Name: מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי Rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: למד שיטת גנטיקה הפוכה ליצירת רוטווירוסים רקומביננטיים המביעים חלבונים פלואורסצנטיים ב-BHKT7. שיטה זו מפשטת מחקר וירולוגי ופיתוח חיסונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענקים R03 AI131072 ו R21 AI144881, מימון הסטארט-Up של אוניברסיטת אינדיאנה, ואת קרן לורנס M.. אנו מודים לחברי מעבדת הרנטגן של המעבדה, אולריך דסלברגר, וגואידו פאפא בגין תרומותיהם הרבות והצעותיהם בפיתוח פרוטוקול הגנטיקה הפוכה.

<ol><li>Crawford, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Rotavirus infection.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).</li>
<li>Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+model+of+an+infectious+rotavirus+particle%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic model of an infectious rotavirus particle.</a> The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).</li>
<li>International Committee on Taxonomy of Viruses. Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://talk.ictvonline.org/taxonomy">https://talk.ictvonline.org/taxonomy</a> (2019).</li>
<li>Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Health+Organization-Coordinated+Global+Rotavirus+Surveillance+Network.+Global%2C+regional%2C+and+national+estimates+of+rotavirus+mortality+in+children+%3C5+years+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age.</a> Clinical Infectious Diseases. 62, Suppl 2 96-105 (2016).</li>
<li>Troeger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+vaccination+and+the+global+burden+of+rotavirus+diarrhea+among+children+younger+than+5+years%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years.</a> JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).</li>
<li>Matthijnssens, J., Van Ranst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+constellation+and+evolution+of+group+A+rotaviruses+infecting+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans.</a> Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).</li>
<li>McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassortment+in+segmented+RNA+viruses%3A+mechanisms+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).</li>
<li>Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+diversity+and+evolution+in+the+post-vaccine+world%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world.</a> Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entirely+plasmid-based+reverse+genetics+system+for+rotaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).</li>
<li>Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+coupling+of+virion+assembly+and+rotavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).</li>
<li>Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intraparticle+synthesis+of+the+rotavirus+double-stranded+RNA+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).</li>
<li>Komoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+rotaviruses+expressing+fluorescent+proteins+by+using+an+optimized+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system.</a> Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).</li>
<li>Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+selection+mechanisms+drive+efficient+single-gene+reverse+genetics+for+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).</li>
<li>Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+non-structural+rotavirus+proteins%2C+NSP2+and+NSP5%2C+form+viroplasm-like+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo.</a> Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).</li>
<li>Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+rotavirus+NSP2%2FNSP5+interactions+and+the+dynamics+of+viroplasm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation.</a> Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).</li>
<li>Kawagishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+system+for+a+human+group+A+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics system for a human group A rotavirus.</a> Journal of Virology. , (2019).</li>
<li>Komoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+infectious+recombinant+human+rotaviruses+from+just+11+cloned+cDNAs+encoding+the+rotavirus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome.</a> Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).</li>
<li>Mohanty, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point+mutation+in+the+rhesus+rotavirus+VP4+protein+generated+through+a+rotavirus+reverse+genetics+system+attenuates+biliary+atresia+in+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model.</a> Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).</li>
<li>Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genetically+stable+recombinant+rotaviruses+containing+novel+genome+rearrangements+and+heterologous+sequences+by+reverse+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics.</a> Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).</li>
<li>Duarte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+infection+alters+splicing+of+the+stress-related+transcription+factor+XBP1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).</li>
<li>Philip, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+rotavirus+expressing+NSP3-UnaG+fusion+protein+by+a+simplified+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system.</a> Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).</li>
<li>Papa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+rotaviruses+rescued+by+reverse+genetics+reveal+the+role+of+NSP5+hyperphosphorylation+in+the+assembly+of+viral+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories.</a> Journal of Virology. , (2019).</li>
<li>Komoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+system+demonstrates+that+rotavirus+nonstructural+protein+NSP6+is+not+essential+for+viral+replication+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture.</a> Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).</li>
<li>Philip, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+recombinant+rotaviruses+expressing+fluorescent+reporter+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Resource+Announcements%22%5BJournal%5D)">Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins.</a> Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+stable+rotavirus+reporter+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of stable rotavirus reporter expression systems.</a> Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).</li>
<li>Donnelly, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27cleavage%27+activities+of+foot-and-mouth+disease+virus+2A+site-directed+mutants+and+naturally+occurring+%272A-like%27+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences.</a> Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).</li>
<li>Kumagai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bilirubin-inducible+fluorescent+protein+from+eel+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle.</a> Cell. 153, 1602-1611 (2013).</li>
<li>Rodriguez, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+and+glowing+toolbox+of+fluorescent+and+photoactive+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+microbiological+and+biomedical+laboratories+%28BMBL%29%2C+5th+edition%22">Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition</a>. , HHS publication no. CDC 21-1112 (2009).</li>
<li>Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing%2C+storage%2C+and+quantification+of+rotaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Culturing, storage, and quantification of rotaviruses.</a> Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).</li>
<li>Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+is+associated+with+the+rotavirus+capsid+and+is+activated+by+solubilization+of+outer+capsid+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins.</a> Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

במעבדה שלנו, אנו סומכים באופן שגרתי על הפרוטוקול גנטיקה הפוכה המתוארת בזאת כדי לייצר רקומביננטי SA11 rotaviruses. עם גישה זו, אנשים עם ניסיון קטן בטכניקות ביולוגיה מולקולרית או עבודה עם rotaviruses לשחזר וירוסים רקומביננטי גם בניסיון הראשון שלהם. יצרנו קרוב 100 וירוסים רקומביננטי בעקבות פרוטוקול זה, כולל אלה עם גנום שעברו הנדסה מחדש כדי לבטא חלבונים זרים (למשל, FPs) וזה מכיל התוספות רצף, מחיקות, ומוטציות נקודה.
התנאים וזמני הדגירה שניתנו בפרוטוקול זה חלים על ההתאוששות של זנים הגדלים היטב של וי...

Rotaviruses הם הגורמים העיקריים של דלקת במעיים חמורה אצל תינוקות וילדים צעירים, כמו גם צעירים של יונקים רבים אחרים העופות1. כחברים של המשפחה Reo, וירוסים יש מקוטע כפולה תקוע-RNA (dsRNA) הגנום. מגזרי הגנום כלולים בתוך וויאון לא עטוף שנוצר משלוש שכבות קונצנטריות של חלבון2. מבוסס על רצף וניתוח פילוגנטי של מקטעי הגנום, תשעה מינים של רוטוירוס (A-D, F-J) הוגדרו3. אלה זנים הכוללת מינים רוטוירוס הם אחראים לרוב המכריע של המחלה האנושית4. המבוא של חיסונים רוטוירוס לתוך תוכניות החיסון לילדות החל בעשור האחרון הוא בקורלציה עם הנחות משמעותיות בתמותה רוטוירוס ותחלואה. בעיקר, מספר מקרי המוות של הילדות rotavirus הקשורים ירדו מ כ 528,000 ב 2000 ל 128,500 ב 20164,5. חיסונים rotavirus מנוסחים זני לחיות החליש של הווירוס, עם 2 כדי 3 מינונים מנוהל לילדים על ידי גיל 6 חודשים. המספר הגדול של זנים רוטוירוס ירוס מגוונת גנטית במחזור בני אדם ומינים אחרים היונקים, בשילוב עם יכולתם להתפתח במהירות באמצעות מוטאוסיס והקצאה מראש, עלול להוביל לשינויים אנטיגניים בסוגים של רוטוירוס להדביק ילדים6,7,8. שינויים כאלה עלולים לערער את היעילות של חיסונים קיימים, המחייבים החלפת או שינוי שלהם.
התפתחות של מערכות גנטיקה הפוכה במלואו בסיס המאפשר מניפולציה של כל 11 מקטעי הגנום רוטוירוס הושגה רק לאחרונה9. עם הזמינות של מערכות אלה, זה הפך להיות אפשרי לפענח פרטים מולקולריים של שכפול רוטוירוס ו פתוגנזה, כדי לפתח שיפור תפוקה גבוהה שיטות ההקרנה עבור תרכובות אנטי-רוטוירוס, וכיצד ליצור מחלקות חדשות פוטנציאלי יותר יעיל של חיסונים רוטוירוס. במהלך שכפול רוטוירוס, הכתיר ויראלי (+) rnas לא רק מדריך סינתזה של חלבונים ויראלי, אלא גם לשמש כתבניות לסינתזה של צאצאי הגנום dsrna מגזרים10,11. כל רוטוירוס גנטיקה הפוכה מערכות שתוארו עד תאריך להסתמך על הT7 של שעתוק וקטורים לתוך שורות התא של היונקים כמקור cdna-נגזר (+) rnas בשימוש בשחזור רקומביננטי וירוסים9,12,13. בתוך וקטורים שעתוק, cDNAs באורך מלא ממוקמים בין היזם T7 במעלה למטה הפטיטיס דלתא וירוס (HDV) ריבוזים כגון זה ויראלי (+) RNAs מסונתז על ידי T7 RNA פולימראז המכילים אותנטי 5 ' ו 3 '-termini (איור 1A). במערכת הגנטיקה הפוכה של הדור הראשון, וירוסים רקומביננטי נעשו על ידי התינוק מצפה בתאי כליה אוגר ביטוי T7 RNA פולימראז (bhk-T7) עם 11 T7 (pT7) תמלול וקטורים, כל מכוון סינתזה של ייחודי (+) RNA של מאמץ SA11 וירוס קופיים, ושלושה cmv יזם-כונן ביטוי פלמידים, קידוד אחד החלבון reovirus p10FAST היתוך ושני חלבוניות קידוד של vaccinia וירוס D1R-D12L הסגירה אנזים מורכב9. וירוסים רקומביננטי SA11 שנוצרו בתאי bhk-T7 מזוהמים היו מוגבר על ידי זריעה יתר עם MA104 תאים, קו תא מתירני עבור צמיחה רוטוירוס. גירסה ששונתה של מערכת הגנטיקה הפוכה של הדור הראשון תוארה שכבר לא משתמשת ב-פלמידים תומכים12. במקום, המערכת ששונתה מייצרת בהצלחה רקומביננטי rotaviruses פשוט על ידי transfecting T7 תאים ב-hk עם 11 SA11 שעתוק וקטורים, עם האזהרה כי וקטורים עבור המפעל ויראלי (viroפלסטיות) אבני בניין (חלבונים לא מבניים NSP2 ו NSP5) מתווספים ברמות 3 מתקפל גבוה יותר מאשר וקטורים אחרים14,15. גרסאות ששונו של מערכת הגנטיקה הפוכה פותחו גם כי תמיכה ההתאוששות של קו האדם ו אודליה וזנים של רוטוירוס16,17. הגנום רוטוירוס היא קלה להפליא מניפולציה על ידי הפוך גנטיקה, עם רקומביננטי וירוסים שנוצרו עד היום עם מוטציות הציג לתוך VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, ו NSP522,23. בין הווירוסים השימושיים ביותר שנוצר עד כה הם אלה שעברו הנדסה לבטא חלבונים כתב פלורסנט (FPs)9,12,21,24,25.
בפרסום זה, אנו מספקים את הפרוטוקול עבור מערכת הגנטיקה הפוכה שאנו משתמשים במעבדה שלנו כדי לייצר רקומביננטי זנים של SA11 rotavirus. התכונה המפתח של הפרוטוקול שלנו היא שיתוף של התאים BHK-T7 עם 11 pT7 וקטורים (שונה לכלול רמות 3x של pT7/NSP2SA11 ו pT7/NSP5SA11 וקטורים) ו-CMV ביטוי קידוד וקטור החזירים האפריקאי (ASFV) NP868R סגירה אנזים21 (איור 2). בידינו, נוכחות של NP868R באמצע מוביל את הייצור של מגדל גבוה יותר של וירוסים רקומביננטי על ידי מנוכר bhk-T7 תאים. בפרסום זה, אנו מספקים גם פרוטוקול עבור שינוי pT7/NSP3SA11 הפלמיד כגון הרקומביננטי וירוסים ניתן ליצור כי לבטא לא רק את המוצר 7 מוצר חלבון NSP3 אלא גם FP נפרד. זה מושגת על ידי מחדש הנדסה NSP3 פתוח מסגרת הקריאה (orf) ב pT7/NSP3SA11 פלמיד להכיל במורד הזרם 2a לעצור הפעלה מחדש האלמנט ואחריו FP (איור 1b)24,26. באמצעות גישה זו, יצרנו רקומביננטי rotaviruses ביטוי FPs שונים: unag (ירוק), mkate (רחוק-אדום), mkate (אדום), tagbfp (כחול), CFP (ציאן), ו-yfp (צהוב)24,27,28. אלה וירוסים FP ביטוי זה נעשים מבלי למחוק את NSP3 ORF, ובכך וירוסים מניבים כי צפויים לקודד השלמה מלאה של התפקוד חלבונים נגיפי.

<table><tbody><tr><td>כליה אוגר לתינוק - T7 RdRP (BHK-T7) תאים</td><td></td><td></td><td>מגע: ubuchholz@niaid.nih.gov</td></tr><tr><td>Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>45608105</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer AutoT4 מונה תאים בר קיימא</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Gel Imaging System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MP</td><td>194002</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5060</td><td></td></tr><tr><td>Qualified E.coli DH5alpha Bacteria</td><td>Lucigen</td><td>60602-2</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז שלם</td><td>פירס</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות העברה חד פעמיות, טיפים מורחבים עדינים במיוחד</td><td>MTC Bio</td><td>P4113-11</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM)</td> <td>איכות ביולוגית</td><td>115-073-101</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, אבסולוט (200 הוכחה)</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אתידיום ברומיד (10 מ"ג/מ"ל)</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>קורנינג</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS),</td><td>קורנינג</td> מומת בחום <td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>דגל M2 נוגדן, עכבר חד-שבטי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit</td><td>Sigma</td><td>NA0200-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin (G-418)</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Gibco FluroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701</td><td>DMEM עם רקע נמוך פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>גלזגו מדיום חיוני מינימלי (GMEM)</td> <td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG, חזרת פרוקסידאז (HRP)</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>מצומדים 7074S</td><td></td></tr><tr><td>חזיר ניסיונות אנטי-NSP3 אנטי סרום</td><td>פטון מעבדה</td><td>לוט 55068</td><td></td></tr><tr><td>חזיר ניסיונות אנטי-VP6 Antierum</td><td>Patton</td><td>מעבדה מגרש 53963</td><td></td></tr><tr><td>חזיר נגד גינאה IgG של סוסים, חזרת פרוקסידאז (HRP) מצומד</td><td>KPL</td><td>5220-0366</td><td></td></tr><tr><td>IgG נגד עכבר סוסים, חזרת ארוקסידאז (HRP)</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td> מצומד <td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection</td><td>Kit JH Science</td><td>25235</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>מקרון</td><td>3032-02</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת L-גלוטמין ( 100x)</td> <td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>אבקת לוריא אגר (אגר LB של מילר)</td> <td>מוצרי מחקר RPI</td><td>L24020-2000.0</td><td></td></tr><tr><td>בינוני 199 (M199) תרבית בינונית</td><td>שיקלון</td><td>Sh30253.01</td><td></td></tr><tr><td>מינימלי חיוני בינוני -פורום נשר ג'וקליק (SMEM)</td><td>לונזה</td><td>04-719Q</td><td></td></tr><tr><td>כליות קוף (MA104) תאי</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-2378.1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Spectrophotometer</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסה אדומה ניטרלית (0.33%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N2889-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide מיני-ג'ל</td><td>Invitrogen</td><td>XP00102BOX</td><td></td></tr> ללא <tr><td>נוקלאז ביולוגיה מולקולרית כיתה מים</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ניקוי ג'ל ו-PCR NucleoSpin</td><td>Takara</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM סרום מופחת בינוני</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>עלי גלולה (ללא RNase, חד פעמי)</td><td>פישר</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, (100x penn-strep)</td><td>קורנינג</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>פוספט תמיסת מלח חוצצת (PBS), 10x</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין חזיר, סוג IX-S</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T0303</td><td></td></tr><tr><td>PureYield פלסמיד Miniprep מערכת</td><td>Promega</td><td>A1223</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen פלסמיד מקסי ערכת</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen פלסמיד מידי ערכת Qiagen</td><td></td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep ספין Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>SA11 pT7 וקטורי שעתוק</td><td>Addgene</td><td>89162-89172</td><td></td></tr><tr><td>SA11 pT7/NSP3 וקטורי שעתוק המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים</td><td></td><td></td><td>איש קשר: jtpatton@iu.edu</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50000</td><td>לאלקטרופורזה של ג'ל</td></tr><tr><td>SeaPlaque agarose</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>לבדיקת</td></tr> <tr><td>פלאקSuperscript III ערכת RT-PCR חד-שלבית</td><td>Invitrogen</td><td>12574-035</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4270</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Llot Turbo</td> Transfer System <td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LTI Transfection Reagent</td><td>Mirus</td><td>MIR2306</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine-SDS ג'ל מאגר ריצה (10x)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0772</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X 100</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>טריזול ריאגנט מיצוי RNA</td><td>אמביון</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>קורנינג</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין (0.05%)-EDTA (0.1%) איכות תמיסת דיסוציאציה של תאים</td><td>ביולוגית</td><td>118-087-721</td><td></td></tr><tr><td>מרק טריפטוז פוספט</td><td>ג'יבקו</td><td>18050-039</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>VWR</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>Vertrel VF ממס</td><td>Zoro</td><td>G0707178</td><td></td></tr><tr><td>Zoe Fluorescent Live Cell Imager</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי

Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins

Rotaviruses הם אוכלוסייה גדולה ומתפתחת של וירוסים כפולה ומקוטע של RNA הגורמות לדלקת במעיים חמורה בצעירים של מינים רבים ומארחים העופות, כולל בני אדם. עם הופעתו האחרונה של רוטוירוס גנטיקה הפוכה מערכות, זה הפך להיות אפשרי להשתמש מוטגנזה מכוונת כדי לחקור ביולוגיה רוטוירוס, לשנות ולמטב את הקיימים חיסונים רוטוירוס, ולפתח רוטוירוס רב היעד וקטורים החיסון. בדו ח זה, אנו מתארים מערכת גנטית הפוכה פשוטה המאפשרת התאוששות יעילה ואמינה של רקומביננטי rotaviruses. המערכת מבוססת על שיתוף הפעולה של T7 וקטורים המבטאת באורך מלא רוטוירוס (+) rnas ו-cmv קידוד וקטור האנזים הסגירה לתוך התאים bhk מכונן לייצר T7 RNA פולימראז (bhk-T7). רקומביננטי rotaviruses הם מוגברת על ידי זריעת יתר של תאים BHK-T7 מזוהמים עם תאים MA104, תא כליות קוף קו כי הוא מאוד מתירני עבור צמיחת וירוסים. בדו ח זה, אנו מתארים גם גישה ליצירת רקומביננטי rotaviruses המבטאים חלבון נפרד העיתונאי פלורסנט באמצעות המבוא של האלמנט להפסיק להפעיל מחדש באמצעות translational לקטע הגנום 7 (NSP3). גישה זו נמנעת ממחיקה או שינוי של כל מסגרות קריאה ויראלי פתוח, ובכך לאפשר ייצור של רקומביננטי rotaviruses השומרים חלבונים נגיפי פונקציונלי באופן מלא תוך הבעת ביטוי חלבון פלורסנט.

הפרוטוקול הגנטי הפוך המתואר במאמר זה ההכנסות דרך מספר שלבים מובחנת: (1) שיתוף הפעולה של תאים bhk-T7 עם וקטורים שעתוק רוטוירוס pT7 ו pcmv/NP868R ביטוי פלאמאמצע, (2) זריעת יתר של תאים מזוהמים bhk-T7 עם MA104 תאים, (3) הגברה של רקומביננטי וירוסים הנמצאים bhk-T7/MA104 תאים lysates באמצעות תאים MA104, ו (4) פלאק בידוד של רקומביננטי וירוס באמצעות תאים MA104 (איור 2). בידינו, הפרוטוקול הוא יעיל, מניבים מניב של רקומביננטי wildtype SA11 וירוס (rSA11/wt) ב BHK-T7/MA104 תאים lysates של ~ 104...

הדור של רקומביננטי rotaviruses מ-DNA פלאמיד מספק כלי חיוני לחקר שכפול rotaviruses ו פתוגנזה, ופיתוח של וקטורים rotaviruses ביטוי וחיסונים. להלן, אנו מתארים גישה גנטית הפוכה פשוטה ליצירת רקומביננטי rotaviruses, כולל זנים המבטא חלבונים כתבת פלורסנט.

מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי Rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי

Rotaviruses are a large and evolving population of segmented double-stranded RNA viruses that cause severe gastroenteritis in the young of many mammalian ...

פרוטוקול זה מתאר מערכת גנטיקה הפוכה אמינה ויעילה להכנת rotaviruses רקומביננטי. זה גם מסביר איך לעשות rotaviruses רקומביננטי לבטא חלבונים סמן פלואורסצנטי. שיטה זו היא פשוטה הדורשת מספר מינימלי של פלסמידים והוא יכול ליצור rotaviruses רקומביננטי לבטא חלבוני פלואור נפרדים, כמו גם חלבונים ויראליים.התחל על ידי זריעת תאי BHKT7 על לוחות 12 באר. יש לשטוף מונוליאר טרי של תאים עם PBS. לאחר מכן לשבש את monolayer עם פתרון טריפסין-EDTA ו resuspend התאים בחמישה מיליליטר של GMEM להשלים מדיום.קבע את הריכוז של תאי BHKT7 בני קיימא באמצעות כחול טריפאן ודלפק תאים אוטומטי. ואז זרע פעמיים 10 לתאים החמישיים במיליליטר אחד של GMEM לתוך כל באר של צלחת תרבות תאים 12 באר. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%פחמן דו חמצני לילה.למחרת, הכינו את תערובת הפלסמיד לתרגום בהתאם לכיווני כתב היד. לאחר מכן מוסיפים 110 מיקרוליטרים של מדיום סרום מופחת מחומם מראש לכל תערובת פלסמיד ובעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. מוסיפים לתערובת 32 מיקרוליטרים של רגנט טרנספיקציה.לעשות צנטריפוגה קצרה בעקבות מערבולת דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. בינתיים, לשטוף את התאים BHKT7 עם שני מיליליטר של GMEM בינוני שלם. מוסיפים מיליליטר אחד של SMEM בינוני שלם לכל באר ומחזירים את הצלחת לאנקובטור.לאחר הדגירה של 20 דקות, השתמש בצינור 200 מיקרוליטר כדי להוסיף את תערובת ההטעה טיפה אחר טיפה לכל באר. מטלטלים בעדינות את הצלחת ומחזירים אותה לאנקובטור. יומיים לאחר ההמרה, יש לשטוף מונוליאר טרי של תאי MA104 עם PBS.לשבש את monolayer עם פתרון טריפסין-EDTA ו resuspend התאים בחמישה מיליליטר של אמצעי DMEM להשלים. לספור את התאים ולהתאים את הריכוז עד שמונה פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר של בינוני DMEM שלם. הוסף 0.25 מיליליטר של תאי MA104 dropwise ל הבארים עם תאי BHKT7 מנומרים.התאם את ריכוז הטרפסין ל- 0.5 מיקרוגרם למיליליטר על-ידי הוספת 0.8 מיקרוליטר למיליגרם אחד למיליליטר של פתרון מלאי טריפסין לכל באר. לדלל את התאים הנותרים MA104 לריכוז של 1.5 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר ב- DMEM להשלים בינוני וממקמים שני מיליליטר בכל באר של צלחת שש באר. שישה ימים לאחר ההמרה, לשחזר את הנגיף רקומביננטי מן התאים מנוקטים.נושא BHKT7 MA104 תאים לשלושה מחזורים של הקפאה / הפשרה בתנאים סטריליים, הזזת הצלחות בין מקפיא שלילי 20 מעלות צלזיוס וטמפרטורת החדר. מעבירים ליאזטים לצינורות של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הצינורות במשך 10 דקות ב 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס כדי גלולה את הפסולת התאית.לאסוף את supernatant ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס. מוסיפים טריפסין ל-100 מיקרוליטרים של ליסנט תאים מובהר לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר ומדרגים את התערובת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן הכינו סדרת דילול סדרתית של פי 10, החל מ-10 ועד לסדרה השלילית ועד לשבעה השליליים במדיום DMEM לא שלם.יש לשטוף פעמיים את המונואירים MA104 בשני מיליליטר של PBS ופעם אחת עם מדיום לא שלם של DMEM. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של דילול ליסאט כפול לצלחות ומדגרים אותן ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני, מתנדנדים כל 10 עד 15 דקות כדי לחלק מחדש את הדילולים על פני המונולר. הכינו פתרון שכבת-על של MEM על ידי שילוב של נפחים שווים של EMEM 2X מחומם מראש עם אגרוז מומס ומצונן של 1.5%.יש לשמור על פתרון זה ב-42 מעלות צלזיוס באמבט מים ולהתאים את ריכוז הטרפסין ל-0.5 מיקרוגרם למיליליטר מיד לפני הנחתו על התאים. שאף דילול ליט מצלחת שש בארות. לאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם שני מיליליטר של מדיום שלם.הוסיפו בעדינות שלושה מיליליטר של פתרון כיסוי MEM על קוטל התאים בכל באר. אפשרו לתעוררות להתקשות בטמפרטורת החדר. ואז להחזיר את הצלחות לאנקובטור.שלושה ימים לאחר מכן, הכינו פתרון שכבת-על של MEM כפי שתואר קודם לכן והוסיפו אדום ניטרלי לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר מיד לפני השימוש. הוסף שני מיליליטר של פתרון כיסוי על גבי agarose הקיים בצלחות שש באר. אפשר את agarose להקשיח ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור, הקפד להגן על הצלחות עם אדום ניטרלי מפני אור.במהלך שש השעות הבאות, לזהות לוחות rotavirus בעזרת תיבת אור. השתמש פיפטים העברה חד פעמית כדי לבחור לוחות מוגדרים בבירור, שחזור תקעים agarose המשתרעים באופן מלא לשכבת התא. לגרש את התקע לתוך צינור 1.5 מיליליטר המכיל 0.5 מיליליטר של DMEM בינוני שלם מערבולת המדגם במשך 30 שניות.הגבר את הווירוס מבודד פלאק eluted לתוך המדיום על ידי התפשטות על MONOLAYERS MA104 או בקבוק AT25 עם בינוני DMEM שלם ו 0.5 מיקרוגרם למיליליטר של טריפסין. הוסף 600 מיקרוליטרים של ליזטים תאים נגועים ברורים ו 400 microliters של תיוצ'יאנט guanidinium לתוך 1.5 צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר. מערבולת אותם במשך 30 שניות ו דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של כלורופורם. Vortex הפתרון במשך 30 שניות ו דגירה אותו במשך שלוש דקות. לאחר מיקרוצנטריפוגה של חמש דקות ב 13, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס, להעביר 550 microliters של השלב המימי העליון לתוך צינור טרי.מוסיפים שתי כמויות של אלכוהול isopropyl קר להפוך את הצינור ארבע עד שש פעמים. הדגירה את המדגם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. ואז צנטריפוגה זה במשך 10 דקות ב 13, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס.השלך את העל-טבעי והשאיר את גלולת הרנ"א. לשטוף את ה-RNA על ידי הוספת מיליליטר אחד של 75% אתנול לצינור היפוך זה פעם אחת צנטריפוגה אותו במשך חמש דקות ב 7, 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת אתנול בזהירות, לאפשר RNA לאוויר יבש במשך חמש עד 10 דקות.ואז להמיס את גלולה ב 15 microliters של מים חופשיים גרעין. הוסף שני מיקרוליטרים של מאגר טעינת DNA 6X ל 10 microliters של מדגם RNA מומס. טוענים אותו על ג'ל מיני פוליאקרילמיד 10% יצוק מראש.פתור את ה- RNAs על-ידי אלקטרופורזה במאגר הריצה של טריס-גליצין למשך שעתיים תחת זרם קבוע של 16 מיליאמפר. לאחר ריצת הג'ל הושלמה, להשרות את הג'ל במשך חמש עד 10 דקות במים המכילים מיקרוגרם אחד לכל ברומיד אתידיום מיליליטר ולזהות את מקטעי הגנום rotavirus עם טרנסילומינטור UV. פרוטוקול גנטיקה הפוכה זה שימש ליצירת וירוסי SA11 רקומביננטיים שניתן לזהות בקלות עם בדיקה פלאק על תאי MA104 המאפשר בידוד פלאק.הגנומים dsRNA של רובד מטוהר rSA11 סוג הבר ווירוסי SA11-UnaG חולצו עם פתרון המכיל פנול ו- guanidinium thiocyanate, נפתר על ידי אלקטרופורזה על ג'ל פוליאקרילמיד 10%, זוהה על ידי כתמים עם אתידיום ברומיד. כצפוי, קטע שבע או NSP3 dsRNA של rSA11-UnaG היגר הרבה יותר איטי מזה של סוג הבר rSA11 בשל נוכחות של רצפי 2A-3xFLUnaG. כדי לבדוק את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי UnaG, תאי MA104 היו נגועים בסוג הבר וירוס רקומביננטי ונבדק עם דימוי תא חי.הניתוח הראה כי rSA11-UnaG הפיק פלואורסצנטיות ירוקה בעוד לא זוהתה פלואורסצנטיות בתאים נגועים בסוג הבר rSA11. ניתוח Immunoblot בוצע כדי לחקור אם אלמנט 2A של rSA11-NSP3-2A-xflUnaG קידם את הביטוי של שני חלבונים נפרדים. הניתוח הראה כי NSP3-2A ו 3xFL-UnaG אכן באו לידי ביטוי חלבונים נפרדים המציין אלמנט 2A פונקציונלי.להתאוששות מוצלחת של rotavirus רקומביננטי, זה קריטי להשתמש בתאי BHKT7 איכותיים ומתוחזקים היטב עבור transfection ותאי MA104 עבור זריעת יתר, כמו גם כמויות מדויקות של פלסמידים טהורים מאוד. למרות פרוטוקול זה מסביר כיצד להשתמש במערכת גנטיקה הפוכה כדי לשנות את הגן rotavirus NSP3, אותה גישה יכולה לשמש כדי לשנות גנים אחרים כגון SP1.

simplified-reverse-genetics-method-to-recover-recombinant-rotaviruses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מערכת גנטיקה הפוכה עבור זן בקעת נגיף קדחת-12 MP החיסון הוא כלי שימושי ליצירת נוספים MP-12 מוטנטים עם הנחתה מוגברת immunogenicity. אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לייצר ולאפיין שמוטציות NSS.

באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג&#39;ין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות

כאן אנו מתארים את פרוטוקול מבוסס רק על זיהום התא, אשר משפר את יעילות הייצור parvovirus רקומביננטי ידי קיפול יותר מ 100 לעומת פרוטוקולים אחרים בשימוש. פרוטוקול זה מתבסס על שימוש adenovirus רומן 5 מבוסס עוזר המכיל סמנכ"ל parvovirus שעתוק יחידה (Ad-VP).

ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

פרוטוקול מהיר ומודולרי ליצירת וירוסי חיסון רקומביננטיים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים בו זמנית בשיטת הבחירה הדומיננטית החולפת מתואר כאן.

מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקולה קטן.

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

וירוס Vaccinia (VV) כבר בשימוש נרחב במחקר ביו ושיפור בריאות האדם. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה, מאוד לערוך את הגנום VV באמצעות מערכת CRISPR-Cas9.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

אנו מתארים שיטה ליצירת, הגברה גנטית שונה וירוסים syncytial הנשימה (RSVs) ואת וזמינותו של פלאק ממוטב עבור RSVs. אנו ממחישים לפרוטוקול זה על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לאפשר כימות של שכפול RSV ולחיות ניתוח של RSV הכללה וגופי בגרגרים הכללה גופים הקשורים דינמיקה.

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

זוהי שיטה להפקת וירוסים "להוריד" רקומביננטי vaccinia באמצעות בחירה בטווח המארח וזיהוי חזותי של רקומביננטי וירוסים.

דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי Poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית

פרוטוקול זה מתאר את הדינמיקה של זיהומים נגיפיים באמצעות לוציפראז ופלואורסצנציה המבטאת רקומביננט (r)SARS-CoV-2 ומערכות הדמיה in vivo (IVIS) בעכברים מהונדסים K18 hACE2 כדי להתגבר על הצורך בגישות משניות הנדרשות לחקר זיהומי SARS-CoV-2 in vivo.

הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי בעכברים מהונדסים K18 hACE2 באמצעות דיווח-מבטא רקומביננטי SARS-CoV-2

הפרוטוקול מתאר שיטה להחדרת מגוון גנטי נשלט בגנום נגיף הפטיטיס C על ידי שילוב סינתזת RNA מוטנטית באורך מלא באמצעות PCR נוטה לשגיאות וגנטיקה הפוכה. השיטה מספקת מודל לבחירת פנוטיפ וניתן להשתמש בה עבור גנומים ארוכים של 10 קילובייט של נגיף RNA בעל חוש חיובי.

גנטיקה הפוכה כדי להנדס וריאנטים של נגיף RNA בעל חוש חיובי

למד שיטת גנטיקה הפוכה ליצירת רוטווירוסים רקומביננטיים המביעים חלבונים פלואורסצנטיים ב-BHKT7. שיטה זו מפשטת מחקר וירולוגי ופיתוח חיסונים.

מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי Rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי

גלה סרטונים נוספים