כימות האדם Norovirus וירוס כריכת כריכה של חיידקים קומנדסאל באמצעות זרימה Cy, לנסות

אינטראקציות וירוסים-חיידקיים יכולות להיות חשובות לזיהום ויראלי מוצלח ולגירוי של תגובה חיסונית מארחת. אבל נכון לעכשיו, מלאי מרוכז ומטוהר מאוד של norovirus אנושי לא יכול להיות מיוצר במעבדה. טכניקה זו יכולה לשמש עם כל וירוס שנקשר לחיידקים, שעבורם חלקיקים דמויי וירוס או וירוס חי זמינים.

זה מאפשר לנו לכמת אינטראקציות בין וירוסים וחיידקים אלה. לחסן חמישה מיליליטר של מדיום נוזלי עם מושבה מבודדת אחת של Cloacae Enterobacter מצלחת אגר ישירות ממלאי גליצרול קפוא. לגדל את החיידקים בן לילה.

למחרת, להעביר 1.3 aliquots מיליליטר של התרבות לשני צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר נפרדים. צנטריפוגה הצינורות ב 10, 000 x גרם במשך חמש דקות. הסר את supernatants, ולאחר מכן לשטוף את הדגימות פעמיים באמצעות מיליליטר אחד של PBS סטרילי 1X עבור כל לשטוף.

צנטריפוגה הדגימות שוב ב 10, 000 x g במשך חמש דקות. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 1.3 מיליליטר של PBS 1X סטרילי. החל 0.5 מיליליטר של תרבות שטף, באופן סדרתי לדלל את החיידקים ב PBS 1X מ 10 למינוס אחד עד 10 למינוס ארבע.

באמצעות ספקטרופוטומטר, למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות סחוט undiluted וכל אחד מארבעת הדילולים ב 600 ננומטר. בצע דילול סדרתי פי 10 ב- PBS 1X עבור כל אחד מהדילולים הקודמים. להפיץ 100 microliters של שלושת הדילולים האחרונים עבור כל סדרה על לוחות אגר כדי לקבוע את מספר המושבה להרכיב יחידות למיליליטר עבור כל מדגם.

אפשר לצלחות להתייבש בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. להפוך את הצלחות ולהטמם אותם באינקובטור. לאחר הכנת הראוגנטים, הנוגדנים והחיידקים כמתואר בכתב היד, הרכיבו את כל החומרים בארון BSL-2 biosafety.

חלקיקים דמויי וירוס עבור norovirus אנושי מפורטים כמו BSL-2 פתוגנים וכל העבודה לבצע באמצעות VLP צריך להתבצע ארון biosafety מוסמך. הוסף 10 מיקרוגרם של VLPs norovirus אנושי לכל צינור של חיידקים ומערבבים ביסודיות על ידי pipetting. דגירה הצינורות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב מתמיד.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה הצינורות ב 10, 000 x גרם במשך חמש דקות. שאף והשליך את העל-טבעי והתן מחדש את גלולת החיידקים במיליליטר אחד של PBS. לאחר חזרה על צעדי לשטוף פעם אחת, צנטריפוגה הצינורות שוב ב 10, 000 X g במשך חמש דקות.

השליכו את גלולת חיידקי ה-VLP ב-150 מיקרוליטרים של חיץ חסימה של 5%. שגיאה נפוצה המתרחשת היא כי צינורות מוחלפים ואת הטיפול הלא נכון מתווסף. כדי למנוע זאת, לסדר את כל הצינורות בשורות התואמות את הטיפול הנכון ולהוסיף טיפול אחד בבת אחת לצינורות.

עבור כל דגימת חיידקים, להכין 50 microliters של נוגדן NOROVIRUS GII אנושי מדולל. באמצעות חיץ חסימה של 5%, לדלל את הנוגדן 1 עד 125 עבור דגימות E.cloacae. הכינו 50 מיקרוליטרים של נוגדן isotype מדולל לכל דגימת חיידקים באמצעות אותם יחסי דילול.

חלק כל דגימת בדיקה מצורפת ל-350 מיליליטר aliquots על-ידי העברתם לצינורות צנטריפוגה נקיים של 1.5 מיליליטר. כדי ליצור פקדים שאינם נגועים, הוסף 50 מיקרוליטרים של מאגר חסימה לאליקוט הראשון מכל דגימת חיידקים. לדגימות המוכתמות, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של דילול הנוגדנים של GII לסט השני של האלקוטים.

צור את פקדי האזאוטיפים על-ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של נוגדן האזאוטיפים המדולל לקבוצה השלישית של האליקוטים. דגירה כל הדגימות על קרח ובחושך במשך 30 דקות. ואז צנטריפוגה כל הדגימות ב10, 000 X G במשך חמש דקות.

השלך את העל-טבעיים והתן מחדש כל דגימה ב- 150 מיקרוליטרים של FCSB. שוב, צנטריפוגה כל הדגימות ב10, 000 X G במשך חמש דקות. שוב, להשליך את supernatants ולתלות מחדש את הדגימות ב 100 microliters של FCSB.

לאחר צנטריפוגה הדגימות בפעם האחרונה והשליכת supernatants, resuspend הדגימות ב 150 microliters של FCSB. העבר כל דגימה לצינור המכיל 400 מיקרוליטרים של FCSB עבור נפח כולל של 550 מיקרוליטרים. לאחסן את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס עד שהם מנותחים על ידי ציטומטריה זרימה.

קובץ מצורף VLP נמדד באמצעות ציטומטריית זרימה. ראשית, חלקות צפיפות שימשו לשער החוצה פסולת הסלולר, ואחריו העלילה נקודה הבאים gating כדי להסיר כפילויות חיידקיות גושים הסלולר. היסטוגרמות מייצגות מדגימות חוסר אות PE בדגימות חיידקיות בלבד ושינוי בעוצמת האות PE בדגימות VLP:חיידק בהשוואה לפקדים לא מזוהמים ואיזוטיפים.

לאחר שעה אחת של דגירה עם 10 מיקרוגרם של VLP, ציטומטריית זרימה זיהתה כריכת חלקיקים הן E.colacae והן L.gasseri. כדי לקבוע את המגבלה של כימות מחייב עבור מבחן זה, סדרת דילול של VLPs נוצר לפני הוספת החיידקים. הפחתות בכמות VLP גרמו הפחתות תואמות לאחוז החיידקים מאוגדים על ידי VLP.

לדעת את הנגיף:יחס חיידק ושמירה על היחס עקבי בין ניסויים חשוב בפענוח תוצאות. מוטנטים חיידקיים ויראליים יכולים להיווצר כדי לקבוע באופן ספציפי את מבני השטח המיקרוביאליים המתווים אינטראקציה זו. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לענות על שאלות לגבי נסיבות ותנאים המשפיעים על אינטראקציות norovirus-חיידקי, כולל כיצד שינויים גנוטיפ וירוס, תנאי צמיחה חיידקיים, ושינויים במבני פני השטח חיידקי לשנות מחייב ויראלי.