Name: יישום של מיקרוסקופ כוח אטומי כדי לזהות אוסטיאוארתריטיס מוקדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: חקור זיהוי מוקדם של אוסטיאוארתריטיס ברקמת סחוס מפרקי באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. שיטה זו מודדת אלסטיות מקומית ללא פגיעה בדגימה ומסייעת בהערכת ניוון רקמתי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למחברים שלנו מהפרסום המקורי לעזרתם ולתמיכתם.

<ol><li>Guilak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pericellular+matrix+as+a+transducer+of+biomechanical+and+biochemical+signals+in+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).</li>
<li>Peters, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protective+role+of+the+pericellular+matrix+in+chondrocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).</li>
<li>Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+the+native+chondrocyte+pericellular+matrix+results+in+significantly+improved+matrix+production%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production.</a> Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).</li>
<li>Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li>
<li>Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontally+oriented+clusters+of+multiple+chondrons+in+the+superficial+zone+of+ankle%2C+but+not+knee+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage.</a> The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).</li>
<li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+preclinical+osteoarthritis%3A+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li>
<li>Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progressive+use+of+atomic+force+microscopy+in+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).</li>
<li>Polini, A., Yang, F. Physicochemical characterization of nanofiber composites. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPolini%2C+A+%22Nanofiber+Composites+for+Biomedical+Applications%22">Nanofiber Composites for Biomedical Applications</a>. Ramalingam, M., Ramakrishna, S. , Woodhead Publishing. Cambridge, UK. 97-115 (2017).</li>
<li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+biomechanical+properties+of+the+extracellular+and+pericellular+matrix+and+their+interconnection+throughout+the+course+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis.</a> Journal of Biomechanics. 97, 109409(2019).</li>
<li>Danalache, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+stiffness+and+biochemical+composition+of+the+pericellular+matrix+as+a+function+of+spatial+chondrocyte+organisation+in+osteoarthritic+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).</li>
<li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft%2C+inhomogeneous+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).</li>
<li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts%2C+chondrocytes%2C+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).</li>
<li>Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+articular+cartilage+covered+by+the+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).</li>
<li>Choi, A. P., Zheng, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+Young%27s+modulus+and+Poisson%27s+ratio+of+soft+tissue+from+indentation+using+two+different-sized+indentors%3A+finite+element+analysis+of+the+finite+deformation+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Biological+Engineering+Computing%22%5BJournal%5D)">Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect.</a> Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).</li>
<li>Jin, H., Lewis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Poisson%27s+ratio+of+articular+cartilage+by+indentation+using+different-sized+indenters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

באמצעות AFM כטכניקה חדשנית ורבת עוצמה כדי למדוד את התכונות הביומכאניות של חומרים ביולוגיים ברמת ננו-סקאלה, מדדנו את התכונות האלסטיים של ECM ו-PCM בסחוס הגוף האנושי האוסטאופתית. דגימות סחוס נבחרו על פי דפוס מרחבית השולט שלהם של הארגון כchondrocyte כגון התמונה מבוססת ביואריקר עבור ניוון רקמות מקומיות. כצפוי, ירידה חזקה בערכי האלסטיות של ECM ו-PCM נצפתה לאורך מתארגנות כונדרוציט מרחבית. תצפיות אלה מדגישים בבירור כי הסטיות בהסדר המרחבי של כונדרוציטים לא היו קשורות רק לשינויים בתכונות האלסטיים של המיקרו-סביבה התאית (PCM), אלא ...

הסחוס הנמק העצם. הוא רקמה מיועלת כונדרוציטים בדלילות לייצר, לארגן, ולשמור על מטריצה החילוץ ולקיבולת (ECM) שאליו הם מוטבעים. כחלק ברור ומיוחד של ECM, כונדרוציטים מוקפים בשכבה דקה של מטריצה מיוחדת המכונה מטריצה הפראיסלנדי lular (PCM). ה-PCM משמש ממשק מטריצות של מטריצת תאים1 המגן על כונדרוציטים2 ומודול התגובה הביוסינתטית שלהם3. כפי שתוארה בעבר4, ב סחוס בריא, כונדרוציטים מסודרים דפוסים ספציפיים, ברורים מרחביים, כי הם ספציפיים עבור כל שכבת רקמה משותף4,5 ותלוי במנגנון משותף ספציפי הטעינה מכני6. דפוסים אלה משתנים מזוגות ומיתרים בסחוס בריא כדי כפול מחרוזות עם תחילתה של אוסטיאוארתריטיס (OA). עם התקדמות נוספת של המחלה כונדרוציטים הטופס אשכולות קטנים, הגדלת בהדרגה בגודל לאשכולות גדולים OA מתקדם. אובדן מוחלט של כל מבנה ארגוני אינדוקציה של אפופטוזיס הוא נצפה בסוף השלב OA. כך, הסדר הסלולר כchondrocyte יכול לשמש כסמנים מבוססי תמונה עבור התקדמות OA4.
תכונות ביומכאניות של תאים ורקמות לא רק לווסת את צורתם ואת התפקוד אלא גם חיוני לשמירה על החיוניות שלהם. שינויים אלסטיות יכול להפיץ או להפעיל את תחילתה של מחלות גדולות כמו סרטן או OA. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התפתחה ככלי רב-עוצמה לאפיון ולכימות המאפיינים הביומכאניות של מבני יעד ביולוגיים ספציפיים בקנה מידה מיקרוסקופי, מדידת מגוון רחב של כוח, מ piconewton ל מיקרוקטון. היישום העיקרי של AFM הוא למדוד את הטופוגרפיה פני השטח ותכונות מכניות של דגימות ברזולוציה subnanometer7. התקן המדידה כולל שלושה מרכיבים עיקריים: 1) בדיקה AFM, שהיא עצה חדה הנטענת על הזיז ומשמשת לאינטראקציה ישירה עם פני השטח של המדגם. כאשר הכוח מוחל על הזיז, העיוות של האחרון מתרחש על פי המאפיינים של רקמת נמדד. 2) מערכת אופטית המשעלת קרן לייזר על הזיז, המשתקף לאחר מכן ליחידת מגלאי. 3) גלאי פוטודיודה התופס את האור החוצה מהזיז. הוא ממיר את המידע שהתקבל על הסטה לייזר על ידי הזיז לתוך עקומת כוח שניתן לנתח.
לפיכך, העיקרון העיקרי של AFM הוא גילוי של הכוח הפועל בין הבדיקה AFM ואת מבנה היעד של המדגם. עקומות הכוח השיגו לתאר את התכונות המכאניות של מבני היעד על פני השטח לדוגמה כמו גמישות, הפצת הטעינה, מגנטיזציה, מתח התשואה, ואת עיוות פלסטיק אלסטי הדינמיקה8. יתרון חשוב של AFM על טכניקות דימות אחרות היא כי AFM ניתן להשתמש כדי למדוד את התכונות המכאניות של תאים חיים בינונית או רקמות במצב מקורי מבלי לפגוע ברקמה. AFM יכול לפעול הן בתנאי נוזלי או יבש. אין דרישה להכנה לדוגמא. AFM מספק את האפשרות לדמות דגימה ולמדוד את תכונותיו המכאניות בו זמנית בדגימות הסמוכות לתנאים פיזיולוגיים. במחקר הנוכחי אנו מתארים גישה הרומן להעריך התקדמות OA על ידי מדידת האלסטיות של ה-PCM ו ECM בסחוס מקורי המתאר. המתאם של הארגון המרחבי של כונדרוציטים עם מידת ניוון רקמות מקומיות מספק פרספקטיבה חדשה לחלוטין לגילוי מוקדם של OA. עם זאת, הרלוונטיות הפונקציונלית של תבניות אלה לא הוערכו עד כה. מכיוון שתפקידה העיקרי של הסחוס הראשי הוא טעינת הנושאת בחיכוך נמוך, הרקמה חייבת להיות בעל תכונות אלסטיים. AFM מאפשר למדוד לא רק את האלסטיות של ECM אלא גם של דפוסי הסלולר מרחבי מוטבע ב-PCM שלהם. המתאם הנצפה של אלסטיות עם שינוי דפוס מרחבי של כונדרוציטים הוא כל כך חזק מדידת אלסטיות לבד יכול לאפשר ריבוד של ניוון רקמות מקומיות.
אלסטי מודולים של ה-PCM ו ECM העריכו בסעיפים 35 μm-דק באמצעות מערכת AFM משולב לתוך מיקרוסקופ לעומת שלב הפוכה שאיפשר ויזואליזציה סימולטני של דגימת הסחוס. פרוטוקול זה מבוסס על מחקר כבר פורסם מהמעבדה שלנו9 ובמיוחד מתאר כיצד לאפיין את ההסדר המרחבי של כונדרוציטים וכיצד למדוד את האלסטיות של ה-PCM שלהם ו-ecm הקשורים. עם כל שינוי דפוס של כונדרוציטים, שינויים משמעותיים אלסטיות יכול גם להיות נצפתה הן PCM ו-ECM, המאפשר טכניקה זו כדי לשמש ישירות למדוד את השלב של ניוון של הסחוס.
גישה זו מאומתת פותחת דרך חדשה להערכת התקדמות OA והשפעות טיפוליות בשלבים המוקדמים לפני השפלה רקמות מאקרוסקופי למעשה מתחיל להופיע. ביצוע מדידות AFM באופן עקבי הוא תהליך מפרך. בפרוטוקול הבא נתאר כיצד להכין את המדגם שנמדד על ידי AFM, כיצד לבצע את מדידות AFM בפועל החל בהכנת הזיז, כיצד לכייל את ה-AFM, ולאחר מכן כיצד לבצע את המידות. הוראות שלב אחר שלב נותנות גישה ברורה ותמציתית כדי לקבל נתונים אמינים ולספק אסטרטגיות בסיסיות לעיבוד ולפענוח זה. סעיף הדיון מתאר גם את החסרונות הנפוצים ביותר של שיטה קפדנית זו ומספק עצות מועילות לפתרון בעיות.

<table><tbody><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>Merck</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM)</td><td>CellHesion 200, JPK Instruments, ברלין, גרמניה</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>ראש AFM</td> <td>(CellHesion 200) JPK</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>דבק דגימה תואם ביולוגית</td><td>JPK Instruments AG, ברלין, גרמניה</td><td>H000033</td><td></td></tr><tr><td>שלוחה</td><td>טיפ C, k ו-frac14; 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, חיישני תקציב, סופיה, בולגריה</td><td>AIO-TL-10</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco, Life Technologies, דרמשטדט, גרמניה</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך (משולב עם AFM)</td><td>AxioObserver D1, מיקרוסקופיה של קרל זייס, יינה, גרמניה</td><td>L201306_03</td><td></td></tr><tr><td>מדיום L-15 של לייבוביץ ללא L-גלוטמין</td><td>(Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניה)</td><td>F1315</td><td></td></tr><tr><td>Microspheres</td><td>Polysciences</td><td>07313-5</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>מחמם כלים פטרי הקשור ל-AFM</td><td>JPK Instruments AG, ברלין, גרמניה</td><td>T-05-0117</td><td></td></tr><tr><td>נוצת</td><td>אזמל</td><td>2023-01</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית רקמות</td><td>TPP טכנו מוצרי פלסטיק AG, Trasadingen, Switzerland</td><td>TPP93040</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn (הולנד</td>) <td>SA6255012</td><td></td></tr></tbody></table>

יישום של מיקרוסקופ כוח אטומי כדי לזהות אוסטיאוארתריטיס מוקדם

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

תכונות ביומכאניות של תאים ורקמות לא רק לווסת את צורתם ואת התפקוד אלא גם חיוני לשמירה על החיוניות שלהם. שינויים אלסטיות יכול להפיץ או להפעיל את תחילתה של מחלות גדולות כמו סרטן או אוסטיאוארתריטיס (OA). המיקרוסקופיה של הכוח האטומי (AFM) התפתחה ככלי חזק לאיכות ולכימות המאפיינים את התכונות הביומכאניות של מבני יעד ביולוגיים ספציפיים בקנה מידה מיקרוסקופי, כוחות מדידה בטווח מ קטן כמו piconewton אל מיקרואוטון. תכונות ביומכאניות הן בעלות חשיבות מיוחדת ברקמות שריר השלד, אשר חשופים לרמות גבוהות של מתח. OA כמחלה ניוונית של הסחוס תוצאות השיבוש של המטריצה הפראיסלנדי lular (PCM) ואת הסידור המרחבי של כונדרוציטים מוטבע מטריצה החילוץ שלהם (ECM). שיבוש PCM ו ECM כבר שויך שינויים בתכונות הביומכאניות של סחוס. במחקר הנוכחי השתמשנו AFM לכמת את השינויים האלה ביחס השינויים דפוס מרחבית ספציפיים של כונדרוציטים. עם כל שינוי דפוס, שינויים משמעותיים אלסטיות נצפו עבור ה-PCM ו-ECM. מדידת האלסטיות המקומית ובכך מאפשרת רישום מסקנות ישירות על מידת ניוון רקמות מקומיות OA.

לאורך המודל הphysiopathological ממחרוזות למחרוזות כפולות, קטן ולבסוף לאשכולות גדולים, הן ECM (איור 3A) ו-PCM (איור 3a) אלסטי מודולים ירד באופן משמעותי בין כל שינוי דפוס. החריג היחיד היה ההבדל ב-ECM בין מחרוזות למחרוזות כפולות (p = 0.072). התוצאות מראות כי יחס ECM/PCM (איור 4B) לא השתנה באופן משמעותי, ואילו ירידה מסומנת בהבדלים המוחלט באלסטיות בין ecm ו-PCM נצפתה (איור 4b). יתרה מזאת, התוצאות אינן מציגות...

אנו מציגים שיטה לחקור שינויים אוסטאופתית מוקדם ברמה התאית בסחוס הפרקולריות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

המאפיינים הביומכניים של תאים ורקמות מווסתים את תפקודם וחיוניותם. AFM מאפשר כימות מוקדם של דלקת מפרקים ניוונית ברמה התאית המבוססת על מדידות גמישות. AFM מאפשרת רכישת מדידות ברמה התאית מבלי לפגוע בדגימה וברזולוציה גבוהה, אמינות ורגישות.שינויים במאפיין הביומכני מתרחשים בשלב מוקדם של דלקת מפרקים ניוונית. מדידת הגמישות המקומית של סחוס פרקי מאפשרת להסיק מסקנות תקפות על מידת ניוון הרקמות המקומיות. כדי להעריך שינויים ניווניים בתוך מפרק הברך האנושית, השתמש תחילה באזמל כדי לחתוך את הסחוס המפרקי ככלל מהעצם התת-כולנדראלית ולהטביע את דגימת הסחוס במדיום הטבעה מסיס במים על ידית Cryotome המקפיאה בטמפרטורה נמוכה במכשיר Cryotome.כאשר המדגם קפא, השתמש Cryotome סטנדרטי לרכוש 35 חלקים עבים מיקרומטר של רקמה מהשכבה העליונה ביותר של הסחוס המחשוף, איסוף כל קטע על מגלשות זכוכית בודדות. כאשר כל החלקים הושגו, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים PBS טרי במשך חמש דקות לכל לשטוף כדי להסיר את מדיום הטבעה מסיס במים. הסר את השקופית הראשונה מהכביסה.לאחר מכן, הוסיפו שתיים עד שלוש טיפות של דבק מדגם תואם ביולוגית לכל קטע למנות פטרי בודדות תואמות AFM. הסר כל פתרון עודף מהדגימה ולחץ בעדינות על קצות החלק המיובש על כתמי הדבק. לאחר שתי דקות, מכסים בזהירות את הרקמות המוקשרות במדיום L-15 של ליבוביץ ללא L-גלוטמין ומציבים את הכלים ב חממה לתרבות התאים עד שיש לנתח את הדגימות.כדי להכין את מכשיר ה-AFM, התאימו את גוש הגז למדידה בסביבה נוזלית במחזיק ה-AFM כך שהמשטח העליון מקביל למחזיק, ולהשתמש בפינצטה כדי להרכיב בזהירות את הקן שנבחר על פני השטח של בלוק הזכוכית, כך שטיפ ה-AFM עם המיקרוספרה בולט מעל המישור האופטי המלוטש. כדי לייצב את cantilever על בלוק הזכוכית, להחליק את הקפיץ המתכתי לתוך החריץ של הבלוק, ולהשתמש פינצטה כדי להדק את החלק העליון של cantilever עם המעיין. בזהירות למקם את בלוק הזכוכית עם cantilever על ראש AFM ולאבטח את הבלוק עם מנגנון הנעילה המשולב.לאחר מכן הר את ראש AFM עם cantilever על המכשיר AFM עם האביב פונה שמאלה. כדי להרכיב את הדגימה על מכשיר AFM, מניחים את צלחת פטרי מדגם על מחזיק מדגם AFM ולהגדיר את תנור צלחת פטרי ל 37 מעלות צלזיוס. לאחר כ- 20 דקות, פתח את תוכנת ההתקן ואת יישור הלייזר ואת חלונות הגדרת הפרמטרים של הגישה.לאחר מכן, הפעל את מנוע הצעד, את אור הלייזר ואת מצלמת CCD ולהשתמש בפונקציית מנוע צעד כדי להוריד את cantilever ב 100 צעדים מיקרומטר עד cantilever שקוע לחלוטין במדיום. השתמש בברגים הכוונון כדי לכוון את הלייזר על גבי cantilever ולהשתמש ברגים התקן AFM כדי להתאים את קרן הלייזר, כך הקרן משתקף נופל על מרכז photodetector. לאחר שהלייזר הותאם, התאימו את הפוטודקטור לפי הצורך כדי להגדיר את אות הסכום לוולט אחד ומעלה ואת ההטיות הצדדיות והאנכיות קרוב לאפס.כדי להשיג את עקומת כוח הכיול, הפעל גישת סורק עם פרמטרי הגישה כפי שמצוין בטבלה. לאחר התחתית של צלחת תרבות הרקמה הוא הגיע, לסגת cantilever על ידי 100 מיקרומטר. הגדר את פרמטרי הריצה כפי שצוין בטבלה.ולחץ על הפעל כדי להתחיל מדידה ולקבל עקומת מרחק כוח כיול. עקומת הכוח מתקבלת כפי שמודגם באיור. בעקומות המרחק של כוח הכיול, בחר את האזור לקבלת התאמה ליניארית של העקומה הנשלפת.לאחר התאמה ליניארית במקום, הערכים יישמרו על ידי התוכנה. לאחר מכן, כאשר המדידות מבוצעות במדיום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הגדר את משתנה הטמפרטורה בתוכנה ל-37 מעלות כדי לחקות את התנאים הפיזיולוגיים קרוב ככל האפשר. כדי לזהות את הדפוסים המשוחחים בקטעי דגימת הסחוס, אתר וזהה את הדפוסים התאיים הספציפיים של סחוס מפרקים מהברך האוסטיאוארטריטית במיקרוסקופ ניגוד הפאזה, אשר עשויים לכלול מחרוזות בודדות המעידות על אזורי רקמה בריאים, מיתרים כפולים המעידים על תחילת ניוון רקמות, אשכולות קטנים, שהם סימנים של ניוון רקמות מתקדם, ואשכולות גדולים, המעידים על הרס רקמות סוף השלב.לאחר שזוהתה תבנית רצויה ספציפית, עבור מדידות מטריצה פריקלירית, מקם את ה- cantilever בסמיכות לתאים ולמדוד שני אתרים לכל תבנית שנבחרה לכל סוג מטריצה, תשע פעמים לכל אתר מדידה כולל גודל מדגם גדול מספיק כדי להסביר אי דיוקים אפשריים. התמקד במטריצה התאית של התבנית שיש למדוד ולתקן את עכבר המחשב בשלב זה. לאחר מכן, התמקד בבדיקה והזז את קצה הגשוש לנקודה שקודם לכן תוקנה על ידי חץ המחשב.כדי לבצע מדידות של מטריצה חוץ תאית, בחר אזור ללא תאים כלשהם ולבצע גישה ואחריה נסיגה, כך cantilever ממוקם 100 מיקרומטר מעל הרקמה. לאחר מכן לחץ על הפעל כדי להתחיל את המידות, באמצעות הפרמטר setpoint המתקבל על-ידי כיול ה- cantilever. כדי לעבד את הנתונים שהושגו, פתח תוכנה לעיבוד נתונים התואמת לנתונים המתקבלים מהתקן AFM ובחר את מודל הרסט בתוכנה לעיבוד עקומות מרחק הכוח.הגדר את יחס הפואסון ל- 0.5, את צורת הקצה כספירה ואת רדיוס הקצה ל- 12.5 מיקרומטר. לאחר שכל הפרמטרים יותאמו, התוצאות יותאמו ומודולוס של יאנג יחושב על ידי התוכנה. לאורך המודל הפיזיופתולוגי ממיתרים למחרוזת כפולה ומאשכולות קטנים עד גדולים, הן מודולי אלסטי מטריצה חוץ-תאית והן מודולי אלסטיים של מטריצה פריקלירית יורדים באופן משמעותי בין כל שינוי תבנית למעט בין מיתרים ומיתרים כפולים.בנוסף, יחס המטריצה החוץ-תאית-פריקלולרית אינו משתנה באופן משמעותי, בעוד שנצפית ירידה ניכרת בהבדלים המוחלטים בגמישות בין מטריצות חוץ-תאיות למטריצה פריסלולרית. ערכי הגמישות תלויים בתנאים שונים כגון עומק הכניסה או מאפייני הקצה של cantilever. AFM ולכן מתאים ביותר להשוואת תנאים שונים בתוך אותה התקנה ניסיונית.ככל שה-AFM מודד את הגמישות המקומית של המדגם, יש לתקן את הסעיפים במקום על מנת לאפשר מדידות מדויקות ולהימנע מנזקי ה-cantilever. כדי לנתח עוד יותר את התהליכים האחראים לשינויים בגמישות הרקמות, כימות ביוכימי של מבנה חלבונים מעניינים יכול להתבצע באמצעות כתמים מערביים או ELISAs.

application-of-atomic-force-microscopy-to-detect-early-osteoarthritis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הנוקשות של מטריקס תאיים משפיעה התנהגויות רבות של תאים חסיד. קשיחות מטריקס משתנה מרחבית ברחבי רקמה, ועוברת שינוי בתנאי מחלה שונים. כאן אנו לפתח שיטות כדי לאפיין שינויים מרחביים קשיחות ברקמה נורמלית fibrotic ריאות עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי microindentation.

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לבידוד אבי העורקים מעכבר ומדידת המודול האלסטי שלהם באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

הפרוטוקול הנוכחי יוצר שיטה קפדנית ומתוכנות לכמת של שינויים מורפולוגיים המלווים אוסטיאוארתריטיס. יישום פרוטוקול זה יכול להיות בעל ערך בניטור התקדמות המחלה והערכת התערבויות טיפוליות אוסטיאוארתריטיס.

מתוקננת הערכה היסטראורמטרית של אוסטיאוארתריטיס במודל עכבר כירורגי

מאמר מתודולוגיה זה מציג פרוטוקול מדידה כמותית בסיוע תוכנה כדי לכמת את עובי העצם התת-צ'ונדרלי היסטולוגי במפרקי הברך האוסטאוארת-דלקתיים של מורין ומפרקי הברך הרגילים כפקדים. פרוטוקול זה רגיש מאוד לעיבוי עדין ומתאים לאיתור שינויים מוקדמים בעצם התת-מפרקתית האוסטאוארתרית.

מדידה כמותית בסיוע תוכנה של עובי עצם תת-תכונדרית אוסטיאוארתרית

פרוטוקול הכניסה למיקרוסקופיה של הכוח האטומי מציע את האפשרות לנתח את תפקיד התכונות הפיזיקליות של דופן התא של תא מסוים ברקמה או באיבר במהלך גדילה רגילה או מוגבלת (כלומר, תחת גירעון מים).

מיקרוסקופיית כוח אטומי לחקר התכונות הפיזיקליות של תאי אפידרמיס של שורשי ערבידופסיס חיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שריטות המיקרובלייד המבוקרות על פני השטח של הסחוס המפרקי לאחר ערעור היציבות של ברך העכבר על ידי חיתוך הרצועה המיניסקוטיבית המדיאלית. מודל חייתי זה מציג צורה מואצת של דלקת מפרקים ניוונית (OA) המתאימה לחקר היווצרות אוסטאופיטים, אוסטאוסקלרוזיס וכאבים בשלב מוקדם.

ערעור היציבות של המניסקוס המדיאלי ושריטה הסחוס מודל מורין של דלקת מפרקים ניוונית מואצת

ניתוח נוזל סינוביאלי תחת מיקרוסקופ אור מועבר, מקוטב ומפוצה משמש להערכת האופי הדלקתי או הלא דלקתי של דגימה באמצעות צעדים פשוטים. זה שימושי במיוחד בדלקת מפרקים ניוונית כדי לזהות גבישי סידן ולזהות תת-קבוצה חמורה יותר של דלקת מפרקים ניוונית.

ניתוח נוזלים סינוביאלי לזיהוי דלקת מפרקים ניוונית

אנו מציגים גישה שלב אחר שלב לזיהוי וטיפול בבעיות הנפוצות ביותר הקשורות למיקרו-כניסות במיקרוסקופ כוח אטומי. אנו מדגימים את הבעיות המתעוררות על צמחי סחוס מפרקי אנושיים מקומיים המאופיינים בדרגות שונות של ניוון המונע על ידי אוסטאוארתריטיס.

טיפול בסוגיות מעשיות במיקרו-הזחה מבוססת מיקרוסקופיה של כוח אטומי על צמחי סחוס מפרקיים אנושיים

שחיקות עצם הן תכונה פתולוגית חשובה של דלקת מפרקים שגרונית. מטרת עבודה זו היא להציג כלי הדרכה שיספק למשתמשים הדרכה לזיהוי שברים פתולוגיים בקליפת המוח בתמונות טומוגרפיה ממוחשבת כמותית היקפית ברזולוציה גבוהה לניתוח שחיקה.

זיהוי שחיקה במפרקים Metacarpophalangeal בדלקת מפרקים שגרונית באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת כמותית היקפית ברזולוציה גבוהה

בפרוטוקול זה אנו מראים כיצד להכין רקמת אקסולוטל למיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ולבצע מדידות הזחה בסחוס גפיים שלם ומתחדש.

מיקרוסקופ כוח אטומי מדידות סחוס בגפיים אקסולוטליות שלמות ומתחדשות;

פרוטוקול זה מדמיין כיצד להכין חתכים קריוגרפיים של רקמת ריאה של עכברים, לבצע ניסויים במפת כוח במיקרוסקופ כוח אטומי ולנתח את הנתונים כדי לקבוע את המודול של יאנג של קרום הבסיס הריאתי המקומי של העכבר.

חילוץ מודול הצעירים של ממברנות הבסיס הריאתיות של עכברים מקומיים ממפות כוח הנגזרות ממיקרוסקופ כוח אטומי

חקור זיהוי מוקדם של אוסטיאוארתריטיס ברקמת סחוס מפרקי באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. שיטה זו מודדת אלסטיות מקומית ללא פגיעה בדגימה ומסייעת בהערכת ניוון רקמתי.

יישום של מיקרוסקופ כוח אטומי כדי לזהות אוסטיאוארתריטיס מוקדם

גלה סרטונים נוספים