Name: וירוס תפוחי אדמה X מבוסס השתקת מיקרונה (VbMS) בתפוח אדמה. (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: חקור שתיקת מיקרונה מבוססת וירוס PVX בתפוחי אדמה ללא צורך בהשתלות יציבות. שיטה זו מאפשרת אפיון פונקציונלי מהיר ויעיל של miRNA בצמחים דיפלואידיים וטטרפלואידיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר יול ליו מאוניברסיטת צינגחואה על שסיפק את וקטור PVX-LIC. עבודה זו נתמכה על ידי קרן סטארט-אפ מטקסס A&M AgriLife Research ופרויקט האץ' TEX0-1-9675 מהמכון הלאומי למזון וחקלאות של משרד החקלאות האמריקאי ל- JS.

אנו מציגים מערכת השתקה miRNA מבוססת PVX כדי לאפיין את הפונקציה של miRNAs אנדוגני בתפוח אדמה על ידי שילוב עיצוב STTM לתוך וקטור PVX. מערכת VbMS הוכיחה את עצמה כיעילה בהשתקת miRNA165/166 בתפוחי אדמה, משפחת מירנ"א שמורה ביותר על פני מיני צמחים.
גישת TM פותחה כדי להפריע לביטוי של miRNAs המבוסס על חיקוי יעד miRNA מלאכותי שנועד ליצור לולאת אי התאמה באתר המחשוף הצפוי בתוך רצף ההשלמה של miRNA המביא לפירוק של miRNA ממוקד ומעצר פעילותה22,35,78,79</sup...

מיקרו-רנ"א צמחיים (miRNAs) מאופיינים כ-RNAs רגולטוריים באורך 20-24 נוקלאוטידים, המקודדים לגרעין1 וממלאים תפקידים בסיסיים כמעט בכל היבט של תהליכים ביולוגיים צמחיים, כולל צמיחה ופיתוח2,3, פוטוסינתזה וחילוף חומרים4,5,6,7, סינתזת הורמונים ותגובות איתות8,9, ביוטיות ואביוטיות10, 11,12,13, ורגולציה תזונתית ואנרגיה14,15. התפקידים הרגולטוריים של miRNAs צמח מתוכנתים היטב וממולמים בדרך כלל ברמות שלאחר שעתוק על ידי בקעה או דיכוי תרגום של mRNAs היעד.
חלה התקדמות עצומה לקראת זיהוי, פרופיל תמלול וחיזוי יעד של miRNAs בתפוחי אדמה 16,17,18,19,20,21. עם זאת, האפיון התפקודי של miRNAs בצמחים, כולל תפוחי אדמה, מפגר אחרי אורגניזמים אחרים בשל היעדר גישות גנטיות יעילות ובעלות תפוקה גבוהה. זה מאתגר לבצע ניתוח פונקציונלי של miRNA בודדים על ידי ניתוח סטנדרטי של אובדן תפקוד, כי רוב miRNAs שייכים למשפחות עם יתירות גנטית ניכרת22. בנוסף, miRNA יחיד יכול לשלוט גנים יעד מרובים23 וכמה miRNAs שונים יכול לווסת את אותו מסלול מולקולרי בשיתוף פעולה24,25. מאפיינים אלה מקשים על אפיון הפונקציה של miRNA ספציפי או משפחת miRNA.
חלק גדול מהניתוח התפקודי של miRNAs הסתמך במידה רבה על גישות של רווח-של-פונקציה שיש להם מגבלות ברורות. שיטת ה-miRNA המלאכותית (amiRNA) מנצלת את התמלילים העיקריים האנדוגניים (pri-miRNAs) כדי לייצר miRNAs ברמה גבוהה, מה שמוביל לעיכוב ביטוי גן היעד26,27,28,29. עם זאת, תיוג הפעלה וביטוי יתר של miRNA באמצעות מקדם 35S מרכיב חזק מובילים לעתים קרובות לביטוי מוגבר של miRNAs שאינם מייצגים תנאי vivo ולכן לא יכול לשקף את הפונקציה אנדוגני של miRNAs30. פותחה גישה חלופית הכוללת ביטוי של צורות עמידות בפני miRNA של גנים המשמשים כמטרה המכילים מוטציות טמאות באתרי הכריכה ו/או המחשוף31,32,33. אבל גישה זו יכולה גם לגרום לפרשנות שגויה של הפנוטיפ הנגזר מהטרנסג'ן היעד העמיד בפני miRNA עקב חפצים מהונדסים. לכן, מסקנות אלה מחקרים של רווח של פונקציה צריך להסיק בזהירות34. מגבלה מרכזית נוספת של הגישות המתוארות לעיל היא שהן דורשות טרנספורמציה, שהיא עבודה עתירת עבודה וגוזלת זמן רב. יתר על כן, הגישות התלויות בטרנסג'ן אינן ישימות כמעט ללא שינוי עבור מיני צמחים סרבנים. לכן, חיוני לפתח גישה מהירה ויעילה של אובדן תפקוד כדי לפענח את הפונקציה של miRNAs.
כדי לעקוף את תנאי מוקדם של הליך הטרנספורמציה, השתקת מיקרורנ"א מבוססת וירוסים (VbMS) הוקמה על ידי שילוב אסטרטגיות חיקוי היעד (TM) עם וקטורים שמקורם בווירוסים. במערכת VbMS, מולקולות TM שתוכננו באופן מלאכותי מתבטאות באופן חולף מעמוד השדרה של וירוסים, ומציעות כלי רב עוצמה, בעל תפוקה גבוהה וחוסך זמן כדי לנתח את הפונקציה של miRNAs35,36 אנדוגני צמחי. VbMS פותחה בתחילה ב- N. benthamiana ועגבניות עם נגיף רעשן הטבק (TRV)35,36,37 והורחבה לערבידופסיס, כותנה, חיטה ותירס באמצעות מערכות שונות אחרות לביטוי וירוסים, כולל וירוס תפוחי האדמה X (PVX)38, וירוס קמט עלה כותנה (ClCrV)39, וירוס פסיפס מלפפונים (CMV)40,41,42, וירוס פסיפס חיטה סיני (CWMV)43 ווירוס פסיפס פסים שעורה (BSMV)44,45.,
תפוח אדמה (Solanum tuberosum) הוא יבול המזון הרביעי בחשיבותו והיבול הנפוץ ביותר בעולם בעיקר בגלל ערכו התזונתי הגבוה, ייצור אנרגיה גבוהה ודרישות קלט נמוכות יחסית46. מספר תכונות של תפוחי אדמה להפוך אותו צמח מודל dicotyledonous אטרקטיבי. זהו יבול פוליפלואידי שהופצה על ידי צמחייה עם קצב שפיכות גבוה, הטרוזיגוסיות ומגוון גנטי. עם זאת, עד כה, אין דו"ח המאפיין את הפונקציה של miRNAs בתפוח אדמה באמצעות VbMS. כאן, אנו מציגים גישה של שיבוט עצמאי לקשירה (LIC) מבוסס PVX מבוסס VbMS כדי להעריך את הפונקציה של miRNAs בצמחי תפוחי אדמה38. בחרנו את משפחת miR165/166 כדי להמחיש את בדיקת VbMS מכיוון שמשפחת miR165/166 וגורמי התמלול של mRNAs היעד שלהם ורוכסן הביתי השלישי (HD-ZIP III) אופיינו בהרחבה22,47,48. הגנים HD-ZIP III הם רגולטורים מרכזיים של התפתחות מריסטם וקוטביות איברים, ודיכוי של תפקוד miR165/166 מוביל לביטוי מוגבר של הגנים HD-ZIP III, וכתוצאה מכך פגמים התפתחותיים pleotropic כגון דומיננטיות אפית מופחתת ודפוסים חריגים של קוטביות עלים22,35,38,41 . הפנוטיפים ההתפתחותיים הניתנים לציון בקלות בקורלציה עם השתקה של miRNA165/166 מאפשרים הערכה מדויקת של האפקטיביות של בדיקות VbMS מבוססות PVX.
במחקר זה, אנו מדגימים כי מערכת VbMS מבוססת PVX יכולה לחסום ביעילות את הפונקציה של miRNAs בתפוחי אדמה. מכיוון שמערכת השתקת הגנים (VIGS) המבוססת על וירוסים מבוססת PVX הוקמה במספר זני תפוחי אדמה49,50,51,52, גישה זו המבוססת על VbMS מבוססת PVX יכולה להיות מיושמת ככל הנראה על מגוון רחב של מיני תפוחי אדמה דיפלואידים וטטרפלואידים.

<table><tbody><tr><td>100 ומיקרו; M dATP ו-100 ומיקרו; M dTTP</td><td>אומגה ביו-טק, בע"מ, נורקרוס, נורקרוס, GA 30071, ארה"ב</td><td>TQAC136</td><td></td></tr><tr><td>3 M נתרן אצטט, pH 4.0.</td><td>Teknova, Hollister, CA 95023, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr>#S0297 <tr><td>Acetosyringone</td><td>TCI America, פורטלנד, OR 97203, ארה"ב</td><td>D2666-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens זנים: GV3101, GV2260 או EHA105.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, ארה"ב</td><td>VWRV0757-950ML</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד, DMSO</td><td>TCI America, פורטלנד, OR 97203, ארה"ב</td><td>D0798-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, ארה"ב</td><td>VWRV0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DB3.1</td><td></td><td></td><td>לתחזוקה של PVX-LIC ו-pTRV2e המכילים את הגן ccdB</td></tr><tr><td>אי קולי DH5 ואלפא;</td><td></td><td></td><td>עבור מבני היעד הנוצרים על ידי דשן שיבוט LIC</td></tr><tr><td>: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td><td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA</td><td>G99260</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנטים PCR בנאמנות גבוהה: KAPA HiFi DNA Polymerase עם dNTPs</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA</td><td>7958960001</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול</td> <td>איזואמילVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, ארה"ב</td><td>VWRV0944-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec אתנול טהור &ndash; 200 Proof</td><td>Decon Labs, King of Prussia, PA 19406, USA</td><td>V1005M</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>TCI AMERICA, פורטלנד, OR 97203, ארה"ב</td><td>M0606-250G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>MFCD00149781</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td><td>ניו אינגלנד BioLabs, איפסוויץ', MA 01938-2723 ארה"ב</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר ננו-טיפה: NanoDrop OneC ספקטרופוטומטר UV-Vis מיקרונפיום עם Wi-Fi</td><td>ThermoFisher, וולת'אם, MA 02451, ארה"ב</td> מכונת <td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>PCR: Bio-Rad MyCycler PCR System</td><td>Bio-Rad, הרקולס, קליפורניה 94547, ארה"ב</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>מכונת PCR: Eppendorf Mastercycler pro</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, ארה"ב</td><td>מד pH 950030010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sper Scientific, סקוטסדייל, AZ 85260, ארה"ב</td><td>מד pH / mV שולחני - 860031</td><td></td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25: 24: 1), pH 6.7 / 8.0.</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, ארה"ב</td><td>VWRV0883-400ML</td><td></td></tr><tr><td>פיטאג'ל: Gellan Gum</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, ארה"ב</td><td>J63423-A1</td><td></td></tr><tr><td>PVX וקטור VIGS: PVX-LIC</td><td></td><td></td><td>Zhao et al., 2016</td></tr><tr><td>מכונת PCR בזמן אמת: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>מגיב PCR בזמן אמת: KAPA SYBR&reg; FAST qPCR Master Mix (2x) ערכת</td><td>ריצוף רוש ומדעי החיים, Kapa Biosystems, ווילמינגטון, MA 01887, ארה"ב</td><td>7959389001</td><td></td></tr><tr><td>אנזים הגבלה: SmaI</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 ארה"ב</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנטים לשעתוק הפוך: qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877, USA</td><td>95107-100</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי RNA: E.Z.N.A. RNA צמחי Kit</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071, ארה"ב</td><td>מק"ט: D3485-01</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase Murine</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA</td><td>R4533</td><td></td></tr><tr><td>אדמה: Metro-Mix 360</td><td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA</td><td>Metro-Mix 360</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA פולימראז ו מאגר</td><td>ניו אינגלנד BioLabs, איפסוויץ', MA 01938-2723 ארה"ב</td><td>M0203S</td><td></td></tr></tbody></table>

וירוס תפוחי אדמה x מבוסס השתקת מיקרונה (vbms) בתפוח אדמה.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

השתקת מיקרו-רנ"א מבוססת וירוסים (VbMS) היא כלי מהיר ויעיל לאפיון פונקציונלי של מיקרו-רנ"א (miRNAs) בצמחים. מערכת VbMS פותחה ויישמה עבור מיני צמחים שונים כולל ניקוטיאנה בנתמיאנה, עגבניות, Arabidopsis, כותנה, וצמחי מונוקוט כגון חיטה ותירס. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט באמצעות וקטורים VbMS מבוססי PVX כדי להשתיק miRNAs אנדוגני בתפוח אדמה. כדי להפיל את הביטוי של miRNA ספציפי, מולקולות חיקוי יעד (TM) של miRNA של עניין מתוכננים, משולבים בווקטורים וירוס הצמח, ובא לידי ביטוי תפוח אדמה על ידי חדירת אגרובקטריום להיקשר ישירות miRNA אנדוגני של עניין ולחסום את הפונקציה שלה.

איור 2 מציג את צמחי תפוחי האדמה PVX-STTM165/166 (קטהדין) עם צמיחה חוץ רחמית של רקמות עלים מהצד האבקסיאלי של למינה עלים לאורך הוורידים. פנוטיפים חמורים יותר כגון היווצרות עלה בצורת חצוצרה נצפו גם. לעומת זאת, לא נצפתה חריגה פנוטיפית במפעלי הבקרה של PVX. תוצאות אלה מראות כי מערכת VbMS הייתה יעילה בדיכוי תפקוד miRNA אנדוגני בצמחי תפוחי אדמה טטרפלואידים ומערכת PVX-VbMS הייתה כלי גנטי חזק כדי לקבוע את הפונקציה של miRNAs ספציפיים או משפחות miRNA.
איו...

אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור וירוס תפוחי אדמה X (PVX)מבוסס microRNA השתקת מערכת (VbMS) כדי לאפיין פונקציונלית microRNAs אנדוגני (miRNAs) בתפוח אדמה. מולקולות חיקוי מטרה (TM) של miRNA של עניין משולבות בווקטור PVX ומתבטאות באופן חולף בתפוח אדמה כדי להשתיק את משפחת ה- miRNA או miRNA היעד.

וירוס תפוחי אדמה X מבוסס השתקת מיקרונה (VbMS) בתפוח אדמה.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

הגישה המסורתית לניתוח תפקודם של מיקרו-רנ"א בצמחים מסתמכת בעיקר על יצירת צמחים יציבים. מערכת השתקת מיקרו-רנ"א מבוססת וירוסים זו אינה דורשת טרנספורמציה מייגעת וגוזלת זמן. השתקת מיקרו-רנ"א מבוססת וירוסים היא כלי מהיר ויעיל לאפיון פונקציונלי של מיקרו-רנ"א בצמחים שניתן ליישם על מגוון רחב של מיני תפוחי אדמה דיפלואידים וטטרפלואידים.מי שידגים את ההליך יהיה ג'ינפינג ז'או, עמית מחקר פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי. כדי לתכנן את מודול חיקוי המטרה, הכנס רצף אי-התאמה לרצף המשלים ההפוך של המיקרו-RNA המעניין באתר המתאים לנוקלאוטידים ה-10 עד ה-11 של המיקרו-RNA. כדי להגביר את שבר חיקוי המטרה הטנדם הקצר, הגדר תגובת PCR עם כל פריימר מעניין, אוליגו חלל של 48 נוקלאוטידים, מאגר PCR פי 10, תערובת dNTP, פולימראז DNA PCR בנאמנות גבוהה ומים מזוקקים כפולים לנפח סופי של 50 מיקרוליטר.לאחר מכן הגבירו את המיקרו-RNA על ידי PCR סטנדרטי באמצעות הפרמטרים כפי שצוין. כדי לטהר את חיקויי המטרה הטנדם הקצרים, הוסף 2.5 נפחים של אתנול ונפח 1/10 של שלוש נתרן אצטט מולארי לתוצר ה-PCR. מערבבים במרץ לפני צנטריפוגה של התגובה ב -14, 000 פעמים G למשך 10 דקות.לאחר הסרת הסופרנטנט, שטפו את הגלולה במיליליטר אחד של אתנול 70% והניחו לגלולה להתייבש, ואז המיסו את הגלולה ב-20 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים. כדי להגדיר תגובת T4 DNA פולימראז, ערבבו את תוצר ה-PCR הקצר המטוהר עם מאגר פולימראז T4 פי 10, דיתיותרייטול מולארי אחד, 100 מילי-מולרי dATP, T4 DNA פולימראז ומים מזוקקים כפולים לנפח סופי של חמישה מיקרוליטר על קרח. לאחר מכן דגרו את התערובת למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן דגירה של 20 דקות בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס כדי לנטרל את הפולימראז T4 DNA.כדי להכין את מבנה ה-VBMS מבוסס PVX, עכל חמישה מיקרוגרם של פלסמידים שיבוט עצמאיים של קשירת PVX עם 2.5 מיקרוליטר של SMA1 בנפח כולל של 100 מיקרוליטר. הוסף נפח שווה של פנול לכלורופורם לאלכוהול איזואמיל, הוסף יחס של 25 עד 24 לאחד למוצרי השיבוט העצמאיים של קשירת PVX המעוכלת עם ערבוב נמרץ ואסוף את המוצר על ידי צנטריפוגה. הוסף נפח שווה של כלורופורם לאלכוהול איזואמיל ביחס של 24 לאחד לסופרנטנט עם מערבולת לפני הכפפת תכולת הצינור לצנטריפוגה שנייה.בסוף הסיבוב, העבירו את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה חדש והוסיפו 2.5 נפחים של אתנול ונפח 1/10 של שלושה נתרן אצטט טוחנת עם ערבוב נמרץ. צנטריפוגה את הצינור ושטוף את הכדור עם מיליליטר אחד של אתנול 70% ומערבולת נמרצת. צנטריפוגה שוב את הצינור והסר את הסופרנטנט כדי לאפשר לכדור להתייבש באוויר.לאחר מכן ממיסים את גלולת הפלסמיד העצמאית של קשירת PVX המעוכלת ב-100 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים. כדי להגדיר את תגובת T4 DNA פולימראז, ערבבו את ה-DNA וקטורי השיבוט הבלתי תלוי בקשירת PVX המעוכלת עם פי 10 מאגר T4 DNA פולימראז, דיתיותרייטול מולארי אחד, 100 מילי-מולרי dTTP ו-T4 DNA פולימראז לנפח סופי של חמישה מיקרוליטר על קרח. לאחר מכן דגרו את התערובת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן דגירה של 20 דקות ב-75 מעלות צלזיוס כדי לנטרל את ה-T4 DNA פולימראז.כדי לשכפל את רצף חיקוי יעד הטנדם הקצר לתוך וקטור השיבוט הבלתי תלוי של קשירת PVX, ערבב חמישה מיקרוליטרים של מוצר חיקוי יעד טנדם קצר שטופל ב-T4 DNA פולימראז עם חמישה מיקרוליטרים של פלסמיד שיבוט עצמאי של קשירת PVX שטופל ב-T4 DNA פולימראז ודגר את התערובת למשך חמש דקות ב-70 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה יש לקרר את תכולת הצינור ל-22 מעלות צלזיוס במכונת PCR בקצב של 0.1 מעלות צלזיוס לשנייה, ולהשאיר את הצינור בתרמו-סייקלר למשך 30 דקות לאחר הגעה לטמפרטורת היעד. בתום הדגירה, הפוך חמישה מיקרוליטרים של תוצר תגובת שיבוט עצמאית לקשירה ל-E.coli DH5 alpha באמצעות פרוטוקולי טרנספורמציה סטנדרטיים וגידול החיידקים המותמרים על צלחת LB המכילה 50 מיקרוגרם למיליליטר קנמיצין.לאחר אימות הרצפים של שברי חיקוי יעד הטנדם הקצרים על ידי רצף מחזור טרמינטור, בודד את הפלסמידים של PVX VBMS מהשיבוטים המאומתים והפוך אותם לזני Agrobacterium המתאימים. כדי לחסן צמחי תפוחי אדמה בני ארבעה שבועות במבחנה עם אגרובקטריום המכיל את הפלסמידים PVX VBMS, בחר טרנספורמנטים חיוביים המכילים וקטורים של PVX VBMS וחסנו את הטרנספורמנטים ב-50 מיליליטר LB נוזלי המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר קנמיצין ו-50 מיקרוגרם למיליליטר ריפמפיצין למשך 16 שעות ב-28 מעלות צלזיוס ו-220 סיבובים לדקה. במהלך הדגירה, פס מושבות אגרובקטריום חיוביות על לפחות שתי לוחות LB חדשים המכילים קנמיצין וריפמפיצין וגדל את התרביות ב-28 מעלות צלזיוס למשך יום אחד.כאשר הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה ל-1.0, אסוף את תרבית הנוזל Agrobacterium על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה בנפח מספיק של מאגר חדירה כדי להתאים את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר ל-1.0. לאחר דגירה של שש שעות בטמפרטורת החדר, טען מזרק ללא מחט של מיליליטר אחד עם תרחיף Agrobacterium והשתמש ביד אחת כדי להפוך ולהחזיק עלה מורחב מצמח תפוח אדמה אחד. בעזרת אצבע אחת, תמכו בלמינה העלים מהצד האדאקסיאלי באתר החדירה הרצוי.והחזק את המזרק אנכי למשטח העלה ביד השנייה, הסתנן 100 עד 200 מיקרוליטר של תרבית אגרובקטריום לצד האבקסיאלי של הלמינה. לאחר מכן, השתמש בקיסם כדי לאסוף מושבות מצלחות תרבית Agrobacterium וכדי לגרד את פני הגבעול של אחד או שניים הפנימיים הראשונים של צמחי תפוחי האדמה שהסתננו והאפידרמיס של הגבעול, ואז לגדל את הצמחים שהסתננו בחממה במשך שבועיים עד ארבעה שבועות. כאשר מופיעים פנוטיפים, השתמש במספריים כדי לאסוף דגימות עם פנוטיפים מ- VBMS ומצמחי בקרה.בודד את סך ה-RNA מהרקמות שנאספו והשתמש ב-PCR טרנסקריפטאז הפוך כדי לנתח את המיקרו-RNA וביטוי ה-mRNA בכל דגימה. בתמונות אלה, ניתן לראות יעד טנדם קצר PVX המחקה 165/166 צמחי תפוחי אדמה עם צמיחה חוץ רחמית של רקמות עלים מהצד האבקסיאלי של למינה העלים לאורך הוורידים. נצפו גם פנוטיפים חמורים יותר כמו היווצרות עלים בצורת חצוצרה.לעומת זאת, לא נצפו חריגות פנוטיפיות במפעלי בקרת PVX, מה שמדגים כי מערכת VBSM יעילה בדיכוי תפקוד מיקרו-RNA אנדוגני בצמחי תפוחי אדמה טטרפלואידים. יעד טנדם קצר PVX מחקה 165/166 צמחי תפוחי אדמה מציגים צמיחה חוץ רחמית של עלה לרקמה מהצד האבקסיאלי של למינה העלה לאורך ורידי הלמינה, מה שמדגים שניתן ליישם את מערכת PVX VBMS על זני תפוחי אדמה אחרים, כולל זני תפוחי אדמה עיקריים. חיוני לחדור בו זמנית לעלים ולחסן את הגבעול של אותו צמח באותה תרבית אגרובקטריום.גישות טרנסגניות להחדרה יציבה של מולקולות חיקוי מטרה לצמחי תפוחי אדמה מומלצות כאשר יש לשמור על מצב ההשתקה של המיקרו-רנ"א הממוקד בדורות הצאצאים.

potato-virus-x-based-microrna-silencing-vbms-in-potato

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

תיאור וירוס-Induced שיטה להשתקת (VIGS) הגן לדפוק למטה של ​​ביטוי...

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

חלקיקים נגיפיים צמח (VNPs) מבטיחים פלטפורמות ליישומים ביו. כאן, אנו מתארים את ההליכים להתפשטות צמח VNP, טיהור, אפיון, וbioconjugation. לבסוף, אנו מראים את היישום של VNPs לביות והדמית גידול תוך שימוש במודל עכבר xenograft ודימות פלואורסצנטי.

חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

שיטה לנתח את נגישות הממס של קבוצת thiol של שאריות ציסטאין...

ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על<em&gt; תירס rayado Fino וירוס</em&gt; חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; צמחים וקישור צולב של פפטידים לVLPs

אגרואינפיציה ו- PVX agroinfection הם מבחנים תפקודיים שגרתיים לביטוי חוץ רחמי חולף של גנים בצמחים. שיטות אלה הן מבחנים יעילים באסטרטגיות אפקטאורומיות (התנגדות מהירה ותגלית גנים ארסית) וחיוניות למחקר מודרני בפתולוגיה של צמחים מולקולריים. הם עונים על הביקוש לניתוח תפקודי חזק בעל תפוקה גבוהה בצמחים.

אגרוינפינציה ו- PVX אגרוינבינציה בתפוח אדמה וניקוטיאנה בנתאמיאנה

וירוס-Induced השתקת הגן היא כלי שימושי לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות nonhost של צמחים. אנו מדגימים את השימוש בחיידקים פתוגנים המבטאים GFPuv בזיהוי גנים מושתקים צמחים רגישים לפתוגנים nonhost. גישה זו היא קלה, מהירה ומאפשרת הקרנה בקנה מידה גדולה ופרוטוקול דומה ניתן ליישם בחקר אינטראקציות צמח חיידק אחרים שונות.

הקרנת גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות Nonhost

אנו מתארים כאן שיטה לוויסות טרופיזם של נגיף הפיקורנה על ידי שילוב רצפים משלימים למיקרו-רנ"א ספציפיים בגנום הנגיפי.  ניתן להתאים פרוטוקול זה לכל סוגי הנגיפים השונים עם שינויים המבוססים על אורך ואופי מחזור החיים שלהם.

תקנה מבוססת MicroRNA של Picornavirus כמיהות

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים להפוך את תפוחי האדמה צמחים. הטרנספורמציה Agrobacterium tumefaciens מוביל צמח מהונדס מלאה בעוד Agrobacterium rhizogenes מייצרת הטרנסגניים שורשים שעירים יורה פראי סוג זה יכול להיות עצמי שעבר בירושה. אנחנו מכן לזהות יזם פעילות על-ידי גאס צביעת שורשים טרנספורמציה.

Agrobacterium tumefaciens , Agrobacterium rhizogenes-מתווכת טרנספורמציה של תפוחי אדמה, יזם פעילות של גן Suberin על ידי גאס Staining

כאן, אנו מציגים שיטת הקרנה שונה שניתן להשתמש בהרחבה כדי להקרין במהירות RNA השתקה דכאי במחלות צמחים.

הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח

שיטה זו ממחישה את השימוש בטכניקת הכלאה הצפוני כדי לזהות miRNAs מתוך תמצית RNA מוחלטת.

ה-RNA ניתוח כתמי לזיהוי וכימות של מיקרורונאס הצמח

פרוטוקול הזרקה מבוסס אגרובקטריום (אגרובקטריה) מוצג לחיסון של וירוס פסיפס זנב שועל ווירוסי פסיפס קני סוכר לשתילי תירס. חיסון באופן זה מוביל לזיהום ויראלי, השתקת גנים הנגרמת על ידי וירוס של גנים סמן, ו overexpression ויראלי של GFP.

אגרוינוקולציה ישירה של שתילי תירס על ידי הזרקה עם וירוס פסיפס זנב שועל רקומביננטי ווירוס פסיפס קנה סוכר שיבוטים זיהומיות

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקר קצב התחלת מוות תאי מתוכנת על ידי הדמיה רציפה של עלים מחוסנים לאחר השראת מוות תאי.

חקר התחלת מוות תאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי

חקור שתיקת מיקרונה מבוססת וירוס PVX בתפוחי אדמה ללא צורך בהשתלות יציבות. שיטה זו מאפשרת אפיון פונקציונלי מהיר ויעיל של miRNA בצמחים דיפלואידיים וטטרפלואידיים.

וירוס תפוחי אדמה X מבוסס השתקת מיקרונה (VbMS) בתפוח אדמה.

גלה סרטונים נוספים