Name: בסיס אלקטרוכימי מבוסס-מיניאונציה עבור גרסאות חלבון MeCP2 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: למד שיטת ECLIA לכימות חלבון MeCP2 בתאים. פרוטוקול זה מציע רגישות גבוהה ושחזוריות טובה יותר מ-Western blot ו-ELISA, ומאפשר מדידות מדויקות במחקר נוירולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לד ר בריג סער לתמיכתה בכלי ECLIA.

אישור לרכישת ביופסיה לעור לצורכי מחקר התקבל מוועדת האתיקה של מחקר האדם בבית החולים לילדים בווסטמיד, אוסטרליה. הסכמה לניסויים בבעלי חיים הושגה מהמשרד הפדרלי האוסטרי של מדע, מחקר וכלכלה, אשר בוצעו בהתאם לתקנות בעלי חיים מקומיים לרווחת (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
הערה: העיקרון של מערכת ה-ECLIA מתואר באיור 1.
1. בחירת נוגדנים
<ol><li>הערכת יחס אות לרעש עבור מגוון של נוגדנים MeCP2 שונים ולזהות את עוצמת האות הטובה ביותר ואת הספציפיות ביותר בתוך שילוב של MeCP2 נוגדן העכבר העיקרי (שיבוט Mec-168) ו הארנב polyclonal בטים MeCP2 נוגדן זיהוי (נעשה בהתאמה אישית). עבור הנוגדן המשני, השתמש בנוגדן ספציפי למערכת (טבלת חומרים), שהיה גם מאומת. הערה: טבלה 1 מעניקה סקירה של כל הנוגדנים האומתו במהלך פיתוח MECP2-eclia וטווחי הדילול שלהם נבדק.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פונקציה</td>
			<td>שם</td>
			<td>שיבוט</td>
			<td>דילול</td>
		</tr>
<tr>
<td>ראשי</td>
			<td>עכבר, אנטי MeCP2</td>
			<td>Mec-168</td>
			<td>1:500 לאחד: 10000</td>
		</tr>
<tr>
<td>ראשי</td>
			<td>עכבר, אנטי MeCP2</td>
			<td>מיכל כהן</td>
			<td>1:250-1:4000</td>
		</tr>
<tr>
<td>ראשי</td>
			<td>עכבר, אנטי MeCP2</td>
			<td>גברים-8</td>
			<td>1:500-1:4000</td>
		</tr>
<tr>
<td>ראשי</td>
			<td>עכבר, אנטי MeCP2</td>
			<td>מיכל בייס</td>
			<td>1:500-1:4000</td>
		</tr>
<tr>
<td>ראשי</td>
			<td>ארנב, אנטי MeCP2</td>
			<td>D4F3</td>
			<td>1:500-1:4000</td>
		</tr>
<tr>
<td>שני</td>
			<td>ארנב, אנטי MeCP2</td>
			<td>פוליבטיים</td>
			<td>1:2000-1:20000</td>
		</tr>
<tr>
<td>שני</td>
			<td>ארנב, אנטי MeCP2</td>
			<td>פוליבטיים</td>
			<td>1:2000-1:20000</td>
		</tr>
<tr>
<td>זיהוי</td>
			<td>SULFO-תג מתויג אנטי ארנב</td>
			<td>פוליבטיים</td>
			<td>1:500-1:1000</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1-רשימת נוגדנים ומדלל עבודה משומשים.
<ol start="2"><li>לחלופין, השתמש בכל זוג של MeCP2-נוגדנים הפועלים היטב עם אליסה המקובלת.</li>
</ol>2. טיפול HDFs עם היתוך תאת-MeCP2 חלבון
הערה: תאת-MeCP2 היה recombinantly ביטא es, coli ומטוהר באמצעות טכניקות כרומוגרפיות סטנדרטיות כפי שתוארה בעבר8 ומאוחסן ב-80 ° c.
<ol><li>צלחת 1 x 106 בתאי הגוף האנושי (hdf) תאים ב 100 מ"מ מנות ולגדול את התאים לילה ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עד שהם מגיעים על 90% שליטה.</li>
	<li>תוציא בקבוקון אחד. מחלבון ההיתוך תאת-MeCP2 . להפשיר על קרח ולערבב בעדינות</li>
	<li>לדלל תאת-MeCP2 לריכוז הסופי של 500 nM ב 50 mL של מדיה תרבות HDF.</li>
	<li>להסיר את המדיה מתוך 100 מ"מ מנות ו-דגירה את התאים עם 500 ננומטר תאת-MeCP2 ב 37 ° צ' לתקופות דגירה שונות עד 24 h.</li>
	<li>הסר את הפתרון תאת-MeCP2 מהתאים. לשטוף את התאים 2x עם תמיסת מלח פוספט מחומם מראש של Dulbecco (DPBS).</li>
	<li>פנקו את התאים בעלי 2 מ ל של 0.05% טריפסין-EDTA עבור 5 דקות ב 37 ° c10.</li>
	<li>הוסיפו 6 מ ל של מדיית תרבות HDF כדי להשבית את טריפסין ולאסוף את התאים בצינורות של 15 מ"ל.</li>
	<li>גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים 2x עם DPBS קר קרח. לאחסן את הגלולה על הקרח ולהמשיך עם ההכנה לדוגמא.</li>
</ol>3. הכנה לדוגמא
<ol><li>ליטים HDF<ol>
<li>לקבוע את רמות החלבון הגבוה ביותר של MeCP2 באמצעות שיטת הקצירה לשבר הסלולר לתוך התאים הגרעיניים cytoplasmic והגרעין על פי סוזוקי et al.11. הגבל שבירה ליותר משישה דגימות לכל ניסוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>המוח העכבר ליסוטים<ol>
<li>הכינו 100 mL של כל לפירוק ההיפוטוניקה מגיב ומאגר החילוץ.<ol>
<li>עבור לפירוק ההיפוטוניקה מגיב, מערבבים היטב 10 מ"מ HEPES, 1.5 מ"מ מגנזיום כלוריד ו 10 מ"מ אשלגן כלוריד.</li>
			<li>עבור מאגר החילוץ, מערבבים היטב 20 מ"מ HEPES, 1.5 מ"מ מגנזיום כלוריד, 0.42 M נתרן כלוריד, 0.2 mM EDTA, ו -25% (v/v) גליצרול.</li>
			<li>כוונן את ה-pH של שני המאגרים ל-7.9.</li>
			<li>הוסף 1 מילימטר ממדי dithioitol (DTT) ו-1x מעכב פרוטאז קוקטייל שני מאגרים טרי. הירגע על הקרח לפני השימוש.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להשעות 100 מ"ג של המוח הכללי של העכבר (זן: C57BL/6J, wildtype זכר ונקבה ו B 6.129 P2 (C)-Mecp2tm 1.1 bird/j, hemizygous זכר וheterozygous נקבה; גיל: 4-8 שבועות הישן) ב 1 מ ל של הקרח קר לפירוק ההיפוטון מגיב.</li>
		<li>המגון לסדר את המוח עם מקורר לפני כל זכוכית הומוגנידצר רקמות על ידי 15 משיכות של הומוגניצר A (רופף, עבור הרשאה גדולה) ו-B (הדוק, עבור הרשאה קטנה), בהתאמה.</li>
		<li>העבר את התאים המהומוגניים לצינור נקי וצנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c. התעלם מהסופרנטנט (או שמור אותו כשבר cytoplasmatic לשימוש נוסף).</li>
		<li>השהה מחדש את הגלולה ב-140 μL של מאגר החילוץ לכל 100 מ"ג של חומר התחלתי. הניחו את הצינור בבלוק תרמותרמי מראש וערבבו בעדינות במשך 30 דקות ב -4 ° c.</li>
		<li>צנטריפוגה את הצינור ב 16,000 g עבור 10 דקות ב 4 ° c. העבר את הסופרנטאנט (כלומר, השבר הגרעיני) לצינור מקורר חדש ולחנות ב-80 ° c עד השימוש. הערה: ריכוז החלבון של lysates נגזר ממוח העכבר ו-HDFs ניתן להעריך על ידי שיטת החלבון BCA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MeCP2-פרוטוקול ECLIA
<ol><li>הכנת פתרון כביסה, חסימת פתרון מאגר ושיטת מדלל (יום 1)<ol>
<li>הוסף 500 μL של רצף של 20 אל 1 L של PBS כדי להכין 0.05% רצף 20 בפתרון PBS, לערבב במרץ ותווית כמו "פתרון כביסה". הערה: ודא שנעשה שימוש רק במאגר הכביסה המוכן לשימוש.</li>
		<li>הכנת פתרון חסימה של 3% חוסם A (טבלת חומרים) בתמיסת מלח מאגור פוספט (PBS). מערבבים על ידי ערבוב עדין, מסנן לעקר ולשמור אותם במקרר עד לשימוש עבור שבועיים לכל היותר.</li>
		<li>הוסף 5 מ ל של פתרון חסימה ל 10 מ ל של PBS כדי להכין את הפתרון שיטת הפעולה (1% חוסם A ב PBS).</li>
	</ol>
</li>
	<li>ציפוי לוחות מאגד גבוה<ol>
<li>קח את 96-היטב multi-מערך בודד במקום יחיד לאגד לוחית גבוהה. הערה: לוחיות האיגוד הגבוהות כוללים קיבולת מחייבת גדולה יותר ולכן טווח דינמי גדול יותר מלוחות סטנדרטיים עם משטחי הידרופובי.</li>
		<li>הפשרת העכבר מונוקובטיים anti-MeCP2 נוגדן על הקרח ולערבב 0.67 μL של הנוגדן עם 4 מ ל של PBS (1:6000 נוגדן דילול ב-PBS). מערבולת פתרון הנוגדן לערבב היטב ולתייג את הצינור כמו "פתרון ציפוי".</li>
		<li>בזהירות לוותר על 25 μL של פתרון ציפוי בפינה התחתונה של כל טוב באמצעות מצנפיאור רב-ערוצי; הדבר נקרא שיטת ציפוי הפתרון. הקש על צלחת ה-96 בעדינות על כל צד כדי לוודא שפתרון הציפוי מכסה את החלק התחתון של כל באר.</li>
		<li>אטום את הצלחת בנייר דבק והטה את הצלחת במקרר ב -4 ° c ללילה (12-16 שעות).</li>
	</ol>
</li>
	<li>חסימה (יום 2)<ol>
<li>הוציאו את הצלחת מהמקרר והסירו את נייר הכסף.</li>
		<li>הסר את הפתרון ציפוי נוגדן על ידי מצליף אותו לסל האשפה ולהקיש על צלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל פתרון ציפוי מן הבארות.</li>
		<li>הוסף 125 μL של פתרון חסימה לכל טוב. לאטום את הצלחת שוב ולמקם אותו על שייקר מיקרולוח מסלולית.</li>
		<li>מודטה את הצלחת עבור 90 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול קבוע ב 800 סל ד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנות של תקנים ודוגמאות<ol>
<li>בזמן הדגירה, הכינו את תקני החלבון MeCP2 ו/או תאת-MeCP2 ודגימות שונות. הערה: מאגר לייליזה המשמש לדילול סטנדרטי חייב להיות זהה לזה שנעשה בו שימוש בדגימות שנותחו.</li>
		<li>להוציא בקבוקון אחד של MePC2 ו/או תאת-MeCP2 מלאי חלבון פתרון (250 μg/mL), המוח העכבר lysates ו HDF lysates מ-80 ° c. . להפשיר אותם על קרח</li>
		<li>דלל את פתרון המניה הסטנדרטית (MeCP2 ו/או תאת-MeCP2) בצינורות נקיים לפי טבלה 2.</li>
		<li>לדלל את הדגימות במאגר לפירוק כדלקמן: 1-20 μg של המוח העכבר ליפוסט לכל 25 μL של מאגר לפירוק, ו 0.25-1 μg של HDF ליפוסט 25 μL של מאגר לפירוק. הכן מספיק נפח של כל מדגם כדי לבצע ניתוח בטרילקאט.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>רגיל</td>
			<td>ריכוז</td>
			<td>דילול</td>
		</tr>
<tr>
<td>תקן 1</td>
			<td>1,800 ng/mL</td>
			<td>1.08 μL רגיל פתרון מניות + 148.92 μL לליזה מאגר</td>
		</tr>
<tr>
<td>חדר סטנדרט 2</td>
			<td>600 ng/mL</td>
			<td>50 μL סטנדרטי 1 + 100 μL מאגר לוליזיס</td>
		</tr>
<tr>
<td>חדר סטנדרט 3</td>
			<td>200 ng/mL</td>
			<td>50 μL סטנדרטי 2 + 100 μL לליזה מאגר</td>
		</tr>
<tr>
<td>חדר סטנדרט 4</td>
			<td>66.67 ng/mL</td>
			<td>50 μL סטנדרטי 3 + 100 μL לוליזיס מאגר</td>
		</tr>
<tr>
<td>חדר סטנדרט 5</td>
			<td>22.22 ng/mL</td>
			<td>50 μL סטנדרטי 4 + 100 μL מאגר לוליזיס</td>
		</tr>
<tr>
<td>חדר סטנדרט 6</td>
			<td>7.41 ng/mL</td>
			<td>50 μL רגיל 5 + 100 μL מאגר לוליזיס</td>
		</tr>
<tr>
<td>חדר סטנדרט 7</td>
			<td>2.47 ng/mL</td>
			<td>50 μL רגיל 6 + 100 μL מאגר לוליזיס</td>
		</tr>
<tr>
<td>רגיל 8</td>
			<td>0.82 ng/mL</td>
			<td>50 μL סטנדרטי 7 + 100 μL מאגר לוליזיס</td>
		</tr>
<tr>
<td>חדר סטנדרט 9</td>
			<td>0.27 ng/mL</td>
			<td>50 μL סטנדרטית 8 + 100 μL לליזה מאגר</td>
		</tr>
<tr>
<td>חדר סטנדרט 10</td>
			<td>0 ng/mL</td>
			<td>מאגר הליזה 150 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: סדרות סטנדרטיות בין 0 ל-1,800 ng/mL.
<ol start="5"><li>הוספת דגימות ופתרונות סטנדרטיים<ol>
<li>הסר את פתרון חסימת ידי מצליף אותו לסל הפסולת ולהקיש על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל פתרון חסימת מבארות.</li>
		<li>לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של הפתרון כביסה על ידי הוספת פתרון כביסה ומיד להסיר אותו.</li>
		<li>הוסף 25 ul של תקנים ודגימות לפינה התחתונה של הבאר באמצעות צינור בודד בערוץ.</li>
		<li>חותם את הצלחת ו מודקת את הצלחת עבור 4 h בטמפרטורת החדר עם טלטול קבוע ב 800 סל ד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נוגדן זיהוי ללא תווית<ol>
<li>להפשיר את הארנב רב שבטיים anti-MeCP2 נוגדן על הקרח. לדלל את הנוגדן 1:6000 בתוך שיטת הפתרון.</li>
		<li>הסר את הסטנדרטים והדגימות על-ידי הצליף בו לסל הפסולת והקש על הצלחת על מגבת נייר.</li>
		<li>לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של הפתרון כביסה על ידי הוספת פתרון כביסה ומיד להסיר אותו.</li>
		<li>הוסף 25 μL של נוגדן זיהוי ללא תווית לכל טוב עם הצינורות הרב-ערוצי. חותם את הצלחת ו מודקת אותו עבור 1 h עם טלטול קבוע ב 800 rpm בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נוגדן ספציפי<ol>
<li>קחו את הנוגדן המשני המסוים (טבלת חומרים) מהמקרר והניחו אותו על הקרח. לדלל את הנוגדן 1:666.67 בתוך הפתרון בסדר ומערבבים בעדינות.</li>
		<li>להסיר את הנוגדן ללא תווית משנית על ידי מצליף אותו בסל האשפה ולהקיש על צלחת על מגבת נייר.</li>
		<li>לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של הפתרון כביסה על ידי הוספת פתרון כביסה ומיד להסיר אותו.</li>
		<li>הוסף 25 μL של נוגדן ספציפי (טבלת חומרים) לכל טוב עם הצינורות הרב רב-ערוצי. חותם את הצלחת ואת הדגירה עבור 1 h עם טלטול קבוע ב 800 rpm בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>קריאת הלוחית<ol>
<li>הסר את הנוגדן בחינם המגודרת (טבלה של חומרים) על ידי מצליף אותו בסל האשפה ולהקיש על צלחת על מגבת נייר.</li>
		<li>לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של פתרון כביסה.</li>
		<li>הוסף 150 μL של 1 x טריס מבוססי זהב לקרוא מאגר (טבלה של חומרים) עם החומרים המכילים triפרופיאמין כשותף מגיב עבור דור האור לצלחת. להימנע בועות אוויר על ידי שימוש הפוך טכניקות ליטוף.</li>
		<li>מניחים את הצלחת על פלטפורמת זיהוי אימונולוגיה (לוח חומרים) ולהתחיל את המדידה מיד. השתמש בהגדרות של 96-ובכן רכישת צלחת.</li>
		<li>ללכוד את האותות אלקטרוכימי על ידי מצלמת CCD מובנית במערכת זיהוי אלקטרוככימי (טבלת חומרים) ולהקליט את ספירות האות, אשר מתאים יחידות אור יחסית (rlu) והם יחסיים ישירות לעוצמת האור. הערה: על ידי גירוי אלקטרוכימי, התווית הרותניום המאוגדת לאלקטרודה הפחמן מקרינה אור מואר ב620 ננומטר. ניתוח נתונים באמצעות התוכנה המלווה במכשירים (טבלת חומרים).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDebad%2C+JD+%22Electrogenerated+Chemiluminescence%22">Electrogenerated Chemiluminescence</a>. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).</li>
<li>Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+Electrochemiluminescence+Immunoassay+Using+the+Ruthenium+Chelate-Labeled+Antibody+Bound+on+the+Magnetic+Micro+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads.</a> Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).</li>
<li>Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+immunoassays+for+quantification+of+hepatitis+B+surface+antigen+in+Chinese+patients+with+concomitant+hepatitis+B+surface+antigen+and+hepatitis+B+surface+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies.</a> Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).</li>
<li>Shah, R. R., Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeCP2+mutations%3A+progress+towards+understanding+and+treating+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome.</a> Genome Medicine. 9 (1), 17(2017).</li>
<li>Chahrour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeCP2%2C+a+key+contributor+to+neurological+disease%2C+activates+and+represses+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription.</a> Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).</li>
<li>Lyst, M. J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome%3A+a+complex+disorder+with+simple+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome: a complex disorder with simple roots.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).</li>
<li>Katz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+Syndrome%3A+Crossing+the+Threshold+to+Clinical+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation.</a> Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).</li>
<li>Steinkellner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrochemiluminescence+based+assay+for+quantitative+detection+of+endogenous+and+exogenously+applied+MeCP2+protein+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7929(2019).</li>
<li>Laccone, F. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLaccone%2C+FA+%22Synthetic+MeCP2+sequence+for+protein+substitution+therapy%22">Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy</a>. , Canada. CA2647125C (2007).</li>
<li>Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+and+uptake+of+TAT-fusion+proteins+produced+by+engineered+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).</li>
<li>Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REAP%3A+A+two+minute+cell+fractionation+method%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">REAP: A two minute cell fractionation method.</a> BMC Research Notes. 3, 294(2010).</li>
<li>Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV+Tat+protein+transduction+domain+improves+the+biodistribution+of+beta-glucuronidase+expressed+from+recombinant+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors.</a> Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).</li>
<li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+transduction%3A+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li>
<li>Nagahara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+full-length+TAT+fusion+proteins+into+mammalian+cells%3A+TAT-p27Kip1+induces+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration.</a> Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).</li>
<li>Trazzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDKL5+protein+substitution+therapy+rescues+neurological+phenotypes+of+a+mouse+model+of+CDKL5+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder.</a> Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).</li>
<li>Van Esch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MECP2+Duplication+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Syndromology%22%5BJournal%5D)">MECP2 Duplication Syndrome.</a> Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).</li>
<li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li>
<li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כדי למדוד MeCP2 אנדודוגני, רקומביננטי MeCP2 ו-תאת-MeCP2 רמות, הצלחת 96-באר ECLIA פותחה. זה הוכח כי אובדן של פונקציית חלבון MeCP2 מוביל לתסמונת RTT6, עבור איזה טיפול מוגבל כעת ניהול סימפטום ופיזיותרפיה. אחד שדרת טיפול מבטיח הוא טיפול החלפת חלבון כביכול, שם רמות MeCP2 יכול להיות טיטרציה עד הריכוז הדרוש שלהם12,13,14,15. הפוטנציאל של החלבונים תאת-fusion לחצות את מכשול המוח ב...

הטיפול החיסוני האלקטרוכימי (ECLIA) מבוסס על תהליך העושה שהוא משתמש בתוויות המיועדות לפלוט לומיאוציה כאשר מגורה באמצעות אלקטרוכימית. זוהי טכניקה הישימה באופן כללי עבור גילוי כמותי של אנליטים ביולוגיים בתעשייה בסיסית ומחקר אקדמי, תעשיית המזון, כמו גם באבחון קליני1. בדרך כלל, 96 חד פעמי עם אלקטרודות לדיו פחמן משמש. אלקטרודות אלה משמשים כמוביל בשלב מוצק עבור שיטת החיסוני. נוגדן משני מצומת לתווית אלקטרוכימית וכאשר החשמל מוחל על המערכת, פליטת האור של התווית הכימית מופעלת. אולטרה נמוך במיוחד המטען מצמידים מכשיר (CCD) רשומות את עוצמת האור אשר פרופורציונלי באופן ישיר אנטיגן מאוגד לנוגדן לכידת וכתוצאה מכך את הכמת של המטרה של המדגם2. לעומת שיטת החיסוני הקשורה באנזימים (אליסה), ECLIA נחשבת ליתרון כפי שהוא מציע רגישות גבוהה יותר, מיוציציה, כמו גם אוטומציה טובה יותר ועקביות3.
כאן ניתחנו את החלבון כריכת מתיל-CpG 2 (MeCP2) רמות בדגימות של מקור אנושי מורמי, כמו גם גרסאות שונות של החלבון רקומביננטי באמצעות מערכת ECLIA שפותחה לאחרונה. MecP2 הוא מקושר X הגרעין חומצה מחייב חלבון ידוע לקיים אינטראקציה עם רצפי DNA ממתיל. החלבון הזה היה מעורב בוויסות. הביטוי הגנטי4,5 אובדן הפונקציה של מוטציות בגן אשר מקודד חלבון זה הם הפושעים העיקריים גורם Rett תסמונת (RTT), הפרעה חמורה התפתחותית הנוירולוגית6. עוד הפרעה MeCP2 הקשורות, תסמונת שכפול MeCP2 , גם מוביל סימפטומים נוירולוגיים שיכולים חופפים עם אלה של rtt7. בעיקר, הנקבות מושפעות בעיקר על ידי rtt בעוד הזכרים הם6נגועים בעיקר על ידי תסמונת MECP2 שכפול 6,7.
הפרעות אלה משויכות לרמות MeCP2 לא מספיקות או עודפות בהתאמה במערכת העצבים המרכזית (CN). מכאן, אפשרויות טיפול RTT המערבות הגדלת רמות MeCP2 ב-CN צריך למנוע את ההשפעות מזיקים הקשורים עם עודף של MeCP27. בשל עובדה זו, ככמת מאוד רגיש ומדויק של רמות החלבון MeCP2, כפי שסופקו על ידי מערכת ECLIA, היא חיונית לקידום RTT כמו גם MeCP2 מחקר תסמונת שכפול. המדידות המדויקות של רמות אנדודוגני ואקסודוגני MeCP2 מקווי התאים האנושיים ודגימות רקמות העכבר, כמו גם חלבון רקומביננטי המורכב של האדם MeCP2 isoform B (הידוע גם בשם isoform e1), ו מינימלי N-מסוף התמרה התחום HIV-תאת (תאת-MeCP2) כי יש8את הפוטנציאל לחצות את מוח הדם-מחסום 8,9 מוצגים בעבודה זו.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td>מגיב ליזה היפוטוני, מאגר מיצוי</td></tr><tr><td>בדיקת חלבון Bio-Rad תרכיז ריאגנט צבע</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>500-0006</td> זיהוי <td>הכנה לדוגמא</td></tr><tr><td>AB SULFO-TAG תווית אנטי-ארנב</td><td>אבחון סולם מזו</td><td>R32AB-1</td> שולחן <td></td></tr><tr><td>עבודה לגילוי נוגדנים 4.0</td><td>תוכנת</td><td>גילוי</td><td></td> קנה מידה</tr><tr><td>מזו DMEM (1X)</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>41966-029</td><td>הכנת דגימה</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (סטרילי)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>הכנת דגימה, תמיסת כביסה, תמיסת ציפוי</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>מאגר מיצוי</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>הכנת דגימה</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td>מאגר מיצוי</td></tr><tr><td>מאגר קריאת זהב T (1x) עם סולם מזו פעילי שטח</td><td> אבחון</td><td>R92TG</td><td>MeCP2 פרוטוקול ECLIA</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>מגיב ליזה היפוטוני, מאגר מיצוי</td></tr><tr><td>סט מטחנת רקמות KIMBLE Dounce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>הכנת דגימה</td></tr><tr><td>שייקר מעבדה, תנועת נדנדה (מהירות נמוכה)</td> <td>GFL</td><td>3014</td><td>MeCP2 פרוטוקול ECLIA</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl*6H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>מגיב ליזה היפוטוני, מאגר מיצוי</td></tr><tr><td>MeCP2 (אנושי) חלבון רקומביננטי (P01)</td> <td>Abnova Corporation</td><td>H00004204-P01</td><td>טיפול בתאים</td></tr><tr><td>Microseal B חותם</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>MSB1001</td><td>לאיטום צלחות</td></tr><tr><td>מונוקלונלי אנטי-MeCP2, מיוצר בעכבר, שיבוט Mec-168, אימונוגלובולין מטוהר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td><td>נוגדן, תמיסת ציפוי</td></tr><tr><td>MSD חוסם A</td><td>אבחון בקנה מידה מזו</td><td>R93BA-4</td><td>חוסם</td></tr><tr><td>MSD SECTOR Imager 2400</td><td>אבחון בקנה מידה Meso</td><td>I30AA-0</td><td>MeCP2 פרוטוקול ECLIA</td></tr><tr><td>Multi-Array 96-well Plate</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>L15XB-3/L11BX-3</td><td>MeCP2 ECLIA פרוטוקול</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>ג'יבקו מאת Life Technologies</td><td>15140122</td><td>הכנת דגימה</td></tr><tr><td>Polyclonal Anti-MeCP2, המיוצר בארנב</td><td>Eurogentec S.A.</td><td></td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td> <td>Merck KGaA</td><td>1049361000</td><td>מגיב ליזה היפוטוני</td></tr><tr><td>עכבר AB ראשי, אנטי-MeCP2 (1B11)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td><td>נוגדנים</td></tr><tr><td>ראשוניים AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td><td>נוגדנים</td></tr><tr><td>ראשוניים AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818; RRID:AB_262075</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>ראשוני AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7443; RRID:AB_477235</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>ראשוני AB ארנב, אנטי-MeCP2 (D4F3)</td> <td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>3456S; RRID:AB_2143849</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים קוקטייל מעכב פרוטאז (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8340</td><td>מגיב ליזה היפוטוני, מאגר מיצוי</td></tr><tr><td>AB משני, ארנב, אנטי-MeCP2</td><td>Eurogentec SA</td><td>נוגדן מותאם אישית</td><td></td></tr><tr><td>משני AB, ארנב, אנטי-MeCP2</td><td>Merck</td><td>07-013</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>מאגר מיצוי</td></tr><tr><td>SULFO-TAG תויג נוגדן נגד ארנב (עז)</td> <td>אבחון סולם מזו</td><td>W0015528S</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>TAT-MeCP2 חלבון היתוך</td> ייצור <td>פנימי</td><td></td><td>טיפול בתאים</td></tr><tr><td>טריפסין EDTA 0.25% (1X)</td><td>gibco של Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>טיפול בתאים</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>תמיסת כביסה</td></tr></tbody></table>

בסיס אלקטרוכימי מבוסס-מיניאונציה עבור גרסאות חלבון mecp2

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

ECLIA היא שיטה רב-תכליתית אשר מסוגל לכמת אנדוגני וכמויות חלבון רקומביננטי בפורמט 96. כדי להדגים את היעילות ECLIA, השימוש באותה שימוש כדי לנתח רמות פנימיות של MeCP2 ברקמת המוח של העכבר ואת ספיגת של תאת-MeCP2 בתוך העור האדם פיברופיצוצים. MeCP2-ECLIA מייצרת מדידות מדויקות ומובנות עם שגיאה נמוכה בתוך ובין-שיטת הספק. לסיכום, פיתחנו שיטה כמותית להערכת משתני חלבון MeCP2 שניתן לעשות בהם שימוש במסכי תפוקה גבוהה.

עקרון מערכת ה-ECLIA מתואר באיור 1. עקומות סטנדרטיות לשתי משתני MeCP2 מוצגות באיור 2. הקוונפיקציה מדויקת היתה אפשרית מעל מגוון רחב של ריכוזים (1-1800 ng/mL). באיור 3, רמות MeCP2 של lysates נגזר ממוח העכבר ו-hdfs נותחו. MeCP2 ביטוי של lysates גרעינית המוח מ heterozygous, ומסוג wildtype עכברים הושוו באיור 3A, בעוד באיור 3A no MeCP2 חלבון זוהה ב-MeCP2 לקויה האדם בפיברוטים (c. 8...

שיטת החיסוני האלקטרוכימי (ECLIA) היא גישה מקורית לזיהוי כמותי של משתני חלבון MeCP2, המייצרת מדידות כמותית, מדויקת ומדוייקת ובעלת שגיאה בתוך ובין-שיטה נמוכה בטווח עבודה רחב. כאן, הפרוטוקול עבור MeCP2-ECLIA בפורמט 96-ושוב מתואר.

בסיס אלקטרוכימי מבוסס-מיניאונציה עבור גרסאות חלבון MeCP2

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

ECLIA היא שיטה פשוטה אך יעילה לכמת רמות הסלולר של MeCP2. ה- ECLIA מהיר, רגיש יותר וקל יותר לטיפול בהשוואה לשיטות כימות אחרות כגון הכתם המערבי וה- ELISA. להכנת פתרון הכביסה, שהוא 0.5%Tween 20 ב-PBS, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של Tween 20 לליטר אחד של PBS והתערבבו במרץ.הכינו פתרון חסימה של 3%Blocker A ו-PBS ומערבבים בעדינות. לעקר את פתרון החסימה על ידי סינון. כדי להכין את פתרון דילואנט ההקדמה, 1%חוסם A ו- PBS, הוסף חמישה מיליליטר של פתרון חסימה ל- 10 מיליליטר של PBS.הבא להפשיר את העכבר חד שבטי נגד MeCP2 נוגדן על קרח. מערבבים 0.67 מיקרוליטרים של הנוגדן עם ארבעה מיליליטר של PBS, ואז מערבולת הפתרון. כדי לתת מענה לצלחת ה-96 היטב, מחלקים בזהירות 25 מיקרוליטרים של תותב ציפוי לפינה התחתונה של כל באר, באמצעות צינור רב-ערוצי.לטבול את הצלחת 96 היטב בעדינות בכל צד כדי להבטיח כי פתרון הציפוי מכסה את החלק התחתון של כל באר. לאטום את הצלחת עם רדיד דבק, ו דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. מוציאים מהמקרר את צלחת ה-96 באר ומסירים את נייר הכסף.הסר את פתרון ציפוי הנוגדנים בארות על ידי הפלתו לתוך מיכל פסולת. לאחר מכן הקישו על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר כל פתרון שנותר. לאחר מכן, להוסיף 125 microliters של פתרון חסימה לכל באר.ואז לאטום את הצלחת שוב עם רדיד דבק. מניחים את הצלחת על שייקר מיקרופלסטיק מסלולי, להגדיר ב 800 סל"ד, ולהדקר אותו במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. הפשר על קרח בקבוקון אחד של פתרון מלאי החלבון MeCP2 או Tat-MeCP2, לייסאטים של מוח העכבר וליזטס HDF.לדלל את פתרון מלאי החלבון בצינורות נקיים כמתואר בטבלה 2 של כתב היד. לאחר מכן לדלל את דגימות ליט. עבור lysates המוח העכבר, להשתמש 1 עד 20 מיקרוגרם לכל 25 microliters של מאגר תזה.עבור ליאזט HDF, הוסף 0.25 למיקרוגרם אחד לכל 25 מיקרוליטרים של מאגר תיזה. לאחר צלחת 96 באר כבר דגירה במשך 90 דקות, להסיר את פתרון החסימה מן בארות על ידי הבהבה אותו לתוך מיכל פסולת. לאחר מכן הקישו על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר כל פתרון שנותר.לאחר מכן לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 150 microliters של פתרון כביסה, על ידי הוספת פתרון הכביסה ומיד להסיר אותו. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תקנים ודגימות ל בארות של צלחת 96 בארות. לאטום את הצלחת ולהדקר אותו עוד ארבע שעות בטמפרטורת החדר עם קבוע 800 סל"ד רועד.להפשיר את נוגדן גילוי ללא תווי, ארנב polyclonal נגד MeCP2, על קרח. באמצעות פתרון diluent assay, לדלל את הנוגדן ביחס של אחד עד 6, 000. כאשר צלחת 96 באר הוא סיים דגירה על שייקר, להסיר את הסטנדרטים ואת הדגימות על ידי הפלת הצלחת לתוך מיכל פסולת.לאחר מכן הקישו על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר כל פתרון שנותר. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 150 microliters של פתרון כביסה על ידי הוספת פתרון הכביסה ומיד להסיר אותו. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של פתרון נוגדנים לגילוי ללא חגורה לכל באר עם הצינור הרב-ערוצי.לאטום את הצלחת ולהדקר אותו במשך שעה בטמפרטורת החדר עם רעידות קבועות ב 800 סל"ד. השג את הנוגדן המשני הספציפי מהמקרר והצב אותו בקרח אחד. מדללים את הגוף המשני בתווית מדוללת ומערבבים בעדינות.כדי להסיר את נוגדן הגילוי ללא תריס מהצלחת 96 באר, החלק לתוך מיכל הפסולת ולאחר מכן הקש על הצלחת על מגבת נייר. לאחר שטיפת הצלחת שלוש פעמים כפי שתואר בצורה סוטה, להוסיף 25 microliters של נוגדן משני לכל באר עם צינור רב ערוצי. לאטום את הצלחת ולהדקר אותו במשך שעה בטמפרטורת החדר עם רעידות קבועות ב 800 סל"ד.הסר את הנוגדן המשני החופשי על ידי החלקה לתוך מיכל הפסולת והקשה על הצלחת על מגבת נייר ולאחר מכן לשטוף את הצלחת שלוש פעמים, כפי שתואר קודם לכן. לכל באר של הצלחת, להוסיף 150 microliters של 1X טריס בסיס זהב לקרוא Buffer עם פעילי שטח, המכיל טריפרוליאמין כמו coreactant עבור דור האור. כדי להימנע מיפקת בועות אוויר, השתמש בטכניקות צינורות הפוכות.מניחים את לוחית 96 באר על פלטפורמת microplate עם מערכת זיהוי electrochemiluminescence. באמצעות מצלמת CCD המובנית, התחל מיד ללכוד נתונים. ספירת אותות הקלטה התואמת ליחידות אור יחסיות והן פרופורציונליות ישירות לעוצמת האור.עקומות סטנדרטיות MeCP2 נוצרו MeCP2 אנושי במדידות מרובות. ECLIA יכול לכמת במדויק MeCP2 אנושי רקומביננטי על פני טווח של ננוגרם אחד למיליליטר ל 1800 ננוגרם למיליליטר. באמצעות ECLIA, רמות החלבון MeCP2 נמדדו lysates גרעיני במוח מעכברים הטרוזיגים ונקבה מסוג פראי מעכבר נוקאאוט אחד MeCP2.ECLIA נערך על ליזטים התא מתוך שליטה בריאה מן קו התאים c. 806delG המשמש כמודל לתסמונת רט. לא זוהה חלבון MeCP2 בקווי התאים המוטנטים על ידי ECLIA או על ידי שפעת חיסונית.ECLIA שימש גם כדי לחקור את ספיגת Tat-MeCP2 על ידי קו תאים לקוי MeCP2 שעות נוספות. דיוק האינטר והאינטרא-תדאה הפנימית של ECLIA נקבע במשך שלושה ימים רצופים. לטיפול עתידי בתחליפי חלבון, ניתן לייעל שוב ושוב את אספקת MeCP2 לאחר הערכת רמת החלבון על ידי ECLIA.

an-electrochemiluminescence-based-assay-for-mecp2-protein-variants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

שיטה זולה, תפוקה גבוהה לגילוי סימולטני של עד 43 מטרות מולקולריות מתואר. יישומים של mPCR / RLB כוללים הקלדה וזיהוי של חיידקים פתוגנים רבים של דוגמאות קליניות.

Multiplex PCR הפוך כתם וקו הכלאה Assay (mPCR / RLB)

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת החיסון אלקטרוכימילומינסנציה לכימות רמות חלבון המטרה בדגימות שונות. בדיקה זו מבוססת על הלומינסנציה המיוצרת בתגובה האלקטרוכימית. עוצמת האור הנפלטת פרופורציונלית לכמות חלבון המטרה בדגימה.

בדיקת אלקטרוכימילומינסנציה לכימות רמות חלבון המטרה בליזט במוח

סרטון זה מתאר את הכתמים המערביים מבוססי הכימילומינסנציה של ליזטים מדוכאי חיסון. הטכניקה מסייעת לקבוע עיבוד והפעלה של חלבונים. האות הכימילומינסנטי שזוהה פרופורציונלי לרמת עיבוד החלבון במהלך הפעלתו.

בדיקת כתם מערבי Chemiluminescent לעיבוד חלבונים

סמנים ביולוגיים למדידה בדגימות ביולוגיות מורכבות יותר ויותר מנחים את קבלת החלטות קליניות. אנו מתארים שיטה רגישה ביותר למדידה בו זמנית לב שרירן מחייב חלבון-C, מגה קריאטין קינאז, וטרופונין לבי בדגימות סרום מנבדקים עם אוטם שריר הלב ונבדקים בריאים.

שיטת Quantitation רגישה וספציפית לקביעת חלבון-C שרירן לב סרום הכבילה ידי Immunoassay Electrochemiluminescence

אנו מתארים תפוקה גבוהה, רב מפלסים, ואת הנוזל השדרתי proteomic ממוקד (CSF) assay שפותחה עם פוטנציאל תרגום קליני. הבדיקה יכולה לכמת סמנים פוטנציאל וגורמי סיכון עבור ניווניות של מערכת העצבים, כגון גרסאות E אפוליפופרוטאין (E2, E3 ו E4), ולמדוד ביטוי אללים שלהם.

תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס

אנחנו ניצור קשר עם סיכת ראש קטנה RNA (shRNA) ופרוטוקול הבא הדור המבוססת על רצף לזיהוי הרגולטורים האינקטיבציה שמושרש בקו תא מאתר עם גחלילית לוציפראז ומאוחדים. גנים עמידות hygromycin עם איזה CpG מחייב חלבון 2 ( MeCP2) גנים על כרומוזום ה-X לא פעיל.

במאגר shRNA מסך עבור הפעלה מחדש של MeCP2 על כרומוזום X לא פעיל

כאן, אנו מציגים עבור טיהור יעיל צעד בודד של האדם לא מתויגות הפעיל פרוטוקול 10-11 טרנסלוקציה-2 (TET2) dioxygenase 5-methylcytosine באמצעות יונים כרומטוגרפיה ואת וזמינותו שלה באמצעות מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית מסות (LC-MS/MS)-המבוסס על הגישה.

טיהור יעיל ופיתוח Assay LC-MS/MS-מבוסס על 10-11 טרנסלוקציה-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי ליצור מודל קיימא נשי מורטין עם כרומוזום לא אקראי הפעלה X, כלומר, maternally בירושה כרומוזום X אינו פעיל ב 100% של התאים. כמו כן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת היתכנות, סבילות, ובטיחות של ההפעלה הפרמקולוגית של כרומוזום X לא פעיל ב vivo.

מודל עכבר שאינו אקראי עבור ההפעלה הפרמקולוגית של Mecp2 על כרומוזום X לא פעיל

CENP-מהווה מהווה דרישה חשובה עבור CENP-A התצהיר ב צנטרומר, ירש דרך dimerization בין החטיבה התא, והכרחי לקיום תאים. כאן אנו מתארים ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אובילילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A) חלבון.

ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות את אוביקווילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A)

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

למד שיטת ECLIA לכימות חלבון MeCP2 בתאים. פרוטוקול זה מציע רגישות גבוהה ושחזוריות טובה יותר מ-Western blot ו-ELISA, ומאפשר מדידות מדויקות במחקר נוירולוגי.

בסיס אלקטרוכימי מבוסס-מיניאונציה עבור גרסאות חלבון MeCP2

גלה סרטונים נוספים