מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי Rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי

פרוטוקול זה מתאר מערכת גנטיקה הפוכה אמינה ויעילה להכנת rotaviruses רקומביננטי. זה גם מסביר איך לעשות rotaviruses רקומביננטי לבטא חלבונים סמן פלואורסצנטי. שיטה זו היא פשוטה הדורשת מספר מינימלי של פלסמידים והוא יכול ליצור rotaviruses רקומביננטי לבטא חלבוני פלואור נפרדים, כמו גם חלבונים ויראליים.

התחל על ידי זריעת תאי BHKT7 על לוחות 12 באר. יש לשטוף מונוליאר טרי של תאים עם PBS. לאחר מכן לשבש את monolayer עם פתרון טריפסין-EDTA ו resuspend התאים בחמישה מיליליטר של GMEM להשלים מדיום.

קבע את הריכוז של תאי BHKT7 בני קיימא באמצעות כחול טריפאן ודלפק תאים אוטומטי. ואז זרע פעמיים 10 לתאים החמישיים במיליליטר אחד של GMEM לתוך כל באר של צלחת תרבות תאים 12 באר. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%פחמן דו חמצני לילה.

למחרת, הכינו את תערובת הפלסמיד לתרגום בהתאם לכיווני כתב היד. לאחר מכן מוסיפים 110 מיקרוליטרים של מדיום סרום מופחת מחומם מראש לכל תערובת פלסמיד ובעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. מוסיפים לתערובת 32 מיקרוליטרים של רגנט טרנספיקציה.

לעשות צנטריפוגה קצרה בעקבות מערבולת דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. בינתיים, לשטוף את התאים BHKT7 עם שני מיליליטר של GMEM בינוני שלם. מוסיפים מיליליטר אחד של SMEM בינוני שלם לכל באר ומחזירים את הצלחת לאנקובטור.

לאחר הדגירה של 20 דקות, השתמש בצינור 200 מיקרוליטר כדי להוסיף את תערובת ההטעה טיפה אחר טיפה לכל באר. מטלטלים בעדינות את הצלחת ומחזירים אותה לאנקובטור. יומיים לאחר ההמרה, יש לשטוף מונוליאר טרי של תאי MA104 עם PBS.

לשבש את monolayer עם פתרון טריפסין-EDTA ו resuspend התאים בחמישה מיליליטר של אמצעי DMEM להשלים. לספור את התאים ולהתאים את הריכוז עד שמונה פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר של בינוני DMEM שלם. הוסף 0.25 מיליליטר של תאי MA104 dropwise ל הבארים עם תאי BHKT7 מנומרים.

התאם את ריכוז הטרפסין ל- 0.5 מיקרוגרם למיליליטר על-ידי הוספת 0.8 מיקרוליטר למיליגרם אחד למיליליטר של פתרון מלאי טריפסין לכל באר. לדלל את התאים הנותרים MA104 לריכוז של 1.5 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר ב- DMEM להשלים בינוני וממקמים שני מיליליטר בכל באר של צלחת שש באר. שישה ימים לאחר ההמרה, לשחזר את הנגיף רקומביננטי מן התאים מנוקטים.

נושא BHKT7 MA104 תאים לשלושה מחזורים של הקפאה / הפשרה בתנאים סטריליים, הזזת הצלחות בין מקפיא שלילי 20 מעלות צלזיוס וטמפרטורת החדר. מעבירים ליאזטים לצינורות של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הצינורות במשך 10 דקות ב 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס כדי גלולה את הפסולת התאית.

לאסוף את supernatant ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס. מוסיפים טריפסין ל-100 מיקרוליטרים של ליסנט תאים מובהר לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר ומדרגים את התערובת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן הכינו סדרת דילול סדרתית של פי 10, החל מ-10 ועד לסדרה השלילית ועד לשבעה השליליים במדיום DMEM לא שלם.

יש לשטוף פעמיים את המונואירים MA104 בשני מיליליטר של PBS ופעם אחת עם מדיום לא שלם של DMEM. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של דילול ליסאט כפול לצלחות ומדגרים אותן ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני, מתנדנדים כל 10 עד 15 דקות כדי לחלק מחדש את הדילולים על פני המונולר. הכינו פתרון שכבת-על של MEM על ידי שילוב של נפחים שווים של EMEM 2X מחומם מראש עם אגרוז מומס ומצונן של 1.5%.

יש לשמור על פתרון זה ב-42 מעלות צלזיוס באמבט מים ולהתאים את ריכוז הטרפסין ל-0.5 מיקרוגרם למיליליטר מיד לפני הנחתו על התאים. שאף דילול ליט מצלחת שש בארות. לאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם שני מיליליטר של מדיום שלם.

הוסיפו בעדינות שלושה מיליליטר של פתרון כיסוי MEM על קוטל התאים בכל באר. אפשרו לתעוררות להתקשות בטמפרטורת החדר. ואז להחזיר את הצלחות לאנקובטור.

שלושה ימים לאחר מכן, הכינו פתרון שכבת-על של MEM כפי שתואר קודם לכן והוסיפו אדום ניטרלי לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר מיד לפני השימוש. הוסף שני מיליליטר של פתרון כיסוי על גבי agarose הקיים בצלחות שש באר. אפשר את agarose להקשיח ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור, הקפד להגן על הצלחות עם אדום ניטרלי מפני אור.

במהלך שש השעות הבאות, לזהות לוחות rotavirus בעזרת תיבת אור. השתמש פיפטים העברה חד פעמית כדי לבחור לוחות מוגדרים בבירור, שחזור תקעים agarose המשתרעים באופן מלא לשכבת התא. לגרש את התקע לתוך צינור 1.5 מיליליטר המכיל 0.5 מיליליטר של DMEM בינוני שלם מערבולת המדגם במשך 30 שניות.

הגבר את הווירוס מבודד פלאק eluted לתוך המדיום על ידי התפשטות על MONOLAYERS MA104 או בקבוק AT25 עם בינוני DMEM שלם ו 0.5 מיקרוגרם למיליליטר של טריפסין. הוסף 600 מיקרוליטרים של ליזטים תאים נגועים ברורים ו 400 microliters של תיוצ'יאנט guanidinium לתוך 1.5 צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר. מערבולת אותם במשך 30 שניות ו דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.

לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של כלורופורם. Vortex הפתרון במשך 30 שניות ו דגירה אותו במשך שלוש דקות. לאחר מיקרוצנטריפוגה של חמש דקות ב 13, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס, להעביר 550 microliters של השלב המימי העליון לתוך צינור טרי.

מוסיפים שתי כמויות של אלכוהול isopropyl קר להפוך את הצינור ארבע עד שש פעמים. הדגירה את המדגם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. ואז צנטריפוגה זה במשך 10 דקות ב 13, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס.

השלך את העל-טבעי והשאיר את גלולת הרנ"א. לשטוף את ה-RNA על ידי הוספת מיליליטר אחד של 75% אתנול לצינור היפוך זה פעם אחת צנטריפוגה אותו במשך חמש דקות ב 7, 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת אתנול בזהירות, לאפשר RNA לאוויר יבש במשך חמש עד 10 דקות.

ואז להמיס את גלולה ב 15 microliters של מים חופשיים גרעין. הוסף שני מיקרוליטרים של מאגר טעינת DNA 6X ל 10 microliters של מדגם RNA מומס. טוענים אותו על ג'ל מיני פוליאקרילמיד 10% יצוק מראש.

פתור את ה- RNAs על-ידי אלקטרופורזה במאגר הריצה של טריס-גליצין למשך שעתיים תחת זרם קבוע של 16 מיליאמפר. לאחר ריצת הג'ל הושלמה, להשרות את הג'ל במשך חמש עד 10 דקות במים המכילים מיקרוגרם אחד לכל ברומיד אתידיום מיליליטר ולזהות את מקטעי הגנום rotavirus עם טרנסילומינטור UV. פרוטוקול גנטיקה הפוכה זה שימש ליצירת וירוסי SA11 רקומביננטיים שניתן לזהות בקלות עם בדיקה פלאק על תאי MA104 המאפשר בידוד פלאק.

הגנומים dsRNA של רובד מטוהר rSA11 סוג הבר ווירוסי SA11-UnaG חולצו עם פתרון המכיל פנול ו- guanidinium thiocyanate, נפתר על ידי אלקטרופורזה על ג'ל פוליאקרילמיד 10%, זוהה על ידי כתמים עם אתידיום ברומיד. כצפוי, קטע שבע או NSP3 dsRNA של rSA11-UnaG היגר הרבה יותר איטי מזה של סוג הבר rSA11 בשל נוכחות של רצפי 2A-3xFLUnaG. כדי לבדוק את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי UnaG, תאי MA104 היו נגועים בסוג הבר וירוס רקומביננטי ונבדק עם דימוי תא חי.

הניתוח הראה כי rSA11-UnaG הפיק פלואורסצנטיות ירוקה בעוד לא זוהתה פלואורסצנטיות בתאים נגועים בסוג הבר rSA11. ניתוח Immunoblot בוצע כדי לחקור אם אלמנט 2A של rSA11-NSP3-2A-xflUnaG קידם את הביטוי של שני חלבונים נפרדים. הניתוח הראה כי NSP3-2A ו 3xFL-UnaG אכן באו לידי ביטוי חלבונים נפרדים המציין אלמנט 2A פונקציונלי.

להתאוששות מוצלחת של rotavirus רקומביננטי, זה קריטי להשתמש בתאי BHKT7 איכותיים ומתוחזקים היטב עבור transfection ותאי MA104 עבור זריעת יתר, כמו גם כמויות מדויקות של פלסמידים טהורים מאוד. למרות פרוטוקול זה מסביר כיצד להשתמש במערכת גנטיקה הפוכה כדי לשנות את הגן rotavirus NSP3, אותה גישה יכולה לשמש כדי לשנות גנים אחרים כגון SP1.