלפא שריר חלק אקטין (&alpha;SMA) נוגדן ראשוני</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7500 מערכת PCR מהירה בזמן אמת (מחזור תרמי)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>Wako</td><td>#013-12061</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>#A2153</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת חלבון ברדפורד</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני קולגן I (לצביעה חיסונית)</td><td>Abcam</td><td>6308</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני קולגן I (לכתם מערבי)</td><td>Abcam</td><td>ab21286</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני קולגן III</td><td>Abcam</td><td>ab7778</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני קולגן IV</td><td>Abcam</td><td>ab6586</td><td></td></tr><tr><td>אדום ישיר 80</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>2610108</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11996-065</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>6000-044</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>GE HealthCare</td><td>#17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 70</td><td>GE HealthCare</td><td>#17-0310-10</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני GAPDH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב עז</td><td>Abcam</td><td>ab97050</td><td></td></tr><tr><td>צלקת היפרטרופית אנושית/פיברובלסטים רגילים (hHSF/hNSF)</td><td>Cell Research Corporation</td><td>106, 107, 108</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>#1708890</td><td></td></tr><tr><td>MMP-1 נוגדן ראשוני</td><td>Abcam</td><td>ab38929</td><td></td></tr><tr><td>MMP-13 נוגדן ראשוני</td><td>Abcam</td><td>ab39012</td><td></td></tr><tr><td>MMP-2 נוגדן ראשוני</td><td>Abcam</td><td>ab37150</td><td></td></tr><tr><td>MMP-9 נוגדן ראשוני</td><td>Abcam</td><td>ab38898</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ספקטרופוטומטרים מיקרונפח</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>קרום ניטרוצלולוזה</td><td>Bio-Rad</td><td>10484060</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% ג'ל חלבון ביס-טריס</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>מאגר חוסם אודיסיאה</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927&ndash; 40000</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc Imaging System</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-81 מיקרוסקופ HCS (לצביעה חיסונית)</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין (P/S)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR Astests</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>פריימרים מותאמים אישית מצופים מראש בצלחות של 96 בארות על פי דרישה</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז (PIC)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>PVP 360</td><td>סיגמא</td><td>#PVP360</td><td></td></tr><tr><td>PVP 40</td><td>סיגמא</td><td>#PVP40</td><td></td></tr><tr><td>מאגר RIPA</td><td>Merck</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td> <td>#74134</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ונדאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>נתרן vanadate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 קורא מיקרו-פלטות רב-מצבי</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced אוניברסלי SYBR ירוק סופרמיקס</td><td>Bio-Rad</td><td>#172-5270</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

במודל חוץ גופית של עורית האדם יפרטרופית צלקות באמצעות הצפיפות macromolecular

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

זה הוכח כי ברקמות vivo הם צפופים מאוד על ידי חלבונים, חומצות גרעין, מבריאוציצירופנים, פוליסכרידים, וכו '. הפרוטוקול הבא מחיל את טכניקת הצפיפות הmacromolecular (MMC) כדי לחקות את הצפיפות הפיזיולוגית הזו באמצעות הוספת פולימרים ניטרליים (קרוקודרים) לתרביות תאים בתוך מבחנה. מחקרים קודמים באמצעות ficoll או תוספי כמו הקרודרים להפגין כי הביטוי של קולגן אני ו fibronectin ב WI38 ו-WS-1 קווי התא משופרים באופן משמעותי באמצעות הטכניקה MMC. עם זאת, טכניקה זו לא אומתה יפרטרופית העיקרי צלקת-הנגזר העור האדם פיברוהפיצוצים (hHSFs). כמו צלקות יפרטרופית נובע התצהיר מוגזם של קולגן, פרוטוקול זה שואפת לבנות קולגן עשיר במודל צלקת יפרטרופית מתורבת על ידי החלת הטכניקה MMC עם hHSFs. מודל זה ממוטב MMC הוכח להיות בעל דמיון רב יותר עם רקמת צלקת vivo בהשוואה למערכות מסורתיות דו-ממדי (2-D) מערכות תרבות התא. כמו-כן, הוא חסכוני, חסכוני בזמן, ורצוי מבחינה אתית בהשוואה למודלים חייתיים. לפיכך, המודל הממוטב המדווח כאן מציע מודל "בvivo" מתקדם למחקרים יפרטרופית הקשורים לצלקת.

דגימות שלישיה נערכו בכל ניסוי, וכל ניסוי חזר על עצמו 3x באמצעות תאים משלושה חולים בודדים. נתונים מבוטאים כאחוזים מקבוצת הפקדים. בכיוון אחד של ANOVA ו-Tukey של מבחן שלאחר-הוק הוחלו לנתח הבדלים סטטיסטיים (*p ˂ 0.05).
MMC באמצעות שימוש ב-9% FVO (תפוסת נפח החלקי) משפר את הכמות הכוללת של קולגן וקולגן אני התצהיר ב hHSF13. כפי שמודגם באיור 1A, צפיפות התא של hHSFs גברה באופן משמעותי לאחר השימוש בפיקדול ב -9% ו-18% fvo לעומת הפקד ו-MMC באמצ...

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בmacromolecular הצפיפות כדי ליצור מודל מחוץ לגוף האדם יפרטרופית רקמת צלקת הדומה בתנאים vivo. כאשר מעובדים בסביבה macromolecular צפופה, העור האנושי לגידולים התערוכה פנוטיפים, ביוכימיה, פיזיולוגיה, ופונקציונלי מאפיינים דומים רקמת צלקת.

במודל חוץ גופית של עורית האדם יפרטרופית צלקות באמצעות הצפיפות Macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

יצרנו מודל אינדיבידואלי עשיר בקולגן כדי לחקות את הסביבה שתאים חווים ב-vivo באמצעות טכניקת הצפיפות המקרומולקולרית. העור הוא סביבה צפופה, בניגוד לסביבה הנוזלית שאנחנו כבר משתמשים בה כדי לגדל תאים במבחנה. בהשוואה למערכת התרבות המסורתית של תאי המונוליאר, מודל זה משחזר את הסביבה המולקולרית הצפופה שתאים חווים ב-vivo, במיוחד ברקמות צלקת שבהן מטריצה חוץ-תאית שופעת מעיף מים נוזליים.מלבד צלקות היפרטרופיות, טכניקת צפיפות מקרומולקולרית זו יכולה לשמש למחקרים שבהם המטריצה החוץ-תאית שופעת, כגון פיברוזיס ריאתי. לגדל פיברובלסטים שמקורם בצלקות ונורמליים בהתאם לכיווני כתב היד. ואז לזרוע אותם לתוך 24 צלחות גם ב 50, 000 תאים לגם במיליליטר אחד של מדיום.דגירה צלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. הכן צפיפות מקרומולקולרית או מדיה MMC על ידי ערבוב Ficoll 70, Ficoll 400 וחומצה אסקורבית לתוך 10%FCS DMEM. דגירה התקשורת באמבט מים כדי לפזר את ההמונים לתוך הפתרון.לאחר מכן לעקר אותו עם מסנן מיקרומטר 0.2. שאף את התקשורת שהוצאה מהפיברובלסטים והחלף אותה במדיה MMC טרי. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שישה ימים, שינוי התקשורת MMC כל שלושה ימים.הכן פתרון סיריוס אדום על ידי המסת 0.2 גרם של אבקת ישיר אדום 80 ב 200 מיליליטר של מים מזוקקים deionized עם מיליליטר אחד של חומצה אצטית. שאפו את מדיית MMC מהתאים והוסיפו 300 מיקרוליטרים של פתרון סיריוס רד לכל באר. ואז להחזיר את התאים לאנקובטור במשך 90 דקות.לאחר הדגירה, יש לשטוף בעדינות את התסנובה של סיריוס רד במי ברז ולאפשר לצלחת להתייבש באוויר במשך הלילה. ביום שלמחר, לחלץ את סיריוס אדום על ידי הוספת 200 microliters של 0.1 נתרן הידרוקסיד טוחנת לתוך כל באר לנער את הצלחת במשך חמש עד 10 דקות. מעבירים 100 מיקרוליטרים של הכתם המופק לצלחת שקופה של 96 באר ומודדים את הספיגה ב-620 ננומטר עם קורא לוחות מיקרו.לשטוף כל באר עם 200 microliters של PBS ולתקן את התאים עם מתנול בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן הוסיפו 3%BSA ל הבאר והו דגירה של הצלחת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את פתרון החסימה והוסיפו 200 מיקרוליטרים של נוגדן אחד נגד קולגן לכל באר.להתהגר בצלחת במשך 90 דקות. ואז לשוטוף את הנוגדן ולשטוף את בארות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף. הוסף 200 מיקרוליטרים של נוגדן משני נגד ארנב-FITC עזים ו- DAPI לכל באר.מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדרגים אותה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. השלך את הנוגדן המשני ואת DAPI וחזור על השטיפה עם PBS. ואז לדמיין את הפלואורסצנטיות ישירות תחת מיקרוסקופ.לאחר שטיפת התאים פעמיים עם PBS, מוסיפים 40 מיקרוליטרים של מאגר תיזה לתוך כל באר ומגרדים את שכבת התא עם קצה פיפטה. לאחר מכן מעבירים את החלבון ליאזט לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגה כדי למדוד את ריכוז החלבון. טוענים 10 מיקרוגרם חלבון לתוך כל באר של ג'ל חלבון ביס-טריס של 4 עד 12% ומבצעים SDS-PAGE ב-200 וולט למשך 30 דקות.כאשר סיים, להעביר את החלבון קרום nitrocellulose על ידי הפעלת כתם מערבי ב 90 וולט במשך 90 דקות, דואג למנוע היווצרות בועה בין הג'ל לבין הממברנה. חסום את הממברנה עם 10 מיליליטר של חיץ חסימה. ואז לה הדגירה אותו עם נוגדנים ראשוניים בארבע מעלות צלזיוס לילה.ביום שלמחר, לשטוף את הממברנה חמש פעמים עם 0.1 אחוז TBS Tween 20 במשך חמש דקות לשטוף. לאחר מכן הדגירה את הממברנה עם נוגדן משני מתאים למינים במשך שעה בטמפרטורת החדר. חזור על השטיפה והדמיה פלואורסצנטיות עם מערכת הדמיה.לאחר טיהור RNA הכולל עם ערכת מיצוי RNA מסחרית, למדוד ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו נפח. לאחר מכן השתמש בערכת סינתזה cDNA כדי לבצע סינתזת DNA גדיל הראשון. מערבבים את cDNA עם 10 microliters של SYBR ירוק Supermix ולהעביר את הדגימות מותאם אישית 96 צלחת גם מצופה מראש עם פריימרים oligonucleotide.כוונן את הנפח הכולל ל-20 מיקרוליטרים ל באר עם מים והפעל את RT-PCR בהתאם לכיווני כתב היד. צפיפות התאים של פיברובלסטים של עור אנושי המופק מצלקת היפרטרופית גדלה באופן משמעותי לאחר culturing עם Ficoll בהשוואה לשימוש PVP או הפקד. צפיפות מקרומולקולרית עם Ficoll ב-9% נפח חלקי שיפרה באופן משמעותי את התצהיר של קולגן, כולל קולגן אחד, בהשוואה לנוסחים אחרים.זה הודגם עוד יותר עם ניתוח כמותי. פיברובלסטים שמקורם בצלקות ופיברובלסטים עוריים רגילים שטופחו בסביבות MMC נמצאו כדי לווסת את הביטוי של מיני ECM בנוסף קולגן. יש לציין, ביטוי גבוה של מטריקס metalloproteinases או MMPs נמצאה לצבור ברקמות צלקת היפרטרופית לעומת רקמות מקומיות.זה נצפתה כי הביטוי של MMP2, תשעה ו -13 היו מוסדר באופן משמעותי בשני תרבויות התא מעובד בתנאי צפיפות מקרומולקולרית. MMPs ממלאים תפקיד חשוב במהלך ריפוי פצעים היווצרות צלקת, ויסות הרכבה ECM ושיפוץ. סינתזה של interleukin שש וגורם גדילה אנדותל כלי הדם היה בלתי ניתן לגילוי כתם מערבי.אבל ניתוח RT-PCR גילה כי הביטוי של interleukin שש היה מוסדר באופן משמעותי, בעוד הביטוי של גורם הגדילה אנדותל כלי הדם היה מוסדר למטה פיברובלסטים מעובדים בתנאי MMC. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב מאוד לבחור פיברובלסטים עוריים שיש להם מעט מאוד פתוגנים CO. אנחנו גם צריכים לזכור כי חומצה אסקורבית היא מרכיב חיוני במדיום MMC.אנו מעוניינים במיוחד בזיהוי נוסף של תצהיר הקולגן והיישור במודל MMC זה. אנו מתכננים להשתמש בטכניקות מיקרוסקופיות מתקדמות כדי להשוות את המודל הזה במבחנה עם רקמות צלקת מקומיות ב vivo. אנו מעודדים אחרים להשתמש בטכניקת צפיפות מקרומולקולרית זו כדי לשפר את האותנטיות במבחנה של הרקמות המודאליות.כמובן, צפיפות מקרומולקולרית יכולה לשמש גם לחישוב מחדש של מודלים של מחלות ופתולוגיה במבחנה.

in-vitro-model-human-cutaneous-hypertrophic-scarring-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

המטרה של פרוטוקול זה היא לבנות עור תלת מימדי בעובי מלא, הדומה לעור טבעי. עם מכשיר פציעה אוטומטי שנבנה במיוחד, ניתן ליצור פצעים מדויקים וניתנים לשחזור תחת שמירה על סטריליות.

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מקיף ומפורט כיצד ליצור עור אורגנוטיפי אנושי מהונדס גנטית מקרטינוציטים אפידרמליים ודרמיס אנושי נטול חיוניות.

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

אנו מציגים פרוטוקול להשיג מטריצות תאים שמקורם עשירות בחלבונים תאים מטריקס, באמצעות crowders macromolecular (MMC). בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול אשר משלב MMC בדור העור 3D organotypic שיתוף התרבות, אשר מקטין את זמן תרבות תוך שמירה לפדיון של מבנה.

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

פרוטוקול עבור אקסית vivo איברים הקרנית תרבות מודל שימושי עבור לימודי ריפוי הפצע מתואר. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של סוכני כדי לקדם ריפוי משובי או רעילות התרופה סביבה מאורגנת multicellular תלת-ממד.

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לטיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי מחדש באופן ניתן לשחזור וחזק. בנוסף, הוא מאפיין את הקשר המבני-פונקציה של מודל מחסום האפידרמיס. התגובות הביולוגיות של האפידרמיס האנושי המחודש על גירויים proinflammatory מוצגים גם.

טיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי משוחזר בקנה מידה גדול

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את הדור ואת הניתוח הנפחי של שווה ערך לעור אנושי וסקולרי באמצעות טכניקות נגישות ופשוטות לתרבות ארוכת טווח. ככל האפשר, הרציונל לצעדים מתואר כדי לאפשר לחוקרים את היכולת להתאים אישית בהתבסס על צרכי המחקר שלהם.

דור של שווה ערך לעור אנושי בהרכבה עצמית

כאן אנו מדגימים טכניקה ממוטבת להערכת תיקון פצעים באמצעות עור אנושי ex vivo בשילוב עם גישה מוכתמת שלם. מתודולוגיה זו מספקת פלטפורמה פרה-קלינית להערכת טיפולים פוטנציאליים לפצעים.

מודל פצע Ex vivo אנושי וגישה מוכתמת בהר שלם להערכה מדויקת של תיקון העור

פרוטוקול זה מתאר את הדור של אקספלנט עור-פאשיה המכונה "SCar כמו רקמה בצלחת" או SCAD. מודל זה מאפשר הדמיה חסרת תקדים של פיברובלסטים בודדים במהלך היווצרות צלקות.

הדמיה של התפתחות צלקות באמצעות בדיקת SCAD - בדיקה של צלקות עור לשעבר-situ

כאן, אנו מציגים הליכים זולים ופשוטים להצגת מודלים שונים של עור תלת ממדי למחקר שגרתי במעבדה לתרביות תאים. חוקרים יכולים ליצור מודלים המותאמים לצרכיהם מבלי להסתמך על מודלים זמינים מסחרית.

בניית מודלים לעור עבור יישומים רבים - החל ממונוקולטורה דו-ממדית (2D) ועד רב-תרבותיות תלת-ממדית (3D)

פרוטוקול זה יסביר כיצד לבסס מודל עכברי צלקות היפרטרופיות המגביר את איתות הטרנסדוקציה המכנית כדי לדמות צלקות דמויות אדם. שיטה זו כוללת הגברת מתח מכני על פני חתך ריפוי בעכבר ושימוש במכשיר מיוחד ליצירת רקמת צלקת מוגזמת הניתנת לשחזור לצורך ניתוחים היסטולוגיים וביואינפורמטיים מפורטים.

מודל עכבר של צלקות היפרטרופיות דמויות אדם המונעות על ידי מכניקה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור אורגנואידים בעור המכילים זקיקי שיער מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם באמצעות מערכת תרבית ממשק אוויר-נוזל מישורית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית כדי לשכפל את הארכיטקטורה והתפקוד של העור.

יצירת אורגנואידים מעור מישוריים נושאי שיער שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות מערכת תרבית ממשק אוויר-נוזל

למד ליצור מודל חוץ גופית של עורית אנושית היפרטרופית באמצעות טכניקת הצפיפות המקרומולקולרית. שיטה זו מחקה את הסביבה הצפופה של רקמות עור ומאפשרת חקר התנהגות פיברובלסטים בסביבה דומה לתנאים פיזיולוגיים אמיתיים.

במודל חוץ גופית של עורית האדם יפרטרופית צלקות באמצעות הצפיפות Macromolecular

גלה סרטונים נוספים