Name: הפקה ואפיון של מקרופאגים האדם מ Pluripotent תאי גזע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: למד שיטה להפקת מקרופאגים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) ואפיונם באמצעות ציטומטריית זרימה ומבחני פאגוציטוזה. פרוטוקול זה מאפשר ייצור בר-קנה מידה לחקר מחלות ולטיפולים תאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפיונה רוסי ולקלייר קראייר לקבלת סיוע בעזרת הטאסינסה, אאוגן או'דובהיר וברטרנד ורניי במיקרוסקופיה. העבודה הזאת ממומנת על ידי CONACYT (M.L.-Y.), ברוך אמון (102610) ו לחדש בבריטניה (L. M. F), ברוכים הסומכים ד ר שטודנשיפ (א. מ.), הרפואה מדויקת MRC (T. V). אל-סי ו-J.W.P. נתמכים על ידי "אמון ברוך הבא" (101067/Z/13/Z), מועצת המחקר הרפואי (MR/N022556/1), ופעולת עלות BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).

הערה: כל החומרים הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים ברשימת החומרים. התקשורת צריכה להיות ב 37 ° צ' לתרבות התא. מדיה וריאגנטים המשמשים את פרוטוקול הבידול חייב להיות עקר.
1. קו iPSC האדם הפשרה ואחזקה
<ol><li>
הכן את אמצעי תחזוקת התא, גורמי גדילה, וריאגנטים אחרים.
	<ol>
<li>להכין hESC-סרום חינם מדיה (hESC-SFM; ראה טבלה של חומרים) על ידי להשלים את הנשר בינונית שונה של Dulbecco-f12 (Dמאמ/F12) עם תוספת hesc, 1.8% w/v סרום בקר (bsa), ו 0.1 mM 2-mercaptoethanol.</li>
		<li>הכנת האדם בסיסי פיברופיצוץ מקדם צמיחה (bFGF) מניות פתרון (10 μg/mL) על ידי המסת bFGF בתוך סטרילי 0.1% נסיוב האדם אלבומין (HSA)-פוספט באגירה מלוחים (PBS) פתרון. הפץ את פתרון המניה כ200 μL בהקפאה. ניתן לאחסן פתרונות מניות ב-20 ° c עד שנה אחת. לאחר הופלה, bFGF מניות ניתן לאחסן ב 4 ° c עבור 7 ימים.</li>
		<li>הכנת Rho קינאז מעכבי (סלע מעכבי)-Y27632 פתרון מניות (1 מ"ג/mL) על ידי המסת אותו במים סטרילי. הפץ את פתרון המניה כ50 μL בהקפאה. ניתן לאחסן פתרונות מניות ב-20 ° c עד שנה אחת. לאחר הסדר, מניות סלע מעכבי ניתן לאחסן ב 4 ° c עבור 7 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לדלל את המצע תא גזע (ראה טבלה של חומרים) 1:50 במלח באגירה של Dulbecco מלוחים עם סידן ומגנזיום.</li>
	<li>מניחים את המצע מדולל תא גזע פתרון על צלחות התרבות כך הנפח הסופי לכל שטח שטח הוא 78 μL/cm2. כדי לחלוק את הבאר של 6 היטב צלחת, להוסיף 750 μL של פתרון.</li>
	<li>דגירה את הצלחת מצופה 1 h באווירה humified ב 37 ° צ' ו 5% CO2.</li>
	<li>מנושף את ציפוי המצע של תא גזע ולהוסיף 1 מ ל של hESC שיושלם עם 20 ng/mL bFGF ו 10 μM סלע מעכבי.</li>
	<li>כדי להפשיר בקבוקון של תאים האדם הקפוא iPSC, דגירה את הבקבוקון ב 37 ° צ' עד להפשיר ולהעביר את התאים לתוך 5 מדיה hESC-SFM.</li>
	<li>בתאי צנטריפוגה ב 100 x g עבור 3 דקות.</li>
	<li>השעיה מחדש ב 0.5 mL hESC-SFM בתוספת עם 20 ng/mL bFGF ו 10 μM סלע מעכבי. . העבר תאים לבאר המצופה</li>
	<li>תאי תרבות למשך 24 שעות</li>
	<li>שינוי מדיה ל hESC-SFM בתוספת 20 ng/mL bFGF, אבל בלי מעכב רוק.</li>
	<li>כדי לשמור על התאים, שנה את המדיום כל יום עד התאים להגיע 80% שליטה. מובחן iPSCs בדרך כלל לוקח 3 – 4 ימים כדי להגיע 80% שליטה.</li>
	<li>
לאחר שהתאים הגיעו 80% שליטה, תאי מעבר.
	<ol>
<li>החלפת בינוני תרבות עם 1.5 mL של hESC-SFM טרי שיושלם עם 20 ng/mL bFGF (ללא מעכב רוק).</li>
		<li>החזק את כלי התרבות ביד אחת ולגלגל את הכלי תא חד פעמי החוצה (ראה טבלת חומרים) על פני הצלחת בכיוון אחד (כלומר, משמאל לימין). . כל הלהבים ברולר בטח נוגעים בצלחת שמור על לחץ אחיד בזמן הגלגול.</li>
		<li>חזרו על הגלגול באותו כיוון עד שכל הבאר מכוסה.</li>
		<li>סובב את כלי התרבות 90 ° וחזור על הגלגול כמתואר בשלבים 1.12.2 ו-1.12.3.</li>
		<li>התעלם מכלי ההתיישנות לאחר השימוש.</li>
		<li>עם פיפטה סטרילי, השתמש במדיה. בבאר כדי להוציא מושבות שנחתכו</li>
		<li>העברת תאים ביחס 1:4 אל מצופה המצע תא גזע בארות (שלבים 1.2 – 1.5) לנפח מדיה הסופי (hESC-SFM בתוספת עם 20 ng/mL bFGF) של 1.5 mL לכל טוב.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הקפאת קו האדם
<ol><li>כדי להקפיא תאים iPSC, להחליף את המדיה של 70%-80% היטב confluent של 6 טוב צלחת עם hESC-SFM שיושלם עם 20 ng/mL bFGF ו 10 μM סלע מעכבי.</li>
	<li>דגירה היטב ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 1 h.</li>
	<li>ומניחים מושבות. בתוך צינור צנטריפוגה</li>
	<li>בתאי צנטריפוגה ב 100 x g עבור 3 דקות.</li>
	<li>מלפף את התקשורת ומשהה מחדש את התאים ב-1 mL של מדיית תא הקפאה (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>לחלק את התאים באופן שווה לשתי קריובבחנות ולמקם אותם לתוך מיכל הקפאה מקורר לתא ב 4 ° c.</li>
	<li>לאחסן תאים ב-80 ° צ' עבור 24 – 48 h.</li>
	<li>העבר מבחנות ל-135 מקפיא ° c או למיכל חנקן נוזלי.</li>
</ol>3. הבידול iPSC האדם מקרופאגים
הערה: סיכום סכימטי של הפרוטוקול המקרופאג בידול מתואר באיור 1.
<ol><li>הכנת בידול תא גורמי צמיחה ריאגנטים אחרים
	<ol>
<li>הכן את מדיית hESC-SFM (עיין בסעיף הקודם).</li>
		<li>להכין 0.1% w/v פתרון של ג'לטין חזירי ידי המסת הג לתוך מים סטריליים. ניתן לאחסן פתרון ג'לטין ב-4 ° צ' עד 2 שנים.</li>
		<li>הכנת פתרון מניות BMP4 אנושי (25 μg/mL) על ידי המסת BMP4 לתוך 4 מ"מ מימן כלוריד (HCl)-0.2% BSA הפתרון PBS. הפץ את פתרון המניה כ50 μL בהקפאה. ניתן לאחסן פתרונות מניות ב-20 ° c עד שנה אחת. ברגע הBMP4, מניות ניתן לאחסן ב 4 ° c עבור 5 ימים.</li>
		<li>הכנת פתרון מניות של האדם והוא (100 μg/mL) על-ידי המסת ה-ולאחר לפתרון של 0.2% BSA PBS. הפץ את פתרון המניה כ-10 μL בהקפאה. ניתן לאחסן פתרונות מניות ב-20 ° c עד שנה אחת. לאחר הופכה, מניות המניה יכול להיות מאוחסן ב 4 ° c עבור 7 ימים.</li>
		<li>הכנת פתרון מניות SCF אנושי (100 μg/mL) על ידי המסת SCF לתוך 0.2% BSA פתרון PBS. הפץ את פתרון המניה כ-5 μL בהקפאה. ניתן לאחסן פתרונות מניות ב-20 ° c עד שנה אחת. לאחר הופכה, מניות SCF ניתן לאחסן ב 4 ° צ' עבור 10 ימים.</li>
		<li>הכנת פתרון מניות IL3 אנושי (10 μg/mL) על ידי המסת IL3 לתוך 0.2% BSA הפתרון PBS. הפץ את פתרון המניה כ500 μL בהקפאה. ניתן לאחסן פתרונות מניות ב-20 ° c עד 2 שנים. לאחר הופכה, מניות SCF ניתן לאחסן ב 4 ° c עבור 15 ימים.</li>
		<li>הכנת פתרון מניות CSF1 אנושי (10 μg/mL) על ידי המסת CSF1 לתוך 0.2% BSA הפתרון PBS. הפץ את פתרון המניה כ-1 mL בהקפאה. ניתן לאחסן פתרונות מניות ב-20 ° c עד 2 שנים. לאחר הופכה, מניות SCF ניתן לאחסן ב 4 ° c עבור 15 ימים.</li>
		<li>להכין בנפרד 10 μg/mL פתרונות מניות של אינטרפרון-גמא (ifng), אינטרלויקין 4 (IL4), ו אינטרלויקין 10 (IL10) על ידי המסת לתוך 0.2% bsa פתרונות PBS. להכין ליפופוליסכד (LPS) לפתרון מניות של (100 U/mL) על ידי המסת לתוך 0.2% BSA הפתרון PBS. הפץ כל פתרון מניות כ35 μL. חנות ב-80 ° c עד 2 שנים. לאחר הפשפה, ניתן לאחסן את המניות ב -4 ° c במשך 7 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>שלב 1: הדור של הגופים הembryoid (יום 0 – יום 3)
	<ol>
<li>ביום 0, להוסיף 2.25 mL של מדיה שלב 1 (hesc-sfm שיושלם עם 50 ng/ml BMP4, 50 ng/ml, ו 20 ng/ml scf) לשתי בארות של קובץ מצורף וזמן 6 טוב צלחת.</li>
		<li>החלף את מדיית התחזוקה של 1 80% שוטפת היטב של iPSCs בצלחת 6 עם 1.5 mL של מדיה בשלב 1.</li>
		<li>גזור מושבות באמצעות כלי העברת התא ולהעביר מושבות לחתוך עם פיפטה לתוך שתי בארות של קובץ מצורף וזמן 6 טוב צלחת (ראה שולחן חומרים).</li>
		<li>ביום 2, להביא ציטוקינים לריכוז הסופי של 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL, ו 20 ng/mL SCF באמצעות 0.5 mL של המדיה hESC-SFM. הערה: מושבות IPSC יהיו בס (איור 2 א).</li>
	</ol></li>
	<li>שלב 2: הופעתה של תאים המטפאות בהשעיה
	<ol>
<li>ביום 4, מעיל 4 בארות של 6 היטב התרבות רקמה צלחת עם 0.1% w/v ג'לטין ו דגירה עבור לפחות 10 דקות.</li>
		<li>להסיר ג'לטין ולהוסיף 2.5 mL של מדיה בשלב 2 (X-VIVO15 בתוספת 100 ng/mL CSF1, 25 ng/mL IL-3, 2 מ"מ גלוטמקס, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ו 0.055 mM 2-mercaptoethanol).</li>
		<li>לאסוף הקימו בס לתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL ולאפשר להם להתיישב בתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה. . מתחת בזהירות את התקשורת</li>
		<li>להשעות את הבס ב 2 מ ל של מדיה ברמה 2.</li>
		<li>העברה 10 – 15 בס (לא יותר מ 15) כדי מצופה ג'לטין היטב המכיל 2.5 mL של מדיה שלב 2.</li>
		<li>מודטה בס ב 37 ° c ו 5% CO2 אוויר.</li>
		<li>שינוי מדיה בג מצופה כל 3 – 4 ימים עבור 2-3 שבועות.</li>
		<li>לאחר 2 – 3 שבועות, בס להתחיל לשחרר תאים מהמטפאות לא חסיד להשעיה. הערה: תקופה זו של שחרור התא ההשעיה יכולה להשתנות והיא תלויה בקו התאים. תאים בהשעיה זו ניתן לקצור והתבגר לתוך מקרופאגים (ראה שלב 3) (איור 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>שלב 3: מסוף מקרופאג התבגרות
	<ol>
<li>לאסוף תאים המטפאות ההשעיה ולחדש את התקשורת (שלב 2 מדיה) על לוחית EB.</li>
		<li>השעיית התאים צנטריפוגה ב 200 x g עבור 3 דקות.</li>
		<li>השהה מחדש את התאים ההשעיה בשלב 3 מדיה (X-VIVO15 שיושלם עם 100 ng/mL CSF1, 2 מ"מ גלוטמקס, ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין).</li>
		<li>לוחית שנאסף ומסובב תאים על פלסטיק מטופל 10 ס מ בקטיולוגי כיתה לוחות (10 מ"ל) או נייר לא צופה 6 היטב התרבות רקמה לוחות (3 מ ל) בצפיפות של 0.2 x 106 תאים/ml.</li>
		<li>לשמור על תאים בשלב 3 מדיה עבור 9-11 ימים, החלפת מדיה כל 5 ימים. הערה: צעדים 3.4.1 – 3.4.5 משלב 3 ניתן לחזור על כל 3 – 4 ימים תאים ההשעיה שנקטפו מלוחית EB המקורי עד 3 חודשים.</li>
	</ol></li>
	<li>פולריזציה מקרופאג
	<ol>
<li>כדי להפעיל מקרופאגים ל M (LPS + IFNg) פנוטיפ, לגרות את התאים עם LPS (ריכוז סופי: 100 ng/mL) ו-IFNg (הריכוז הסופי: 10 U/mL) עבור 48 h. כדי להפעיל תאים ל-M (IL4) פניטיפ, לגרות תאים עם IL4 (ריכוז סופי: 20 ng/mL). כדי להפעיל M (IL10) פניטיפ, לעורר מקרופאגים עם IL10 (ריכוז סופי: 5 ng/mL).</li>
	</ol></li>
</ol>4. iPSC-הנגזרים מקרופאגים בקרת איכות
<ol><li>לקבוע את מספר תאים ההשעיה המטבית המיוצר לכל 6 צלחת הטוב של בס על ידי ספירת אותם עם המטציטוטומטר.</li>
	<li>הערכת מקרופאג מורפולוגיה כפי שתוארה בעבר (למשל, ערכה מסחרית כתמים)8,9.</li>
	<li>
לזהות את הביטוי של סמנים מסוימים מקרופאג וסמנים פולריזציה באמצעות ביטוי גנטי ניתוחים והזרמת cy try כפי שתוארה בעבר8,9.
	<ol>
<li>עבור הזרמת הניסויים cy, על אחד היטב של 6 צלחת באר של מקרופאגים, בתאי הקציר על ידי מתכלה מדיה ההבשלה שלהם, לשטוף עם 2 מ ל של PBS, ו דגירה אותם עם 2 מ ל של מאגר הדיסוציאציה של האנזים החופשי של האנזימים עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). פיפטה למעלה ולמטה שוב ושוב. כדי להתנתק ולקצור מקרופאגים</li>
		<li>לספור תאים עם המטציטוטומטר ולהשעות אותם מחדש ב-80 μL של 2% BSA, 0.5 מ"מ ביותר מ-PBS (EDTA).</li>
		<li>הוסף 20 μL של חוסם F-C האנושי של מקינטוש.</li>
		<li>דגירה על קרח 20 דקות ולהגן מפני אור.</li>
		<li>הוסף נפח מתאים של 2% BSA, 0.5 mM EDTA PBS הפתרון כדי להביא את הריכוז התא 1 x 106 מקרופאגים/mL.</li>
		<li>כתם 1 x 105 תאים 100 μl של 2% bsa, 0.5 MM EDTA PBS הפתרון עם הנוגדן המקביל (ראה הערה להלן) ו דגירה עבור 15 דקות ב-RT מוגן מפני אור.</li>
		<li>שטוף 1x עם לפחות 100 μL של 2% BSA, 0.5 mM EDTA PBS.</li>
		<li>השהה מחדש את התאים ב-200 μL של 2% BSA, 0.5 mM EDTA PBS.</li>
		<li>להוסיף 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI, מדולל 1:1000) כצבע חי מת. דגירה 3 דקות</li>
		<li>לזרימת הניתוח cy, השער על האוכלוסייה הראשית, ואז תאים בודדים, ולאחר מכן תאים חיים. באוכלוסיית התאים החיים, ביטוי הסמן הקשור למקרופאג ניכר (איור 3A). הערה: יש לגזור בזהירות נוגדנים עבור כל קו תא המשמש להפקת מקרופאגים. נוגדנים המוצגים בסעיף התוצאות נמצאים בטבלת חומרים. מקדם הדילול של SFCi55-נגזר מקרופאגים לזרימה cy try בחני הוא כלול גם.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. שיטת תפוקה גבוהה של פגולציטוזה
<ol><li>הקציר iPSC-נגזר מקרופאגים (iPSC-DMs) על ידי שפתי התקשורת, הוספת קרח קר אנזים מאגר דיסוציאציה חינם תא, ו הדגירה עבור 5 דקות. לאסוף מקרופאגים על ידי ליטוף שוב ושוב.</li>
	<li>צלחת 8 x 104 ipsc-dms בבאר של תרבות רקמת הדמיה כיתה 96 לוחות היטב (למשל, Cellcarrier אולטרה, Perkin אלמר) לפחות 2 ימים לפני הדמיה תפוקה גבוהה ב 200 μl של שלב 3 מדיה.</li>
	<li>הכינו את הפלודוםגרין זימוססן-מאמרים על ידי השעיית בקבוקון אחד 2 מ ל של PBS ("פתרון 1"). . פתרון מערבולת ל -10 ס מ</li>
	<li>לדלל את 2 מ ל של ההשעיה חרוז PBS 1:5 עם יותר PBS ("פתרון 2").</li>
	<li>Sonicate פתרון 2 עבור הפתרון 8 s ומערבולת עבור 10 s. שמור את זה ב 4 ° c. פתרון זה ישמש בשלב 5.11.</li>
	<li>הסר את המדיה על iPSC-DMs מצופה ולשטוף עם PBS.</li>
	<li>הכתם iPSC-DMs עם פתרון PBS המכיל Hoechst 33342 מדולל 1:20. דגירה של 20 דקות ב 37 ° c.</li>
	<li>שטוף תאים עם PBS.</li>
	<li>כתם עם פתרון PBS המכיל כתמים אדום עמוק קרום פלזמה מדולל 1:1000 (ראה טבלת חומרים). דגירה של 30 דקות ב 37 ° c.</li>
	<li>שטוף תאים עם PBS.</li>
	<li>הוסף 100 μL של הפתרון חרוז נשמר ב 4 ° c לכל טוב של iPSC-DMs. . הצלחות מוכנות כעת להדמיה</li>
	<li>צלם את הצלחת באמצעות מערכת הדמיה של תוכן גבוה לרכוש שלושה או יותר שדות ברחבי הבאר כדי לקבל ייצוג טוב של הבאר.</li>
	<li>
מכמת באמצעות תוכנת קולומבוס (תוכנת מערכת לניתוח הדמיה בעלת תוכן גבוה). אלגוריתם מסוים ניתן לפתח עבור ניתוח תמונה חד משמעית אצווה:
	<ol>
<li>מדידת עוצמה כחולה ולהגדיר בתוכנה כי אות כחול מציין את גרעין.</li>
		<li>למדוד את העוצמה האדומה ולהגדיר בתוכנה כי אות אדום מציין את הציטופלסמה.</li>
		<li>הגדר כי הגרעין והציטופלסמה יחד תואמים לתא.</li>
		<li>למדוד את העוצמה הירוקה בתאים וליצור מחמירה לגזור/הסף ערך לשקול תא כמו phagocytic.</li>
		<li>מכמת את שבר התאים phagocytic ואת המדד phagocytic הממוצע לתא. מכיוון שעוצמת הצבע של חרוז היא פרופורציונלית למספר החרוזים, פעילות phagocytic ניתן למדוד על ידי מספר חרוזים לבלוע.</li>
		<li>להחיל את האלגוריתם/צינור על כל התמונות בתוך כל השדה בכל הזמן-נקודות רכשה, ומאפשר גישה אצווה חזקה ומשוחדת כדי לקבוע את היכולות phagocytic של תאים. הערה: קולומבוס היא תוכנה גבוהה לניתוח תוכן, המציעה ניתוח פילוח של תאים עבור הפנוטיפים לתא ובדיקות פונקציונליות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).</li>
<li>Focosi, D., Amabile, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Red+Blood+Cells+and+Platelet+Concentrates%3A+From+Bench+to+Bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Red Blood Cells and Platelet Concentrates: From Bench to Bedside.</a> Cells. 7 (1), (2017).</li>
<li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPS+cells%3A+A+game+changer+for+future+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">IPS cells: A game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li>
<li>Lachmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Hematopoietic+Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Provides+Granulocytes+or+Macrophages+for+Cell+Replacement+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Hematopoietic Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Provides Granulocytes or Macrophages for Cell Replacement Therapies.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 282-296 (2015).</li>
<li>Kuhn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN-mediated+functional+correction+of+human+iPSC-derived+macrophages+in+context+of+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">TALEN-mediated functional correction of human iPSC-derived macrophages in context of hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).</li>
<li>Ackermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Generation+of+Genetically+Modified+Macrophages+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+Medicine+and+Hemotherapy%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Generation of Genetically Modified Macrophages from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 44 (3), 135-142 (2017).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+iPSC+line+capable+of+differentiating+into+functional+macrophages+expressing+ZsGreen%3A+A+tool+for+the+study+and+in+vivo+tracking+of+therapeutic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), (2018).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+programming+of+macrophages+generates+an+in+vitro+model+for+the+human+erythroid+island+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic programming of macrophages generates an in vitro model for the human erythroid island niche.</a> Nature Communications. 10 (1), 881(2019).</li>
<li>Cassetta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Tumor-Associated+Macrophage+and+Monocyte+Transcriptional+Landscapes+Reveal+Cancer-Specific+Reprogramming%2C+Biomarkers%2C+and+Therapeutic+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Human Tumor-Associated Macrophage and Monocyte Transcriptional Landscapes Reveal Cancer-Specific Reprogramming, Biomarkers, and Therapeutic Targets.</a> Cancer Cell. 35 (4), 588-602 (2019).</li>
<li>Haideri, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+embryonic+stem+cell+derived+macrophages+ameliorates+fibrosis+in+a+murine+model+of+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Injection of embryonic stem cell derived macrophages ameliorates fibrosis in a murine model of liver injury.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 1-10 (2017).</li>
<li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), 71098(2013).</li>
<li>Pandya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+and+murine+induced+pluripotent+stem+cells+to+microglia-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).</li>
<li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Microglia.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).</li>
<li>Heideveld, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+macrophage+differentiation+and+in+vitro+generation+of+human+tumor+associated-like+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods for macrophage differentiation and in vitro generation of human tumor associated-like macrophages.</a> Methods in Enzymology. , 1-18 (2019).</li>
<li>Leary, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+between+interleukin-6+and+interleukin-3+in+supporting+proliferation+of+human+hematopoietic+stem+cells%3A+comparison+with+interleukin-1+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Synergism between interleukin-6 and interleukin-3 in supporting proliferation of human hematopoietic stem cells: comparison with interleukin-1 alpha.</a> Blood. 71 (6), 1759-1763 (1988).</li>
<li>Robin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unexpected+Role+for+IL-3+in+the+Embryonic+Development+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">An Unexpected Role for IL-3 in the Embryonic Development of Hematopoietic Stem Cells.</a> Developmental Cell. 11 (2), 171-180 (2006).</li>
<li>Moldenhauer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cells+and+interleukin-stimulated+endothelium%3A+Expansion+and+differentiation+of+myeloid+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cells and interleukin-stimulated endothelium: Expansion and differentiation of myeloid precursors.</a> BMC Immunology. 9, 56(2008).</li>
<li>Kodama, H., Nose, M., Shumpei Niida, S., Yarnasakit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+Role+of+Macrophage+Colony-Stimulating+Factor+in+the+Osteoclast+Differentiation+Supported+by+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Definitive+Report%22%5BJournal%5D)">Essential Role of Macrophage Colony-Stimulating Factor in the Osteoclast Differentiation Supported by Stromal Cells.</a> Brief Definitive Report. , 1291-1294 (1991).</li>
<li>Bender, A. T., Ostenson, C. L., Giordano, D., Beavo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+monocytes+in+vitro+with+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+and+macrophage+colony-stimulating+factor+produces+distinct+changes+in+cGMP+phosphodiesterase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human monocytes in vitro with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and macrophage colony-stimulating factor produces distinct changes in cGMP phosphodiesterase expression.</a> Cellular Signalling. 16 (3), 365-374 (2004).</li>
<li>Klimchenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytic+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+fetal+liver+share+common+differentiation+pathways+and+homeostatic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Monocytic cells derived from human embryonic stem cells and fetal liver share common differentiation pathways and homeostatic functions.</a> Blood. 117 (11), 3065-3075 (2011).</li>
<li>Alasoo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+macrophages+derived+from+monocytes+and+iPS+cells+identifies+a+conserved+response+to+LPS+and+novel+alternative+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of macrophages derived from monocytes and iPS cells identifies a conserved response to LPS and novel alternative transcription.</a> Scientific Reports. , August 1-15 (2015).</li>
<li>Buchrieser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Macrophages+Share+Ontogeny+with+MYB-Independent+Tissue-Resident+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Macrophages Share Ontogeny with MYB-Independent Tissue-Resident Macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li>
<li>Vanhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+human+embryonic+stem+cell+hematopoiesis+mimics+MYB-independent+yolk+sac+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">In vitro human embryonic stem cell hematopoiesis mimics MYB-independent yolk sac hematopoiesis.</a> Haematologica. 100 (2), 157-166 (2015).</li>
<li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-Derived+Human+Microglia-like+Cells+to+Study+Neurological+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">iPSC-Derived Human Microglia-like Cells to Study Neurological Diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li>
<li>Yang, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+KLF1+Enhances+the+Differentiation+and+Maturation+of+Red+Blood+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activation of KLF1 Enhances the Differentiation and Maturation of Red Blood Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).</li>
<li>Karavitis, J., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+phagocytosis%3A+effects+of+environmental+pollutants%2C+alcohol%2C+cigarette+smoke%2C+and+other+external+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage phagocytosis: effects of environmental pollutants, alcohol, cigarette smoke, and other external factors.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (6), 1065-1078 (2011).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Activation+and+Polarization%3A+Nomenclature+and+Experimental+Guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage Activation and Polarization: Nomenclature and Experimental Guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+Functional+Comparison+of+Monocytes+and+Macrophages+from+hiPSCs+with+Peripheral+Blood+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages from hiPSCs with Peripheral Blood Derivatives.</a> Stem Cell Reports. 12, 1282-1297 (2019).</li>
</ol>

למחברים אין קונפליקטים של עניין להצהיר עליהם.

הפרוטוקול עבור הדור של iPSC-DMs תיאר כאן הוא חזק ומאפשר ייצור של מספר רב של תאים אחידים ממספר קטן יחסית של iPSCs. בעקבות הבידול הראשוני של כ 1 x 106 iPSCs, התרבויות הבאות ניתן לקצור כל 4 ימים עד 2 – 3 חודשים, וכתוצאה מכך ייצור של לפחות 6.5 x 107 מקרופאגים באותו זמן. אלה מקרופאגים אנושיים שנוצר על-ידי האדם הם מורפולוגית דומה מקרופאגים האדם העיקרי, לבטא את המפתח מקרופאג תא סמנים השטח, ופעילות התערוכה phagocytic. הפרוטוקול לבידול מקרופאג הוא הניתן ליישום והוא יכול להיות מיושם על קווי הטלפון האחרים התקן היתר, אבל את העיתוי המדויק של הקציר הראשון של מקרופאג בשרי ואת המספרים המוחלט של תאים שניתן ליצור משתנה בין הקווים ipsc.
זה הוכח כי מקרופאגים יכולים להיווצר מ iPSCs כי כבר מניפולציות גנטית. לדוגמה, קלטת טרנסגנטית המורכבת של כתב פלורסנט ZsGreen תחת השליטה של מיזם הקאג הקונסטיטוטיבי הוכנס לתוך AAVS1 לוקוס של הקו SFCi55 ipsc, ולאחר מכן הוכח כי קו ipsc זה יכול להיות הבדיל לתוך מקרופאגים zsgreen-המבטא8. אלה מקרופאגים פלורסנט יכול לשמש בעתיד לעקוב אחר הגירה ויציבות של מקרופאגים טיפוליים במודלים של מחלות. במחקר אחר, מקרופאגים נוצרו מתוך קו iPSC כי היה מניפולציות גנטית כדי לבטא את הגורם המושרה טמוקסיפן, KLF1. ההפעלה של KLF1 ב-iPSC-נגזר מקרופאגים הביא לייצור של מקרופאגים עם פנוטיפ הדומה מקרופאגים של האי אריתרופוייד9. פוטנציאלית, אסטרטגיה זו יכולה לשמש לתוכנית גנטית מקרופאגים iPSC-נגזר לתוך פנוטיפים הקשורים לאוכלוסיות אחרות מקרופאג ספציפיות רקמות כגון תאים קופפר של הכבד או תאים Langerhans של העור. זה אפשרי לאחר שעתוק מפתח גורמים המגדירים סוגי תאים אלה מזוהים.
מבחינת הפרוטוקול, חשוב מאוד לציין כי המצב של האוכלוסייה ההתחלתית של iPSCs הוא קריטי לבידול מוצלח. תרבויות iPSC האדם יכול להיות מוצף עם האוכלוסייה karyotypically דרך כלל חריגים על מספר מעברים, כל כך חזק היווצרות של iPSC מניות ו אצווה גדולה מניות מאסטר נתון בקרת איכות הגנום מומלץ. בידינו, פרוטוקולי תחזוקה המתוארים כאן יכול לשמור על karyotypically נורמלי למשך עד 2 חודשים בתרבות רציפה, אבל זה עשוי להשתנות עבור קווי תאים שונים במעבדות שונות. אם נתקלים בבעיות, מומלץ להשתמש במבחנה טרייה של מובחן iPSCs עבור כל ניסוי בידול. בנוסף, התרבות ההתחלתית של מובחן iPSCs צריך להיות לא יותר מ 80% confluent. בשלב הציפוי EB, רק 10 – 15 בס צריך להיות מצופה לכל טוב של 6 היטב האמנות הרקמה לוחית, וזה קריטי כי בס אלה מפוזרים באופן שווה על פני הבאר. מספר גבוה יותר של בס ו/או הליפינג של בס במרכז הבאר יש השפעה שלילית על מספר מקרופאגים שנוצרו. הטיפול צריך להילקח כאשר מחייב מדיה לקצור את התאים מונוציט כמו ההשעיה מתוך התרבויות EB כדי למנוע הפרעה הדבקה של בס על פני השטח של צלחות התרבות מצופה. מספר התאים ההשעיה מופק בהדרגה עם כל קציר, עם הייצור האופטימלי בין ימים 40 – 72 של בידול (איור 2). הייצור בהדרגה ירידות אחרי יום 68 וצלחות נוטים להתיש לאחר 2.5 חודשים, למרות העיתוי מדויק יכול להשתנות בהתאם לקו iPSC.
אחד המגבלה של הפרוטוקול שלנו הוא שזה לא היה אפשרי לקריואת התאים ההשעיה המטבית שנוצר בסוף שלב 2. פרוטוקולים המסתמכים על ההפעלה האקסוסוגני של הדוח WNT על 40% שחזור שיעור לאחר הקפאת ההזמנה, אבל פרוטוקולים אלה מדווחים רק אחד התא הקציר, כך המספר המוחלט של מקרופאגים שנוצר הוא נמוך30. הפרוטוקול המתואר כאן, גרימת האיתות אנדוגניים דרך היווצרות של בס, ניתן לקצור biweekly, הפקת תשואה הכוללת הרבה יותר מקרופאג.
לסיכום, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לייצור של מקרופאגים פונקציונליים iPSC-נגזר. הקמת ניסויים מחוץ גופית עם מקרופאגים הנגזרים iPSC ללמוד מקרופאג ביולוגיה בריאות ומחלות יש יתרונות רבים על ניסויים עם מונופאגים הנגזר (MDMs). יתרונות אלה כוללים את קלות הנגישות לחומר (למשל, אין צורך בתורמים), כמויות גדולות מאוד של מקרופאגים ניתן לייצר, וזה אפשרי יחסית פשוט לייצר מקרופאגים ששונו גנטית. יתר על כן, מקרופאגים הנגזר iPSC יכול להיות משאב טוב יותר לחקר מקרופאג ביולוגיה תושבת הרקמה.

תאי גזע עובריים (ESCs) והמושרה תאים גזע pluriפוטנטי (iPSCs) מייצגים מקור התאים העצמית לחידוש זה יכול להיות הבדיל לייצר תאים של כל שלושת שכבת הנבט שכבה. טכנולוגיות המאפשרות מניפולציה גנטית של תאי גזע האדם pluriפוטנטי (PSCs), כגון nuclease אצבע אבץ, talens, ו crispr-Cas9, יש מהפכה מחקר רפואי1,2,3,4. מניפולציה גנטית של PSCs אנושי היא אסטרטגיה אטרקטיבית במיוחד כאשר התא העיקרי של הריבית קשה להרחיב ו/או לשמור על מבחנה, או קשה לטפל גנטית, כגון המקרה של מקרופאגים5,6,7,8,9. כמו iPSCs אנושי יכול להיות נגזר כל תא הסומטיים, הם לעקוף את המגבלות האתיות הקשורות ESCs, ולספק אסטרטגיה לאספקת תרופות אישית. זה כולל דגמי מחלות ספציפיות למטופל, בדיקות סמים וטיפול בתאים עצמיים עם סיכון מופחת של דחייה וזיהום החיסון6,8,10,11.
פרוטוקולים המתארים את הדור של מקרופאגים מ iPSCs מורכב מתהליך של שלושה שלבים הכולל: 1) הדור של embryoid גופים; 2) הופעתה של תאים המטפאות בהשעיה; 3) מסוף מקרופאג התבגרות.
היווצרות של אגרגטים תלת ממדיים, המכונה גופים embryoid (בס) יוזם הבידול של iPSCs. העצם מורורגנטית חלבון (BMP4), תא גזע הגורם (scf), ואת כלי הדם גורם אנדותל (מרכיב) מוסיפים לכונן מפרט מזועור ולתמוך בתאי המטפאות המתעוררים7,8,9,11,12. התאים המבדילים בתוך הבס גם ליזום הפעלה של מסלולים האיתות אנדוגניים כגון Wnt ו-פעילות. חלק מפרוטוקולי הבידול אינם עוברים בשלב היווצרות EB. במקרים אלה, wnt ופעילות הרגולטורים האיתות, כגון רקומביננטי האדם ו/או כיירון מתווספים iPSCs ההבחנה בפורמט דופלקס13,14,15. כאן, אנו מתמקדים בפרוטוקול המשתמש במבנה EB. בשלב השני של הבידול, מצופה בס על משטח חסיד. אלה תאים מחוברים נחשפים לציטוקינים המקדמים את הופעתה של תאים ההשעיה הכוללים המטפאות ו מיאלואידית ושלתי. אלה בתנאים של תרבות חוץ גופית, interleukin-3 (IL3) כנראה תומך היווצרות המטפאות גזע ומחולל התפשטות16,17, כמו גם התפשטות מיאלואידית מיאלואידים ובידול18. מקרופאג המושבה גורם מגרה (CSF1) תומך בייצור של תאים מיאלואידים והבידול שלהם למקפאגים19,20. בשלב השלישי של בידול, אלה תאים ההשעיה הם מתורבתים בנוכחות CSF1 לתמוך מסוף מקרופאג ההבשלה.
הבידול של האדם iPSCs לתוך מקרופאגים בחוץ גופית מחקה את הגל המוקדם של הפקה מקרופאג במהלך הפיתוח. רקמות תושב מקרופאגים מבוססים במהלך embryogenesis ויש להם שושלת התפתחותית ברורה של מונוציטים מבוגרים. מספר מחקרים הראו כי iPSC-DMs יש חתימת גן כי הוא דומה יותר העובר הכבד העוברי מקרופאגים מאשר דם נגזר מונוציטים, הרומז כי iPSC-DMs הם יותר דומה לרקמות תושב מקרופאגים. ipsc-dms express רמות גבוהות יותר של גנים הקידוד עבור הפרשה של חלבונים המעורבים שיפוץ רקמות ואנגיוגנזה ו לבטא רמות נמוכות יותר של גנים קידוד עבור הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתית ופעילויות מצגת אנטיגן21,22. בנוסף, ipsc-dms יש דרישה מקדם שעתוק זה של הרקמה תושב מקרופאגים23,24. באמצעות שורות תא הסתרה iPSC כי הם חסרים גורמי תמלול RUNX1, SPI1 (פו .1), ו MYB, בוכאסר ואח ' הראה כי הדור של iPSC-DMs הוא SPI1 ו RUNX1 תלוי, אבל MYB עצמאי. זה מצביע על כך שהם מבחינה מבצעית דומה מקרופאגים שמקורם בחלמון-סאק שנוצרים במהלך הגל הראשון של המטפיאה במהלך הפיתוח23. לכן, הוא מקובל כי ipsc-dms מייצגים מודל תא מתאים יותר כדי ללמוד מקרופאגים שוכני רקמות כגון מיקרוגלייה14,25 ותאים קופפר11, ומקור רצוי יותר של תאים שעלולים לשמש טיפולים כדי לתקן רקמות. לדוגמה, זה כבר הוכח כי מקרופאגים המיוצרים בתוך מבחנה מ העכבר escs היו יעילים קידוחים פיברוזיס במודל CCl4 המושרה פציעה בכבד vivo11. יתר על כן, אלה מקרופאגים שנגזרו ESC היו יעילים יותר מאשר מח עצם הנגזר מקרופאגים באכלוס מחדש של תאי תא מקופל לרוקן מקרופאגים באמצעות ליפוזומיום clodronate11 בעכברים.
כאן, אנו מתארים סרום, ו-ללא מאכיל הפרוטוקולים עבור תחזוקה, הקפאת, ולהפוך את iPSCs אנושי, ועל הבידול של אלה iPSCs לתוך מקרופאגים פונקציונליים. פרוטוקול זה דומה מאוד לזה שמתואר על ידי ואן וילגנבורג ואח '12, עם שינויים משניים כולל: 1) מדיה בתחזוקת ipsc; 2) מעכבי סלע אינו בשימוש בשלב היווצרות EB; 3) גישה מכנית, במקום גישה אנזימטית, משמשת להפקת בס אחיד ממושבות iPSC; 4) השיטה לקציר וציפוי EB שונה; 5) התאים ההשעיה נקצרו 2x בשבוע, במקום שבועי; ו 6) תאי ההשעיה שנקטפו הם בעלי תרבות תחת CSF1 עבור התבגרות מקרופאג עבור 9 ימים ולא 7 ימים. כמו כן, אנו מתארים פרוטוקולים המשמשים לאפיון iPSC נגזר מקרופאג פניטיפים ותפקוד, כולל ניתוחים עבור ביטוי גנים (רביעיית-PCR), משטח התא ביטוי סמן (הזרימה cy, ולאחר) פונקציונלי להעריך phagocyציטוזה ו polarization.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol (50 מ"מ)</td> <td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Abtibody CD64-APC -CY7</td><td>Biolegend</td><td></td><td>305026 גורם דילול: 1:100</td></tr><tr><td>נוגדן 25F9-EFLUOR 660</td><td>Ebioscience</td><td>15599866</td><td>גורם דילול: 1:20</td></tr><tr><td>נוגדן CCR2-PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>357212</td><td>גורם דילול: 1:100</td></tr><tr><td>נוגדן CCR5 PE</td><td>Biolegend Biolegend</td><td></td><td>גורם דילול 313707: 1:100</td></tr><tr>גורם דילול<td>נוגדן CCR8 PE</td><td>Biolegend</td><td>360603</td><td>: 1:100</td></tr><tr>גורם דילול<td>301305 נוגדן CD11b-PE</td><td>Biolegend</td><td></td>: <td>1:50</td></tr><tr>גורם דילול<td>10669167 נוגדן CD14-APC</td><td>Ebioscience</td><td></td><td>: 1:20 גורם דילול</td></tr><tr><td>נוגדן CD163-PE-CY7</td><td>BIolegend</td><td>333614</td><td>גורם דילול: 1:25</td></tr><tr><td>גורם דילול נוגדן CD169-APC</td><td>Biolegend</td><td>346007</td>: <td>1:25</td></tr><tr>גורם דילול<td>321106 נוגדן CD206-PE</td><td>Biolegend</td><td></td>: <td>1:100</td></tr><tr>גורם דילול<td>נוגדן CD209-PE-CY7</td><td>Biolegend</td><td>3310114</td><td>גורם דילול: 1:100</td></tr><tr>גורם דילול<td>329718 נוגדן CD274-PE-CY7</td><td>Biolegend</td>: <td></td><td>1:100</td></tr><tr><td>נוגדן CD43-PE</td><td>Ebioscience</td><td>10854419</td><td>גורם דילול: 1:100</td></tr><tr><td>נוגדן CD45-APC</td><td>Ebioscience</td><td></td><td>15577936 גורם דילול: 1:20</td></tr><tr><td>נוגדן CD86-APC</td><td>גורם</td><td>דילול 305412 נוגדן: 1:100</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן CD93-PE</td><td>Ebioscience</td><td></td><td>10804637 גורם דילול: 1:100</td></tr><tr><td>נוגדן CX3CR1-PE</td><td>Biolegend</td><td>307650</td><td>גורם דילול: 1:100</td></tr><tr><td>נוגדן HLA-DR-BV650</td><td>Biolegend</td><td>307650</td><td>גורם דילול: 1:100</td></tr><tr><td>Antiboy CD115-PE</td><td>Biolegend</td><td>347308</td><td>גורם דילול: 1:40</td></tr><tr><td>מאגר דיסוציאציה של תאים, ללא אנזימים</td><td>Thermofisher</td><td>13151014</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Buffer, ללא אנזימים, PBS</td><td>Gibco</td><td>13151014</td><td></td></tr><tr><td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, תרבית רקמות מטופלת, שחור, 96 בארות</td><td>PerkinElmer</td><td>6055302</td><td></td></tr><tr><td>CellMask כתם קרום פלזמה אדום עמוק</td><td>Thermofisher</td><td>C10046</td><td>מדיה לשימור הקפאה</td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Sigma</td><td>C2874</td><td></td></tr><tr><td>CTS CELLstart מצע</td><td>Invitrogen</td><td>A1014201</td><td>מצע תאי גזע</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542-1MG</td><td>ריכוז סופי 1 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>DPBS, סידן, מגנזיום (500 מ"ל)</td><td>Thermofisher</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>FcR מגיב חוסם, MACS אנושי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 10-155) חלבון אנושי רקומביננטי</td><td>Thermofisher</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX</td><td>Thermofisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant IFNY</td><td>Thermofisher</td><td>14-8319-80</td><td></td></tr><tr><td>סרום אנושי אלבומינום</td><td>אירווין סיינטיפיק</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>ליפופוליסכריד (LPS) מבית E. Coli</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue (Hoechst33342)</td> <td>Thermofisher</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Green Zymosan Bioparticles מצומדים לפגוציטוזיס</td><td>Thermofisher</td><td>P35365</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין עור חזיר</td><td>סיגמא</td><td>G9136</td><td></td></tr><tr><td>חלבון BMP4 אנושי רקומביננטי</td> R<td>& D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL10</td><td>Preprotech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL3</td><td>Preprotech</td><td>200-03-10</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL4</td><td>Preprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי MCSF (ללא נשא) 100 &mu; g</td><td>Biolegend</td><td>574806</td><td></td></tr><tr><td>חלבון VEGF אנושי רקומביננטי</td> R<td>& D</td><td>293-VE-010</td><td></td></tr><tr><td>מעכב רוק Y-27632</td><td>Merck</td><td>SCM075</td><td></td></tr><tr><td>SCF (C-Kit Ligand) חלבון אנושי רקומביננטי</td><td>Thermofisher</td><td>PHC2111</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Thermofisher</td><td>A1000701</td><td></td></tr><tr><td>StemPro EZPassage כלי מעבר חד פעמי של תאי גזע</td><td>Thermofisher</td><td>23181010</td><td></td></tr><tr><td>לוחות חיבור נמוכים במיוחד: צלחת מרובת בארות תרבית תאים, 6 בארות, משטח דוחה תא כוכב</td><td>תא Greiner</td><td>657970</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 15 בקבוק 500 מ"ל</td><td>Lonza</td><td>BE02-060F</td><td></td></tr></tbody></table>

הפקה ואפיון של מקרופאגים האדם מ pluripotent תאי גזע

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

המקרופאגים נמצאים ברוב רקמות בעלי החוליות ומהווים אוכלוסיות תאים מפוזרת והטרוגנית באופן נרחב עם פונקציות שונות. הם שחקני מפתח בריאות ומחלות, מתנהג כמו phagocytes במהלך ההגנה החיסונית ו תיווך הזנה, תחזוקה, ופונקציות תיקון. למרות שניתן היה ללמוד חלק מהתהליכים המולקולריים המעורבים בפונקציה מקרופאג האנושית, זה הוכיח קשה להחיל טכניקות הנדסה גנטית לקרופאגים אנושיים הראשי. זה הקשה באופן משמעותי את היכולת שלנו לחקור את המסלולים הגנטיים המורכבים המעורבים בביולוגיה מקרופאג וליצור מודלים עבור מצבי מחלה ספציפיים. מקור מחוץ למדף של מקרופאגים אנושיים כי הוא נוטה לארסנל המכריע של טכניקות מניפולציה גנטית היה, ולכן, לספק כלי רב ערך בתחום זה. אנו מציגים פרוטוקול ממוטב המאפשר את הדור של מקרופאגים מן האדם בתאי גזע pluriפוטנטי (iPSCs) ב מבחנה. אלה מקרופאגים iPSC-נגזר (iPSC-DMs) אקספרס האדם מקרופאג תא סמנים, כולל CD45, 25F9, CD163, ו CD169, ואת החיים שלנו לחיות הדמיה שיטת ההדמיה ממחיש כי הם מציגים פעילות phagocytic חזק. מתורבת iPSC-DMs יכול להיות מופעל שונים מקרופאג מדינות כי להציג ביטוי גנים שונה ופעילות phagocytic על ידי תוספת של LPS ו-IFNg, IL4, או IL10. כך, מערכת זו מספקת פלטפורמה ליצור מקרופאגים אנושיים הנושאים שינויים גנטיים כי מודל מחלת האדם הספציפי ואת מקור של תאים עבור סינון סמים או טיפול בתאים לטיפול במחלות אלה.

התקדמות בידול, מספר מקרופאג ומורפולוגיה התוצאות המוצגות הן מן הבידול של קו ipsc האנושי SFCi55 שתואר ושימש במספר מחקרים8,9,10,26. תהליך של בידול IPSC לתוך מקרופאגים יכול להיות מפוקח על ידי מיקרוסקופ אופטי. מושבות iPSC, גופים embryoid (בס), תאים ההשעיה המטבית, ו מקרופאגים בוגרים היו ברורים מורפולוגית (איור 2A). בוגרת מקרופאג מורפולוגיה יכול להיות מאומת יותר על ידי כתמים של ההכנות centrifuged ציטוספין. מקרופאגים שנגזרו על-ידי IPSC היו גדולים, והיה לו גרעין קטן בצורת אליפסה וציטופלסמה שופע המכיל שלפוחיות רבות (איור 2B).
הראשון 2 השבועיים של המטפאות הבולם התאים יבול (ימים 16 – 28) של אחד מלא 6 צלחת הבאר של בס הכיל, בממוצע, 2.59 x 106 ± 0.54 תאים. לאחר יום 28, ממוצע של 4.64 x 106 ± 0.94 של תאים ההשעיה לכל 6 צלחת הטוב של בס יוצרו. מיום 80 ואילך, מספר התאים ההשעיה החלו לרדת כמו בס להיות מותש (איור 2C). מומלץ להפסיק את הפרוטוקול בידול אחרי מספרים ירידה מתחת 3 x 106 הסמנים הקדם לקציר לכל 6 צלחת הבאר של בס.
ביטוי של משטח התא מקרופאג נגזר IPSC Cy, לנסות זרימה נשארת השיטה הנפוצה ביותר המשמשת כדי להעריך את הפנוטיפ של מקרופאגים אנושיים. אסטרטגיית האיסוף כדי לאמוד את הביטוי של פני השטח תא מורכב באמצעות האוכלוסייה העיקרית של התאים באמצעות פרמטרים פיזיים כמו גודל וצפיפות, ואחריו על ידי הפעלת תאים בודדים ולאחר מכן לחיות תאים (איור 3A). בוגרת iPSC-נגזר מקרופאגים צריך לבטא את סמן השושלת CD45 ו מקרופאג התבגרות סמן 25F9, ולהיות שלילי עבור מונוציט/בוגר מקרופאג סמן CD93. זה מתאים לתצפיות שלנו (איור 3A). מקרופאגים הנגזרים IPSC היו חיוביים גם עבור סמנים מיאלואיד השושלת CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163, ו CD169 (איור 3B). הם היו חיוביים עבור מודולציה החיסונית סמן CD86, וחלק קטן מהם הביעו קולטני כימוקין CX3CR1, CCR2, CCR5, ו CCR8 במצב נאיבי (איור 3B). המגרשים התקבלו מנתונים שפורסמו בעבר על ידי המעבדה שלנו8.
מקרופאגים נגזרים אחת התכונות העיקריות של מקרופאגים הגנה מארחים הומאוסטזיס רקמות היא היכולת שלהם פתוגנים phagocytose, תאים אפוטוטיים, ופסולת27. שיעור הפייגוציטוזה קשור באופן הדוק למדינות פנופאיות מסוימות28. כדי להעריך את היכולת של ipsc-מיט phagotic, השתמשנו מערכת הדמיה של תוכן גבוה הגישה8,9,11 זה עושה שימוש במיקרוסקופ אופרטה מיקרוסקופ ו phrodo zymosan ביואמרים (pH-רגיש מעלה השערים). ביואמרים היו לא פלורסנט כאשר התווסף לתרבויות (איור 4A) אבל fluoresced ירוק בהיר ב-pH חומצי תאיים (איור 4a). הדמיה לחיות מיקרוסקופ אופרטה הוגדר התמונה כל 5 דקות לאחר תוספת של חרוזים עבור זמן כולל של 175 דקות. תפוקה גבוהה ולאחר ניתוח תמונה לא משוחדת היה בשימוש לאחר מכן בפלטפורמת קולומבוס לכמת פעילות במונחים של שבר phagocytic המייצג את הפרופורציה של תאים החרוזים phagocytic ואת המדד phagocytic כי הוא מדד של מספר חרוזים כי כל תא לבלוע.
מקרופאגים יכולים להגיב ולשנות את פנוטיפ שלהם בהתאם לרמזים סביבתיים. כדי להעריך את יכולתם להגיב ולשנות על גירויים סביבתיים, iPSC-DMs ניתן לטפל עם LPS ו IFNg, IL4, או IL10. לאחר 48 h של הטיפול, הם שינו פנוטיפ, בזאת המכונה M (LPS + IFNg), M (IL4), ו M (IL10), בהתאמה29. ביטוי גנטי ניתוח הוא כלי שימושי כדי לבדוק את הסטטוס הפולריזציה של מקרופאגים. עם הגירוי של LPS ו-IFNg, מקרופאגים ביטוי mRNA של גנים CD40, VCAM1ו- Tnfa (איור 5a). על IL4 גירוי, תאים ביטוי mRNA של גנים CD68, CD84, ו MRC1 (איור 5b). עם גירוי IL10, הביטוי iPSC-DMs upregulated של MRC1 (איור 5b). במונחים של phagocyציטוזה, מקרופאגים שטופלו LPS + IFNg או IL4 הראו אחוז נמוך באופן משמעותי של תאים phagocytosis בהשוואה מקרופאגים נאיבי. iPSC-DMs מטופלים עם IL10 הראה אחוז מוגבר של תאים phagocytic ואינדקס phagocytic (איור 5C–E).
<img alt="התמיינות iPSC למקרופאגים; תרשים זרימה; פרוטוקולי BMP4, VEGF, SCF, IL3, CSF1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: סיכום גרפי של הבידול iPSC כדי מקרופאגים פונקציונליים מבוגרים. . תרשים שצויר עם ביוריאנדר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תהליך התמיינות תאים: תמונות מיקרוסקופ, תרביות תאים; תרשים גדילה מציג מספרים קודמים." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: בידול ipsc לכיוון מקרופאגים ו-IPSC-DM מספר ומורפולוגיה. (א) תמונות שדה בהיר שהתקבלו מ (משמאללימין): מושבה Ipsc, embryoid גופים (בס), שנקטפו תאים ההשעיה, ו מקרופאגים בוגרים. סרגל קנה מידה = 100 μm. (ב) התמונה של מקרופאג ציטומוכתם ויטראז '. סרגל קנה מידה = 25 μm. (ג) מספר תאי ההשעיה שנאספו בכל קציר לאחד 6 צלחת הטוב של בס. התוויה מראה ממוצע + SEM; (n = 6 ניסויים עצמאיים ביולוגית). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="דיאגרמת ציטומטריית זרימה עם תהליך מיון תאים והיסטוגרמות של סמני שושלת לניתוח חיסוני." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: מקרופאג משטח התא סמן פניטיפים. (א) לעבור על האסטרטגיה לניתוח של מקרופאגים בוגרים שמקורם ב-ipsc. בודד, תאים חיים היו מגודרת, ולאחר מכן מנותח עבור הביטוי של סמני פני השטח תא CD45, CD93, ו 25F9. שערי עבור סמני פני השטח של התא צוירו באמצעות זריחה פחות אחד (FMO) פקדים. (ב) זרם מייצג cytometry היסטגרמות עבור כתמים בודדים של ipsc-dms (כחול) ו isotype בקרות (אפור) עבור שושלת היוחסין סמנים מיאלואידית, החיסונית-מודולציה סמנים, התבגרות סמנים, וקולטנים כימוקין. מגרשים הם נציג של n = 5 ניסויים עצמאיים ביולוגית עבור כל השושלת סמנים מיאלואיד, למעט CD105 ו CD206 (n = 3); התבגרות סמנים (n = 5); סמנים החיסונית-מודולציה (n = 3); וקולטני כימוקין (n = 3). מגרשים להשתמש בנתונים שפורסמו קודם לכן8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תהליך פגוציטוזיס עם תמונות מיקרוסקופיה, שבר פגוציטי ותרשימי אינדקס לאורך זמן." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> איור 4: IPSC-DM פוליריזציה ו phagocyציטוזה. תמונות מייצגות של iPSC-DMs (א) מיד לאחר תוספת של Zymosan pHrodo חרוזים ירוקים (ב) 175 דקות לאחר תוספת של חרוזים. הכחול מייצג את גרעיני התאים; אדום מייצג את הציטופלסמה של התאים. ירוק מייצג חרוזים לבלוע (סרגל קנה מידה = 20 μm). (ג) חלק של מקרופאגים phagocytic ו (ד) המדד phagocytic/בעוצמה ירוקה לכל phagocytic מקרופאג לאורך זמן במצב נאיבי (n = 6 ניסויים עצמאיים ביולוגית). מגרשים מציגים את הערך הממוצע והסרגלים מייצגים את ה-SEM. מגרשים להשתמש בנתונים שפורסמו בעבר8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="ניתוח ביטוי גנים במקרופאגים; תרשימי עמודות, מיקרוסקופיה קונפוקלית, גרפים של פעילות פגוציטית." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> איור 5: הערכת מדינות הקיטוב של iPSC-DM. כימות יחסית של מנתח RT-PCR של iPSC מקוטב ונאיבי-DMs כדי להעריך את הביטוי של (א) M (lps + IFNΥ); (ב) מ (IL4) ו-M (IL10)-גנים משויכים (n = 6 ניסויים עצמאיים ביולוגית; השוואות בכיוון אחד של ANOVA והולם-Sidak לאחר מבחן. קבוצות מקוטבות היו מבחינה סטטיסטית בהשוואה לקבוצה התמימה בלבד). מגרשים מציגים את הערך הממוצע, וקווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן. ND ב מגרשים = תעתיק לא זוהה. נתונים עבור מגרשים אלה פורסמו בעבר8. (ג) תמונות מייצגות של ipsc-dms 175 דקות לאחר התוספת של חרוזי pHrodo מ Ipsc-dms מטופלים עם (משמאל לימין): אין ציטוקינים, lps + Ifn-Y, il-4, ו-il-10 (סרגל קנה מידה = 20 μm). (ד) חלק של מקרופאגים phagocytic ו (E) המדד phagocytic/עוצמה ירוקה לכל phagocytic מקרופאג במקרופאג טיפולים נאיבי מקוטב 175 דקות לאחר תוספת של חרוזים (n = 12 ניסויים עצמאיים ביולוגית, בדרך אחת ANOVA ו-sidak השוואות מרובות לאחר הבדיקה. קבוצות מקוטבות היו מבחינה סטטיסטית בהשוואה לקבוצה התמימה בלבד). מגרשים מציגים את הערך הממוצע וקווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן (* p &lt; 0.05, * * p &lt; 0.01, * * * p &lt; 0.001, * * * * p &lt; 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר את הדור החזק של מקרופאגים מתאי גזע המושרה האדם pluripotent ושיטות לאפיון הבאים שלהם. ביטוי לסמן תא המשטח, ביטוי הגנים, ומוסר פונקציונלי משמשים כדי להעריך את הפנוטיפים ואת התפקוד של מקרופאגים הנגזרות iPSC.

הפקה ואפיון של מקרופאגים האדם מ Pluripotent תאי גזע

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...

מחקר ביולוגיה מקרופאג אנושי הוגבל משום שהוא מסתמך על איסוף תאים מתורמים. פרוטוקול זה מראה שיטה שבה אנו יכולים לייצר מקרופאגים אנושיים מתאים גזע פלוריפוטנטיים במעבדה. זהו פרוטוקול חזק שניתן לשנות את קנה המידה שלו כדי לייצר מקרופאגים בכמויות גדולות עבור טיפולים בתאים או מחקר.תאי גזע פלוריפוטנטיים יכולים להיות מניפולציה גנטית. אז בפרוטוקול זה, אנחנו יכולים ליצור מקרופאגים עם פנוטיפ ספציפי, תגי פלואורסצנט, וגם מקרופאגים כדי מודל מצבי מחלה. הדגמה חזותית של פרוטוקול זה שימושית מכיוון שהשימוש בכלי המעבר הקל לא יהיה מוכר לחוקרים רבים.כמו כן, קשה לתאר במילים את רמת הטיפול הדרושה בעת חידוש מלאי וקצירת תאים. כאשר התאים התרבותיים הגיעו ל-80%, החליפו את מדיום התרבות המושקע ב-1.5 מיליליטר של מדיום טרי. מחזיק את כלי התרבות ביד אחת, לגלגל כלי מעבר תא חד פעמי על פני הצלחת בכיוון אחד.כל הלהבים בגלגלת בטח נוגעים בצלחת. לשמור על לחץ אחיד תוך כדי גלגול. חזור על גלגול באותו כיוון עד שהתקרה כולה תכסה.לסובב את כלי התרבות 90 מעלות ולחזור על גלגול. עם פיפטה סטרילית, השתמש במדיה באר כדי לנתק מושבות חתוכים. שאף CELLstart והחלף מדיה.מעבירים תאים ביחס של 1 ל-4 ל בארות מצופות מראש שהוכנו כמתואר בכתב היד. כדי להתחיל את תהליך הבידול ביום אפס, להוסיף 2.25 מיליליטר של מדיה שלב אחד לשתי בארות של קובץ מצורף נמוך במיוחד שישה בארות צלחת. לאחר מכן, עבור באר אחת של 80% של IPSCs בצלחת של שש בארות, החלף את מדיית התחזוקה ב-1.5 מיליליטר של מדיה בשלב הראשון.גזור מושבות באמצעות כלי מעבר תא חדש. באמצעות פיפטה, להעביר את המושבות לחתוך לשתי בארות של צלחת שישה בארות מצורף נמוך במיוחד. ביום השני, להתאים את ריכוזי ציטוקינים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של hESC SFM מדיה לצלחת שש באר המכיל את היום שני גופים עובריים.ביום הרביעי, מעיל ארבע בארות של צלחת תרבות רקמות שש בארות עם 0.1% ג'לטין. לאחר הדגירה לפחות 10 דקות, להסיר את הג'לטין ולהוסיף 2.5 מיליליטר של מדיה שלב שני. לאסוף גופות עובריות נוצרו משתי בארות של צלחת שש בארות ולמקום אותם בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.אפשר להם להתיישב בתחתית הצינור בכוח הכבידה. ואז בזהירות שאף את התקשורת מהצינור ולחץ מחדש על הגופות העובריות בשני מיליליטר של מדיה שלב 2. מעבירים 10 עד 15 גופים עובריים ל הבאר מצופה ג'לטין המכילה 2.5 מיליליטר של מדיה שלב 2 ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.במשך שבועיים עד שלושה שבועות, לשנות את התקשורת כל שלושה עד ארבעה ימים. ציפוי של EBs הוא קריטי. פחות מ- 10 או יותר מ- 15 EBs או פיזרתם באופן לא אחיד עלולים להוביל לתשואות נמוכות של מקרופאגים.לאחר שבועיים עד שלושה שבועות, הגופים העובריים מתחילים לשחרר תאים hematopoietic לא עקבי לתוך ההשעיה. באמצעות מסננת 40 מיקרומטר, לאסוף תאים אלה לתוך צינור 50 מיליליטר ולאחר מכן לחדש את התקשורת. צנטריפוגה ההשעיה של תאים hematopoietic ב 200 פעמים g במשך שלוש דקות.תן מחדש את התאים ההמוטופיים במדיה בשלב 3. לאחר מכן צלחת התאים בצפיפות של 0.2 פעמים 10 לתאים השישי למיליליטר. שנה את שלב שלוש המדיה כל חמישה ימים.לאחר תשעה עד 11 ימים, המקרופאגים יהיו מובחנים לחלוטין ופונקציונליים לחלוטין. הוסיפו 8 פעמים 10 למאקרופאגים הרביעיים שמקורם ב-iPSC ל-200 מיקרוליטרים של מדיה בשלב 3 לכל באר של צלחת של 96 בארות. הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון חרוזים לכל באר המכילה מקרופאגים שמקורם ב- iPSC.השתמש במערכת דימות תוכן גבוה כדי לדמיין את הלוח. לרכוש שלושה שדות או יותר על פני כל באר כדי לקבל ייצוג טוב. מושבות iPSC, גופים עובריים, תאי השעיה hematopoietic, מקרופאגים בוגרים היו ברורים מורפולוגית.המקרופאגים שמקורם ב-iPSC היו גדולים, היו בעלי גרעינים בודדים קטנים בצורת אליפסה והיה להם ציטופלסמה שופעת המכילה שלפוחיות רבות. פנוטיפ מקרופאג' הוערך על ידי ציטומטריית זרימה. מקרופאגים בוגרים שמקורם ב- iPSC ביטאו את סמן השושלת CD45 ואת סמן התבגרות המקרופאג ' 25F9 והם היו שליליים עבור סמן מקרופאג לא בוגר מונוציטים CD93.מקרופאגים שמקורם ב- iPSC הביעו מספר סמני מיאלואידים של שושלת היו חיוביים עבור סמן אפנון חיסוני CD86. חלק קטן של מקרופאגים ביטא קולטני כימוקין CX3CR1, CCR2, CCR5, ו CCR8. יכולת פאגוציטית iPSC-DM הוערכה באמצעות ביו-חלקיקים ומערכת הדמיה בתכנים גבוהים.Bioparticles היו nonfluorescent כאשר הוסיף תרבויות מקרופאג, אבל לאחר phagocytosis פלואורסצנטי ירוק בהיר ב- pH חומצי תאיים. השבר האפגוגי מייצג את שיעור המקרופאגים שהפגוציטו ביו-חלקיקים ואת המדד הפאגוגי הוא מדד מספר הביו-חלקיקים שכל מקרופאג' בלע. מקרופאגים יכולים לשנות פנוטיפ בתגובה לרמזים סביבתיים.RT-PCR שימש לכימות ביטוי mRNA מוסדר של גנים. מקרופאגים שטופלו ב-LPS ובאינטרפרון גמא או IL4 הראו אחוז נמוך משמעותית של תאים פאגוציטים בהשוואה למאקרופאגים נאיביים. מקרופאגים שטופלו ב- IL10 הראו אחוז מוגבר של תאים פאגוציטים ומדד phagocytic מוגבר.פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לספק מקור מחוץ למדף של תאים לטיפול במחלות כגון מחלת כבד כרונית שבה מקרופאגים הוכחו להיות טיפולית במודלים של בעלי חיים. ניתן להשתמש במאקרופאגים שמקורם ב- iPSC כדי לחקור מקרופאגים הקשורים למספר מצבי מחלה. לדוגמה, אנו משתמשים בתאים אלה כדי לחקור מקרופאגים הקשורים לגידולים בסרטן השד.שינינו את הפנוטיפ של מקרופאגים שמקורם ב- iPSC על ידי תכנות גנטי באמצעות גורם שעתוק יחיד הנקרא KLF1. עם זאת, יצרנו מקרופאגים נראים כמו מקרופאגים של האי אריתרויד והם סיפקו תובנות על הייצור וההתבגרות של תאי דם אדומים.

production-characterization-human-macrophages-from-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את הפרימיום של מונוציטים ראשוניים למקרופאגים. מונוציטים אנושיים ראשוניים יכולים להיות מבודדים ומובחנים לפנוטיפ פרו-דלקתי דמוי M1 באמצעות גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) או לפנוטיפ אנטי-דלקתי דמוי M2 באמצעות גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF).

תרבית חוץ גופית והתמיינות של מונוציטים ראשוניים למקרופאגים

סרטון זה מתאר שיטה במבחנה ליצירת מקרופאגים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs). יצירת מקרופאגים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מתרחשת בשלושה שלבים: (i) צבירה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים בתרחיף ליצירת גופים עובריים תלת-ממדיים (EBs) המתמיינים לתאים מזודרמליים, (ii) היווצרות תאים מקדימים של מקרופאגים מה-EBs המתמיינים, ו-(iii) התמיינות של התאים המקדומים של המקרופאגים למקרופאגים בוגרים ומתפקדים.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם למקרופאגים

סרטון זה מדגים את הליך ההתמיינות של תאים פלוריפוטנטיים אנושיים לתאים דמויי מיקרוגליה. התהליך כולל יצירת גופים עובריים, העברתם לבארות מצופות, ושימוש בגורמי גדילה ספציפיים כדי להנחות התמיינות למבשרי מקרופאגים פרימיטיביים, אשר בסופו של דבר מתמיינים לתאים דמויי מיקרוגליה.

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאים דמויי מיקרוגליה

המקרופאגים כבר מזמן מוכרים כמרכיב קריטי של תגובות חיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. הפיצוץ האחרון של ידע הנוגע להיבטים אבולוציוניים, גנטיים, והביוכימי של האינטראקציה בין מקרופגים וחיידקים חידש את תשומת לב מדעית למקרופאגים. מאמר זה מתאר שיטה להבדיל מקרופאגים ממח העצם של עכבר.

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור מקרופאגים אנושיים. מעילים באפי מעובדים על ידי צנטריפוגה הכפולה שיפוע צפיפות ולאחר מכן מונוציטים מבודדים נבדלים למקרופאגים בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון. זה ממקסם תשואות מקרופאג ומקל על קצירת תאים לניסויים הבאים.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

מוצג פרוטוקול לתרבית תאים של מקרופאגים שמקורם בגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF). הפרוטוקול משתמש בשימור בהקפאה של מונוציטים יחד עם התמיינות בתפזורת שלהם למקרופאגים. לאחר מכן ניתן לזרוע מקרופאגים שנקטפו לבארות תרבית בצפיפות התאים הנדרשת לביצוע ניסויים.

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

פרוטוקול זה מתאר את תהליך ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) לתאים דמויי מיקרוגליה לצורך ניסויים במבחנה . אנו כוללים גם הליך מפורט ליצירת סינפטוזומים אנושיים מנוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב- iPSC שיכולים לשמש כמצע למבחני פאגוציטוזה במבחנה באמצעות מערכות הדמיה של תאים חיים.

תאים דמויי מיקרוגליה אנושית: התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ובדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים במבחנה באמצעות סינפטוזומים אנושיים

פרוטוקול זה מציג את ההתמיינות של אוסטאוקלסטים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) ומתאר שיטות לאפיון אוסטאוקלסטים ומבשרי אוסטאוקלסט.

התמיינות ואפיון אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

מחקר זה מתווה גישה חדשנית להקמת תאים דמויי מיקרוגליה (iMG) שמקורם במונוציטים אנושיים המאפשרים הערכה עקיפה של דלקת במוח. זה מציג מודל תאי שעשוי להועיל למחקר המתמקד בדלקת פוטנציאלית במוח ובהפרעות נוירופסיכיאטריות נלוות.

הנדסה של תאים דמויי מיקרוגליה המושרים על ידי דם אנושי לחקר המוח בתרגום לאחור

מערכות התמיינות תאים פלוריפוטנטיות זמינות (PSC) לתפקוד מעוכבות כיום על ידי בעיות של שונות חמורה מקו לקו ואצווה לאצווה. כאן, תוך שימוש בהתמיינות לבבית כדוגמה העיקרית, אנו מציגים פרוטוקול לניטור חכם ומווסת את תהליך התמיינות PSC המבוסס על למידת מכונה מבוססת תמונה.

אסטרטגיית למידת מכונה מבוססת תמונה של תאים חיים לניטור התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית

מונוציטים ומקרופאגים הם תאים חיסוניים פלסטיים מאוד וניתנים לתכנות מחדש החיוניים לבריאות ולמחלות. הם חשים ומגיבים למגוון רחב של גירויים על ידי אימוץ תוכניות בידול ופנוטיפים ספציפיים. תקננו מודל מבחנה לחקר קיטוב ותכנות מחדש של מקרופאגים, ומספק כלי רב ערך למחקר.

מודל תכנות מחדש של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים לבדיקות חוץ גופיות

למד שיטה להפקת מקרופאגים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) ואפיונם באמצעות ציטומטריית זרימה ומבחני פאגוציטוזה. פרוטוקול זה מאפשר ייצור בר-קנה מידה לחקר מחלות ולטיפולים תאיים.

הפקה ואפיון של מקרופאגים האדם מ Pluripotent תאי גזע

גלה סרטונים נוספים