Name: דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי Poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: למד לייצר רקומביננטי פוקס וירוסים ללא תפר באמצעות בחירת טווח מארח וסמנים פלואורסצנטיים. שיטה זו משלבת רקומבינציה הומולוגית עם בחירה דומיננטית זמנית לשינוי וירוסים יעיל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות (AI114851) ל-SR.

1. יצירת וקטור שילוב מחדש
<ol><li>עיצוב התחל כדי ליצור את קלטת הבחירה. עיצוב כל בודד אמפליקון עם רצפים חופפים עם הגברה השכנה וקטור כדי להקל על הרכבה אנזימטית איזותרמי של מולקולות DNA, נקרא גם האסיפה גיבסון, באמצעות כל אחד מספר כלים באינטרנט פריימר עיצוב. הערה: ניתן להשלים פרוטוקול זה גם באמצעות שיטות שכפול המבוססות על הגבלה מסורתית endonuclease. במקרה כזה, עיצוב התחל עם אתרי ההגבלה המתאימים ולא עם רצפים חופפים.</li>
	<li>באמצעות התחל שתוכנן בשלב 1.1, PCR להגביר את האלמנטים הבאים על מנת 5 ' עד 3 ' (איור 1): ~ 500 נוקלאוטידים של אזור גנומית של vacv 5 ' של E3L (5 ' זרוע), egfp או הגן של עניין, ~ 150 נוקלאוטידים מן האזור הגנומי vacv מיד 3 ' של E3L (קצר 3 ' זרוע), מוקדם סינתטי/מאוחר מיזם poxvirus25, גן היתוך mcherry-E3L, ו ~ 500 נוקלאוטידים מן האזור הגנומי vacv 3 ' של E3L כולל קצר 3 ' זרוע (ארוך 3 ' זרוע<ol>
<li>בצינור PCR, להוסיף את הריאגנטים בסדר הבא עבור כל amplicon: 17 μL של DNase מים חינם, 1.2 μL של כל פריימר (ריכוז ראשוני = 10 μM, הריכוז הסופי = 0.5 μM), 5 μL של מאגר התגובה של ה-PCR 5x, תבנית DNA (10 ng עבור הגברה המוגברת מ פלמידים: egfp ו-E/L יזם-mCherry-E3L הקלטת; 100 ng עבור הגברה המוגברת של dna גנומית ויראלי: 5 ' ו-3 זרועות), 0.5 כוונן את נפח המים הנוספים עבור נפח התגובה הסופי של 50 μL. הערה: הריכוז של ה-DNA תבנית יש לקבוע באופן אמפירי, אבל אנחנו בדרך כלל מתחילים עם 10 ng/התגובה.</li>
		<li>מניחים את הצינור (s) בתוך הצנטרזה, ולהמיס את ה-DNA ב 98 ° c עבור 30, ולאחר מכן להשתמש 25 סיבובים של פרוטוקול PCR שלושה צעדים: 98 ° צ' עבור 5 s, 55 ° צ' עבור 10 s, ו 72 ° c עבור 1 דקות. הערה: לקבוע את טמפרטורת ההיתוך בהתבסס על היצרן של הציע Tm עבור כל מערכת תחל. קבע את זמן ההרחבה המתאים בהתאם לאורך של כל אמפליקון (1 דקה/kb).</li>
	</ol></li>
	<li>המחש את מוצרי הגברה על 1% ג'ל. הוסף 10 μL של כל מוצר DNA ו 2 μL של טעינת מאגר כל טוב, ולרוץ ב 8 V/cm עבור 1 h.</li>
	<li>ג'ל לטהר כל אמפליקון באמצעות ערכת החילוץ ג'ל DNA ופרוטוקול של היצרן. Elute הגברה מן העמודה על ידי הוספת 50 μL של DNase מים בחינם ומיד תפרידו.</li>
	<li>Linearize pUC19 שיבוט וקטור שימוש בעיכול Ecori endonuclease. לצינור, להוסיף 1 μg של pUC19, מים לנפח של 17 μL, 2 L של מאגר התגובה, ו 1 μL (20 יחידות) של Ecori. מודטה ב 37 ° c בשביל 1 h.<ol>
<li>המחש את מוצרי הגברה על 1% צמח ג'ל לרוץ ב 8 V/cm עבור 1 h. בלו את הלהקה מן הג, ולטהר את המוצר באמצעות ערכת החילוץ ג'ל ה-DNA כמתואר בשלב 1.4.</li>
	</ol></li>
	<li>ליגייט כל הפרט, ג'ל מטוהרים הגברה וקטור ליניאריות באמצעות ערכת ערבוב הורים.<ol>
<li>לצינור ה-PCR, להוסיף 0.2 pmol של לינpUC19 ו כל אמפליקון (5 ' זרוע, egfp, קצר 3 ' זרוע, E/L יזם-mcherry-E3L הקלטת, 3 ' זרוע). הוסף DNase מים ללא תשלום לנפח הסופי של 10 μL, ולאחר מכן להוסיף 10 μL של מיקס בסיס להרכבת DNA. מודטה דגימות ב 50 ° c בשביל 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>שינוי כימית המוסמכת E. coli עם 2 μl של המוצר המורכב משלב 1.6 כפי שמתואר בעבר26,27. צלחת 100 μL של תאים שעברו שינוי בלוחות LB agarose המכילים 100 μg/mL אמפיצילין. מודאת הצלחות לילה. ב-37 ° c</li>
	<li>בחרו מושבות מבודדות והעבירו מושבות בודדות לצינורות המכילים ציר לוריא עם 100 μg/mL אמפיצילין. מודטה את הצינורות לילה ב 37 ° צ' בעת טלטול ב 225 סל ד.</li>
	<li>לבודד את הפלסטלינה מן התרבות הלילה באמצעות ערכת המיכין פלמיד. בדוק את הריכוז והטוהר של הדנ א באמצעות ספקטרוסקופיה. יחס A260/A280 בין 1.8 ו-2.0 מקובל.</li>
	<li>הגישו את הפלמידים לרצף של סאנגר כדי לקבוע אם מוצר השכפול הרצוי נכון. אחסן את הדנ א ב-20 ° c.</li>
</ol>2. יצירת הווירוס הרקומביננטי
<ol><li>להדביק מונאולייר שוטפת של תאים מתאימים עם הווירוס להיות משולב מחדש בריבוי של זיהום של 1.0 (משרד הבית = 1.0) בצלחת 6-היטב. מודטה את התאים הנגועים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 1 h. ואז לאכול את המדיום ולהחליף אותו עם DMEM טרי. מודטה את התאים הנגועים ב 37 ° צ' ו 5% CO2. הערה: עבור וירוסים מוכשרים לשכפול כגון וירוס vaccinia חסר K3L22, קו תא כגון קו כליות הארנב האירופי RK13 (atcc #CCL-37) או תואר ראשון-40 מתאים. עם זאת, עבור וירוסים לקוי השכפול, כגון וירוס המתואר בנייר זה חסר גם PKR האנטוניסטים E3L ו K3L, קו תא משלימים המבטא שני גנים אלה טרנס או pkr להפיל או להפיל תאים נדרשים.</li>
	<li>מעבר לתאים הנגועים עם 500 ng של הווקטור שנוצר ומאומת בשלב 1.10 באמצעות מסחרי הזיהום זמין מסחרית לאחר פרוטוקול של היצרן. מודטה את התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 48 h. הערה: אם באמצעות וירוס vaccinia חסרים הן E3L ו K3L, לחץ סלקטיבי PKR-תיווך יהיה לנהוג בחירה של וירוסים משולבים מחדש ולשמור על ביטוי של חלבון היתוך mCherry-E3L בתאים אלה. במידת הצורך, יש לאפשר גם ל-PCR להגביר רק את התוספת לשימוש לצורך העברה במקום את כל הפלפסנה.</li>
	<li>48 שעות לאחר זיהום, לקצור את המונאולייר הנגוע. במקרים מסוימים, התאים ניתן לקצור על ידי ליטוף, אבל אם הם עדיין חזק היטב, לקצור אותם עם מגרד התא. להקפיא את התאים שלוש פעמים, ולאחר מכן sonicate lysates עבור 15 s ב 50% משרעת. אחסן את זה ב-80 ° צ' עד מוכן לשימוש.</li>
	<li>סרילי 10-קיפול לדלל את ליפוסט שנקטפו בשלב 2.3 מ 10-1 עד 10-6 על ידי הוספת 120 μl שלlysate כדי 1080 ΜL של dmem (10-1), ולאחר מכן הוספת 120 μl של דילול זה כדי 1080 μl של dmem (10-2), וחוזר על תהליך זה ארבע פעמים נוספות הוסף 1 מ ל של כל דילול לאדם, היטב שוטפת של קו תא מוסמך PKR, במקרה זה RK13 תאים.<ol>
<li>מודטה את התאים הנגועים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 1 h. לאחר מכן ומכה את המדיום ולהחליף אותו עם מחדש DMEM התאים הנגועים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>24 עד 48 שעות לאחר זיהום, לזהות וירוסים רקומביננטי על ידי המיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שלטי רקומביננטי וירוסים לבטא פלואורסצנטית אדום בשל אינטגרציה של mCherry-E3L גן היתוך (איור 2). אם וירוס נטול מעכבי PKR נעשה שימוש בתחילה, כל הפלאק יכיל וירוס רקומביננטי.</li>
	<li>פלאק לטהר רקומביננטי וירוסים שלוש פעמים על RK13 תאים. לאחר הסיבוב האחרון של טיהור פלאק, כל הפלאק צריך לבטא את הזריחה האדומה.</li>
	<li>הדביקו את הצלחת 6-באר של תאים RK13 לבטא את מעכבי pkr E3L ו K3L (RK13 + E3L + K3L תאים28) עם מטוהרים מטוהר אדום רואה וירוס משלב 2.6. המטרה עבור כ 50-100 שלטים לכל טוב. הערה: תאים אלה מספקים את היריבים VACV PKR בטרנס ולהקל על הלחץ הסלקטיבי PKR-תיווך כדי לשמור על גן היתוך mCherry-E3L, ובכך לקדם את "להוריד" הדור של הנגיף רקומביננטי.</li>
	<li>זיהוי וירוסים מכווצים על ידי מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ EVOS2, וקוביית מסנן GFP (עירור: 470/22, פליטה: 525/50) ו קוביית מסנן RFP (עירור: 531/40, פליטה: 593/40). הערה: התדירות שבה הגן היתוך mCherry-E3L לאיבוד הוא כ 2.5% (טבלה 2). אם EGFP אינו כלול כמו גן סמן, לוחיות של וירוסים מוטציה כי איבדו את גן ההיתוך mCherry-E3L יהיה חסר צבע.</li>
	<li>פלאק לטהר ירוק בלבד (VC-4) או לוחיות צבע (E3L) שלוש פעמים על RK13 + E3L + K3L תאים. ודא שאין לוחיות שלטים אדומות.</li>
	<li>אשר את ההפסד של מE3L ונוכחותו של המוטציה הצפויה על ידי הרצף PCR ו-Sanger. הערה: אם הגן או מוטציה של עניין אין פעילות מעכבות PKR, רקומביננטי וירוסים יש לגדל על RK13 + E3L + K3L תאים או שווה ערך PKR-עכבות או קו תא לקוי PKR (איור 3).</li>
</ol>

<ol><li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li>
<li>Pastoret, P. P., Brochier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+use+of+a+vaccinia-rabies+recombinant+oral+vaccine+for+the+control+of+wildlife+rabies%3B+a+link+between+Jenner+and+Pasteur%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur.</a> Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).</li>
<li>Chan, W. M., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+Poxviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+virology%22%5BJournal%5D)">Oncolytic Poxviruses.</a> Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).</li>
<li>Nguyen, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus-mediated+expression+of+human+erythropoietin+in+tumors+enhances+virotherapy+and+alleviates+cancer-related+anemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice.</a> Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).</li>
<li>Frentzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-VEGF+single-chain+antibody+GLAF-1+encoded+by+oncolytic+vaccinia+virus+significantly+enhances+antitumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).</li>
<li>Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxviruses+as+vaccine+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Immunology%2C+Microbiology+and+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Poxviruses as vaccine vectors.</a> Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).</li>
<li>COLLIER, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+stable+smallpox+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The development of a stable smallpox vaccine.</a> The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).</li>
<li>Weir, J. P., Bajszár, G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+vaccinia+virus+thymidine+kinase+gene+by+marker+rescue+and+by+cell-free+translation+of+selected+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).</li>
<li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus%3A+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).</li>
<li>Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+vaccinia+virus%3A+demonstration+of+marker+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).</li>
<li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).</li>
<li>Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Host+Range+Selection+for+Genetic+Engineering+of+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara.</a> BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).</li>
<li>Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+Isolation+of+Recombinant+MVA%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccinia+Virus+and+Poxvirology%22%5BJournal%5D)">Construction and Isolation of Recombinant MVA.</a> Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).</li>
<li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li>
<li>Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+PKR+and+RNA+adenosine+deaminase+ADAR1%3A+New+roles+for+old+players+as+modulators+of+the+interferon+response%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).</li>
<li>Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+the+protein+kinase+PKR+to+RNAs+with+secondary+structure+defects%3A+Role+of+the+tandem+A+-+G+mismatch+and+noncontigous+helixes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes.</a> Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).</li>
<li>Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+Binding+of+the+Phosphorylated+Subunit+of+Initiation+Factor+2+%28eIF2%29+to+the+Regulatory+Subunits+of+Guanine+Nucleotide+Exchange+Factor+eIF2B+Is+Required+for+Inhibition+of+Translation+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).</li>
<li>Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+eIF2%CE%B1+kinases%3A+Adapting+translational+control+to+diverse+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+of+the+Protein+Synthesis+Machinery+and+Its+Regulation%22%5BJournal%5D)">Evolution of eIF2α kinases: Adapting translational control to diverse stresses.</a> Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).</li>
<li>Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+host+range+genes+in+poxvirus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">A survey of host range genes in poxvirus genomes.</a> Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).</li>
<li>Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3L+gene+of+vaccinia+virus+encodes+an+inhibitor+of+the+interferon-induced%2C+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).</li>
<li>Romano, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+PKR+by+vaccinia+virus+E3%3A+role+of+complex+formation+and+the+E3+N-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain.</a> Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).</li>
<li>Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus-encoded+eIF-2+alpha+homolog+abrogates+the+antiviral+effect+of+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon.</a> Virology. 183 (1), 419-422 (1991).</li>
<li>Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+inhibition+of+antiviral+protein+kinase+R+by+capripoxviruses+and+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).</li>
<li>Rothenburg, S., Brennan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-Specific+Host-Virus+Interactions%3A+Implications+for+Viral+Host+Range+and+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence.</a> Trends in Microbiology. , (2019).</li>
<li>Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact%2C+synthetic%2C+vaccinia+virus+early%2Flate+promoter+for+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression.</a> BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).</li>
<li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli%3A+Transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution+%28recombinant+DNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA).</a> Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).</li>
<li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).</li>
<li>Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myxoma+Virus+Protein+M029+Is+a+Dual+Function+Immunomodulator+that+Inhibits+PKR+and+Also+Conscripts+RHA%2FDHX9+to+Promote+Expanded+Host+Tropism+and+Viral+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication.</a> PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465(2013).</li>
<li>Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+genetic+recombination+among+cotransfected+plasmid+DNAs+in+poxvirus-infected+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells.</a> Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).</li>
<li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).</li>
<li>Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+the+viral+products+of+recombination+in+vaccinia+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+dominant+host-range+selection+using+Chinese+hamster+ovary+cells+to+generate+marker-free+recombinant+viral+vectors+from+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus.</a> BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

כאן אנו מציגים וריאציה של אסטרטגיה בחירת סמן ארעי 32 כדי ליצור וירוסים רקומביננטי vaccinia ללא שמירה על DNA זר בווירוס רקומביננטי הסופי. האסטרטגיה שלנו עושה שימוש בלחץ סלקטיבי בתיווך על ידי המארחים אנטי חלבון PKR ולא צורות אחרות של לחץ סלקטיבי כגון אנטיביוטיקה. השימוש של גנים ויראליים מארחים מבטלת את האפשרות של שינויים המושרה באמצעות כימית בתאים, או סיכון מוגבר של מוטציה בשל תרופות בחירה. יתר על כן, בניגוד לבחירת סמים, אין שלב השהיה עבור הגישה שלנו, כי PKR מתבטא באופן מכונן בכל התאים. מבחר חזותי מ...

Vaccinia וירוס (vacv) היה אינסטרומנטלי החיסול המוצלח הראשון של פתוגן אנושי, וירוס אבעבועות (varv), מן הטבע. מאז ההשמדה של וירוס אבעבועות, poxviruses כולל vacv המשיכו להיות שימושי וירוסים טיפולית עבור תרופות לבני אדם ובעלי חיים. לדוגמה, חיסון וירוס כלבת מבוסס VACV היה יעיל מאוד במניעת שידור של כלבת sylvatic באירופה1 ואת ארצות הברית2. לאחרונה, רקומביננטי poxviruses ביטוי מגוון של מולקולות נגד הגידול (g., שרשרת יחיד נוגדנים או אריתרופויאטין האדם) ראו לעודד הצלחה כסוכני oncolytic3,4,5. Vacv הוא אטרקטיבי במיוחד כמו וקטור כי זה קל מאוד מניפולציה גנטית, בעל טווח מארח רחב, והוא יציב תחת מגוון של תנאים, המאפשר הובלה קלה וכדאיות החיסון בשדה6,7. בעוד טכניקות מרובות פותחו כדי ליצור רקומביננטי VACV עבור ניסויים במעבדה הדור חיסון, אסטרטגיות נוכחיות להפקת וירוסים אלה יש מגבלות הבולטים.
בגלל השירות של VACV, אסטרטגיות מרובות כדי ליצור וירוסים רקומביננטי פותחו. האסטרטגיה הראשונה מעסיקה מחדש הומולוגי להציג קלטת כולל את הטרנסגנים ואת גן סמן לבחירה כגון גן עמידות לאנטיביוטיקה. הקלטת מוקף על ידי שני ~ 500 נוקלאוטידים (nt) או זרועות גדולות יותר הנחיית הגן לאתר מסוים בגנום ויראלי, אשר משולבים אז באופן מיוחד על ידי אירועים מוצלב כפול8,9,10. אסטרטגיה זו היא מהירה ויעילה; עם זאת, זה התוצאה חומר גנטי נוסף בצורה של הגן סמן שעשוי לייצר אפקטים בלתי צפויים. יתר על כן, יש מגבלה עליונה מעשית מספר הטרנסגנים שניתן להציג מוגבל על ידי מספר סמנים ייחודיים לבחירה זמין. אסטרטגיות בחירה שולטת (TDS) זמניות התייחסו לבעיה זו על ידי הקלה על הדור של "להוריד" רקומביננטי וירוסים11. באמצעות אסטרטגיה זו, פלסטלינה המכיל גן VACV מוטציה ו גן סמן לבחירה משולבים הגנום הנגיפי, אך ללא תוספת של ה-DNA VACV האגף. גישה זו מהווה שילוב ארעי של הפלסטיות כולו והשכפול של הגן VACV כתוצאה של שילוב של אירוע מוצלב אחד. ביניים זו יציבה כל עוד היא נשמרת תחת לחץ בחירה, תוך התרת העשרת המבנה. כאשר הבחירה מוסרת, שכפול VACV מאפשר אירוע מוצלב השני שתוצאתו הסרת הפלסמיד והיווצרות הבאים של סוג פראי (wt) או רקומביננטי וירוס ביחס 50:50 משוער. בעוד TDS מייצרת וירוסים רקומביננטי ללא צורך הקדמה יציבה של DNA זר, שיבוטים וירוסים מרובים חייב להיות מוקרן עבור מוטציה צפויה על ידי ניתוח רצף, שלב פוטנציאלי ארוך ויקר.
כאן, אנו מציגים גישה ליצירת רקומביננטי poxviruses המשלב את ההיבטים הטובים ביותר של כל אחת מגישות אלה, בדומה לגישה שתוארה עבור השכפול שונה vaccinia אנקרה12,13,14. אסטרטגיה זו משלבת טווח חזותי ומארח בחירה כדי ליצור במהירות רקומביננטי וירוסים על-ידי מוצלב אירועים כפולים, ולאחר מכן לחסל את הגן סמן לבחירה על ידי שילוב מחדש של הומוולוגי. גישה זו מאפשרת את הדור המהיר של מוטציות מתווכת על ידי שילוב הומוולוגי, עם הטבע "ללא צלקות" של גישות TDS, בעוד שאינו דורש צעד ההקרנה הבאים כדי להבחין סוג פראי ווירוסים מוטציה. השיטה שלנו גם משתמשת בבחירת טווח המארח במקום של בחירה אנטיביוטית, ביטול הסיכון של שינויי פנופאיות המושרה כימית בקו התא. עבור גישה זו, בחרנו להשתמש מארח אנטי חלבון קינאז R (PKR) כמו סוכן סלקטיבי כדי ליצור רקומביננטי VACV. PKR מבוטא כמונומר לא פעיל ברוב סוגי התאים15. באמצעות כריכה כפולה של רנ א (dsRNA) ב-N-terminal dsRNA-מתחם הכריכה, PKR והוא בתצוגה מקדימה של16. זו צורה פעילה של pkr זרחנית אלפא יחידת המשנה של הגורם החניכה איקריוטית 2 (eIF2), בסופו של דבר עיכוב מסירת מתיונין היוזם-trna ל ריבוחלק, ובכך מניעת תרגום תאיים ומעכב באופן נרחב את השכפול של משפחות וירוסים רבים17,18.
בתגובה לפעילות האנטי-ויראלית הרחבה והחזקה של PKR, וירוסים רבים התפתחו לפחות אסטרטגיה אחת כדי למנוע הפעלת PKR. רוב poxviruses לבטא שני האנטוניסטים PKR, מקודד על ידי E3L ו K3L גנים ב VACV, אשר מרגיז PKR באמצעות שני מנגנונים נפרדים19. E3 מונע pkr הומומיזציה על ידי מחייב כפול תקוע RNA20,21, בעוד K3 משמש מעכבי מדומה במצע על ידי קשירה ישירות pkr מופעל ובכך מעכב אינטראקציה עם המצע שלה eIF2α22. הדבר החשוב ביותר הוא ששני האנטניסטים האלה אינם מעכבים בהכרח את PKR מכל המינים. לדוגמה, הK3 הומולוג מנגיף הטיח מעכבות מאוד את הצאן מכבשים, ואילו הוולוג באמצעות הפלאפון E3 הומולוג לא הראה באופן משמעותי את העיכוב pkr23,24. במחקר זה, אנו מציגים שיטה להשתמש PKR-תיווך בלחץ סלקטיבי בשילוב עם בחירת הזריחה כדי ליצור רקומביננטי VACV נמחק עבור E3L ו K3L (VC-4), אשר לא יכול לשכפל בתאים המוסמכים PKR נגזר ממינים שונים. וירוס רקומביננטי זה מספק רקע מצוין עבור הדור המהיר של וירוסים רקומביננטי ביטוי גנים תחת שליטה של מקדם E3L מקורי.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492L</td><td>פולימראז בנאמנות גבוהה המשמש ב-PCR</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11593027</td><td>חומר סלקטיבי חיידקי</td></tr><tr><td>מגרדי תאים חד פעמיים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-100-242</td><td>מגרד תאים לקצירת תאים נגועים</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 2 מערכת הדמיה תאים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMAFD2000</td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube, GFP</td><td>ThermoFisher</td><td>AMEP4651</td><td>GFP Cube</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube, RFP</td><td>ThermoFisher</td><td>AMEP4652</td><td>RFP Cube</td></tr><tr><td>GenJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100489</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) מרק</td><td>Gibco</td><td>10855021</td><td>מדיום גידול חיידקים</td></tr><tr><td>ערכת</td> <td>מיצוי ג'ל DNA Monarchערכת</td> טיהור ג'ל NEB <td>T1020L</td><td>המשמשת לטיהור אמפליקונים ווקטורים ליניאריים</td></tr><tr><td>ערכת Monarch Plasmid Miniprep ערכת</td><td>NEB</td><td>T1010L</td><td>Miniprep המיועדת לטיהור פלסמידים</td></tr><tr>ספקטרופוטומטר<td>NanoDrop One</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>המשמש למדידת ריכוז RNA ו-DNA</td></tr><tr><td>NEBuilder Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td>ערכת הרכבה אנזימטית איזותרמית המשמשת ליצירת וקטור הרקומבינציה</td></tr><tr><td>Q500 Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q500-110</td><td>Sonicator לליזטים של וירוסים</td></tr><tr><td>תאי RK13</td><td>ATCC</td><td>CCL-37</td><td>תאי כליה של ארנב</td></tr><tr><td>VWR צלחות תרבית תאים Multiwell</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>צלחות תרבית תאים</td></tr></tbody></table>

דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia וירוס (VACV) היה אינסטרומנטלי וירוס בריאולה (VARV), הסוכן סיבתי של אבעבועות שחורות, מן הטבע. מאז השימוש הראשון שלה כחיסון, VACV פותחה כווקטור עבור חיסונים טיפוליים כמו וירוס oncolytic. יישומים אלה מנצלים את הגנום של VACV בקלות מניפולציה וטווח מארח רחב כפלטפורמה מצטיינים לייצר וירוסים רקומביננטי עם מגוון רחב של יישומים טיפוליים. מספר שיטות פותחו כדי ליצור רקומביננטי VACV, כולל סמן שיטות בחירה שולטת ארעי. כאן, אנו מציגים עידון של שיטת בחירת טווח מארח ביחד עם זיהוי חזותי של וירוסים רקומביננטי. השיטה שלנו מנצלת לחץ סלקטיבי שנוצר על ידי מארח אנטי חלבון קינאז R (PKR) בשילוב עם גן היתוך פלורסנט ביטוי mCherry-tagged E3L, אחד משני היריבים VACV PKR. הקלטת, כולל הגן של הריבית ואת הפיוז mCherry-E3L מוקף רצפים נגזר הגנום VACV. בין הגן של הריבית ו-mCherry-E3L הוא אזור קטן יותר זהה הראשון ~ 150 נוקלאוטידים של 3 ' זרוע, כדי לקדם הומוולוגי מחדש ואובדן של הגן mCherry-E3L לאחר בחירה. אנו מדגימים כי שיטה זו מאפשרת דור יעיל, חלקה של rVACV במגוון סוגי תאים מבלי לדרוש בחירת סמים או הקרנה נרחבת עבור וירוסים מוטציה.

השתמשנו בתרשים ההליך באיור 1 כדי ליצור vacv חסרים גם pkr האנטוניסטים E3L ו K3L, על ידי החלפת E3L עם egfp בווירוס נמחק כבר עבור K3L (vP872). איור 2 מראה שלטי פלורסנט אדום ב-pkr תאים RK13 המוסמכים מעיד על ביטוי נגיפי של mcherry-E3L, כמו גם egfp הביע בRK13 + E3L + K3L תאים המאשרים אובדן של E3L והתמוטטות של סמן הבחירה mcherry-E3L. איור 3 מאשרת כי זה וירוס רקומביננטי, VC-4, חסר שני היריבים pkr לא יכול לשכפל בתאי RK13 המוסמכת pkr, בעוד וי...

זוהי שיטה להפקת וירוסים "להוריד" רקומביננטי vaccinia באמצעות בחירה בטווח המארח וזיהוי חזותי של רקומביננטי וירוסים.

דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי Poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

השיטה שלנו משתמשת בבחירת טווח מארחים וסמנים פלואורסצנטיים עבור הדור היעיל וה חלק של וירוס vaccina רקומביננטי במגוון סוגי תאים. טכניקה זו משלבת את המהירות של קומבינציה הומולוגית עם הטבע ללא צלקות של בחירה דומיננטית בלתי צייתנית. בנוסף, אנו מארחים בחירת טווח כדי למנוע את האפשרות של שינויים הנגרמים כימית.שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לשנות וירוס vaccinia או poxviruses אחרים כדי להביע גנים זרים, למשל, כדי ליצור חיסונים. אם אתה מבצע פרוטוקול זה עם בחירת פלואורסצנטיות בלבד, עליך לוודא שאתה מקרין מספיק וירוסים כדי לזהות רקומביננטים נדירים יחסית ללא לחץ סלקטיבי PKR. שיטה זו מסתמכת על רווח ואובדן של סמנים פלואורסצנטיים כדי לבחור בהצלחה וירוסים שרכשו את קלטות recombination ולזהות וירוסים שיש להם recombined ללא צלקות.כדי ליצור וקטור קומבינציה מחדש, תחילה להוסיף 17 microliters של מים חינם DNase, 1.2 microliters של כל פריימר, חמישה microliters של חיץ תגובה PCR 5x, ה-DNA תבנית, ו 0.5 microliters של פולימראז DNA לצינור PCR אחד לכל אמפייקון. הוסף מים נוספים DNase חינם להביא את הנפח הסופי בכל צינור ל 50 microliters. ומקום הצינורות לתרמוציקלר.ממיסים את הדנ"א ב-98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות לפני השימוש ב-25 סיבובים של פרוטוקול PCR תלת-שלבי כמצוין. כדי לדמיין את מוצרי ההגברה על ג'ל 1%agarose, להוסיף 10 microliters של כל מוצר DNA ו 2 microliters של חיץ טעינה לכל באר. הפעל את הג'ל במשך שעה אחת בשמונה וולט לס"מ.בסוף הריצה, השתמש בערכת מיצוי ג'ל DNA על פי פרוטוקול היצרן כדי לטהר כל אמפייקון. שחררו את האמפילונים מהעמודה עם 50 מיקרוליטרים של מים חופשיים של DNase וצנטריפוגה מיידית. כדי להפוך וקטור שיבוט, תחילה להוסיף מיקרוגרם אחד של הווקטור, 17 microliters של מים חופשיים DNase, 2 microliters של חיץ תגובה, ו 1 microliter של EcoRI לצינור עבור דגירה של שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, להוסיף 0.2 picomoles של וקטור ליניארי 10 microliters של מים חופשיים DNase, ו 10 microliters של תערובת מאסטר הרכבה DNA לכל אמפליקון מבודד. דגימות דגירה ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, להפוך E.coli מוסמך כימית עם שני microliters של המוצר התאספו על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.צלחת 100 microliters של תאים שהפכו על לוחות אגרוז LB בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין. לאחר דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס, בחר מושבות מבודדות היטב לחיסון במרק לוריא בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 225 מהפכות לדקה. למחרת בבוקר, השתמש בערכת מיני-מזמזם פלסמיד כדי לבודד את הפלסמידים.ותבדוק את הריכוז והטוהר של הדנ"א בספקטרופוטומטר. עבור ייצור וירוס רקומביננטי, להדביק monolayer confluent של תאים מתאימים עם הנגיף להיות recombined בריבוי של זיהום של אחד בצלחת שש בארות. ותדיגר את התאים הנגועים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שעה.בסוף הדגירה, החלף את העל-טבעי בכל באר ב- DMEM טרי ובשימוש בריגנט transfection זמין מסחרית על פי פרוטוקול היצרן. הוסף שלושה מיקרוגרם של וקטור recombination של עניין לכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור למשך 48 שעות נוספות.לפני אחזור התאים מכל מצב transfection לתוך צינורות בודדים 1.5 מיליליטר. ואז להקפיא-להפשיר את התאים מאגר שלוש פעמים לפני sonicating lysates וכתוצאה מכך במשך 15 שניות ב משרעת 50%. לאחר מכן, באופן סדרתי 10-פי לדלל את lysate sonicated, שנקטפו מ 10 ל הראשון עד 10 לריכוז השישי ב- DMEM טרי ולהוסיף מיליליטר אחד של כל דילול ל בארות קונפלנטיות בודדות של קו תאים מוכשרים חלבון kinase R.מניחים את התאים באינקובטור תרבות התא במשך שעה אחת לפני החלפת העל-טבעיים במדיום טרי והחזרת התאים לחממת תרבות התאים. לאחר 24 עד 48 שעות, לזהות את וירוסים רקומביננטי על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. לוחות מווירוסים רקומביננטיים מבטאים פלואורסצנטיות אדומה עקב שילוב של גן ההיתוך mCherry-E3L.פלאק לטהר את וירוסים רקומביננטי שלוש פעמים על סוג פראי RK13 תאים. לאחר שלושה סיבובים של טיהור פלאק, להדביק RK13 +E3L + K3L תאים עם דילול סדרתי של ליאזט פלאק. כדי לזהות את הווירוסים שקרסו, על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מערכת הדמיה מתאימה המצוידת בקוביות מסנן GFP ו- RFP.לאחר מכן פלאק לטהר ירוק בלבד VC-R4, או לוחות E3L חסר צבע שלוש פעמים על RK13 +E3L + K3L תאים. להבטיח כי אין לוחות פלואורסצנטי אדום. להדביק את התאים עם לפחות 100 יחידות להרכיב פלאק כדי להגדיל את הסיכויים שלך לזהות פלאק חסר צבע.במקרים נדירים, ייתכן שיהיה צורך בסבבי זיהום מרובים. לוחות פלואורסצנטיים אדומים בחלבון קינאז R מוסמך RK13 תאים מעידים על ביטוי ויראלי של mCherry-E3L. ולוחות או לוחות חסרי צבע המבטאים רק eGFP בתאי RK13+E3L+K3L מאשרים את קריסת סמן הבחירה mCherry-E3L.וירוס רקומביננטי VC-R4, אשר חסר שני אנטגוניסטים חלבון קינאז R לא יכול לשכפל חלבונים קינאז R מוסמך RK13 תאים בעוד הנגיף לכאורה VP872, אשר מבטא E3L הוא שכפול מוסמך. כדי לאשר כי חוסר יכולת זה לשכפל בתאי RK13 נבע רק מאובדן E3L, GFP משופר הוחלף ב- E3L בווירוס VC-R4. הוא יצר וירוס רלוונטי באמצעות אותו פרוטוקול בחירה.מעניין, בעת ביצוע וירוס זה, לוחות חסרי צבע עולה בקנה אחד עם קריסת סמן הבחירה mCherry-E3L זוהו לפני הבחירה בתאי RK13 +E3L +K3L הנדרשים בדרך כלל כדי לבחור רקומביננטים ללא צלקת. סביר להניח בגלל זהות הרצף המורחבת בין קלטת recombination mCherry-E3L ואת הגן E3L להיות מוכנס לתוך VC-R4. בממוצע 12.6% מהנגיףים שעברו צאצאים עברו קומבינציה עם הפלסמיד המותב, בדומה לתדרים שדווחו בעבר.כאן, התדירות של לוחות חסרי צבע יחסית ללוחות הכולל RK13+E3L + K3L תאים מוצג, המדגים כי קצב הקריסה ואובדן סמן הבחירה mCherry-E3L התרחשה בתדר של כ 1.8%.. בשלב הראשון באמצעות תאים מוסמכים PKR מבטיח כי כל הלוחות עם וירוס רקומביננטי הכיל. בשלב השני באמצעות תאים לקוי PKR מאפשר זיהוי של וירוס רקומביננטי עם כריתה mCherry-E3L לוקוס.גישה זו מאפשרת לנו ליצור במהירות וירוסים המכילים גנים אקסוגניים, למשל, לייצור חיסונים המציעים ביטוי של אנטגוניסטים PKR ויראליים שונים. כדי להקל על הניתוח של אינטראקציות ספציפיות למינים עם PKR ממארחים שונים.

rapid-seamless-generation-recombinant-poxviruses-using-host-range

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מערכת גנטיקה הפוכה עבור זן בקעת נגיף קדחת-12 MP החיסון הוא כלי שימושי ליצירת נוספים MP-12 מוטנטים עם הנחתה מוגברת immunogenicity. אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לייצר ולאפיין שמוטציות NSS.

באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג&#39;ין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות

כאן אנו מתארים את פרוטוקול מבוסס רק על זיהום התא, אשר משפר את יעילות הייצור parvovirus רקומביננטי ידי קיפול יותר מ 100 לעומת פרוטוקולים אחרים בשימוש. פרוטוקול זה מתבסס על שימוש adenovirus רומן 5 מבוסס עוזר המכיל סמנכ"ל parvovirus שעתוק יחידה (Ad-VP).

ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

פרוטוקול מהיר ומודולרי ליצירת וירוסי חיסון רקומביננטיים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים בו זמנית בשיטת הבחירה הדומיננטית החולפת מתואר כאן.

מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקולה קטן.

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

וירוס Vaccinia (VV) כבר בשימוש נרחב במחקר ביו ושיפור בריאות האדם. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה, מאוד לערוך את הגנום VV באמצעות מערכת CRISPR-Cas9.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

ההרפס של תרנגולי הודו (גבוהה) משמש כפלטפורמה וקטור לדור של recombinant חיסונים נגד מספר מחלות העופות. מאמר זה מתאר גישה פשוטה ומהירה לדור של recombinant חיסונים HVT-הווקטורי שימוש משולב NHEJ-CRISPR/Cas9 ומערכת Cre-לקס.

יצירת וקטורים ההרפס העופות רקומביננטי עם CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה

אנו מתארים שיטה ליצירת, הגברה גנטית שונה וירוסים syncytial הנשימה (RSVs) ואת וזמינותו של פלאק ממוטב עבור RSVs. אנו ממחישים לפרוטוקול זה על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לאפשר כימות של שכפול RSV ולחיות ניתוח של RSV הכללה וגופי בגרגרים הכללה גופים הקשורים דינמיקה.

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

הדור של רקומביננטי rotaviruses מ-DNA פלאמיד מספק כלי חיוני לחקר שכפול rotaviruses ו פתוגנזה, ופיתוח של וקטורים rotaviruses ביטוי וחיסונים. להלן, אנו מתארים גישה גנטית הפוכה פשוטה ליצירת רקומביננטי rotaviruses, כולל זנים המבטא חלבונים כתבת פלורסנט.

מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי Rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקבלת וקטור הביטוי pVAX1-PRRSV על ידי הצגת אתרי הגבלה מתאימים בקצה 3' של התוספות. אנו יכולים להפוך את הווקטור לליניארי ולחבר מקטעי דנ"א לווקטור בזה אחר זה באמצעות טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית.

גישת שיבוט חלקה לבנייה וקטורית של ביטוי וירוסים ברבייה חזירית ובתסמונת הנשימה

הצלה של שפעת וירוסים מ-DNA פלסמיד היא טכניקה ניסויית בסיסי וחיוני המאפשר לחוקרים שפעת לייצר וירוסים רקומביננטי ללמוד היבטים מרובים הביולוגיה של נגיף השפעת, וכן לשמש וקטורים או חיסונים פוטנציאליים.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

למד לייצר רקומביננטי פוקס וירוסים ללא תפר באמצעות בחירת טווח מארח וסמנים פלואורסצנטיים. שיטה זו משלבת רקומבינציה הומולוגית עם בחירה דומיננטית זמנית לשינוי וירוסים יעיל.

דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי Poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית

גלה סרטונים נוספים