במודל מחלה מיקרופלוידיקית במבחנה ללמוד אינטראקציות דם-אנדותל שלם ודינמיקת קריש דם בזמן אמת

אנו מציגים מודל מחלת כלי דם במבחנה לחקור אינטראקציות דם שלם עם אנדותל נגזר המטופל. מערכת זו מאפשרת לחקור תכונות טרומבוגניות של תאי אנדותל ראשוניים בנסיבות שונות. השיטה מתאימה במיוחד להעריך את הטיפול situ thrombogenicity ונוגדי קרישה בשלבים שונים של קרישה.

מודל זה מחלת במבחנה, ניתן להשתמש כדי ללמוד את האינטראקציה של דם שלם ותאים נגזר החולה, במיוחד אנדותל, כדי להעריך את פקקת ואת האפקטיביות של סוכנים נוגדי קרישה. זהו תאי אנדותל ניתן להשתמש בנסיבות שונות והוא יכול להיות שונה על ידי החדרת microfluidics בהתאמה אישית או על ידי התאמת פרמטרים זרימת הדם. בנוסף, מודל זה יכול לשמש לחקר דינמיקת טרומבוס בתנאים דלקתיים, או להעריך את ההשפעות של טיפול נוגד קרישה ו antiplatelet.

בסופו של דבר, גישות אלה ניתן להשתמש בשיטה של רפואה מותאמת אישית. לאחר קבלת דגימת רקמת עורק ריאתי אנושית כירורגית, מעיל תא זיקה גבוהה מחייב 60 צלחת תרבות תאים מיליליטר עם שני מיליליטר של חמישה מיקרוגרם לכל פיבורונקטין מיליליטר להדגיר את המנה ב 37 מעלות צלזיוס לפחות 15 דקות. בסוף הדגירה, להשתמש מדפים סטריליים ארון זרימה למינארית בתנאים סטריליים, כדי להעביר את הרקמה לתוך צלחת פטרי של PBS.

אם הרקמה עדיין בטבעת, לחתוך את העורק פתוח עם מספריים, דואג לא לגעת בשכבה הפנימית ביותר של הכלי, כמו אנדותל ניזוק בקלות הוסר. לאחר הסרת fibronectin, להוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום תא אנדותל מלא לצלחת ולהשתמש ממטרות להעביר את דגימת הרקמה לתוך המדיום, להשתמש באזמל כדי לגרד בזהירות את השכבה הפנימית של הכלי לתוך המדיום, דואג למנוע כל הצטברויות השומנים שנצפו בקיר הכלי. לאחר שהתאים נקצרו, מניחים את הצלחת באינקובטור של תרבות התאים.

אם fibroblasts לזהם את התרבות, להשתמש בהפרדת תאים זיקה מגנטית עבור CD144, על פי הוראות היצרן כדי לטהר את התאים. בדרך כלל, התרבות מוגדרת טהורה, כאשר ציטומטריית זרימה מזהה 10% או פחות תאים מזהמים. כאשר המספר המספיק של תאי אנדותל הושגו לשימוש ניסיוני, ניתן לאפיין את תאי ה אנדותל העיקריים לנוכחות סמנים ספציפיים לתאי אנדותל ולהיעדר סמני שרירים חלקים ותאי אפיתל.

להכנת תא זרימה, קוד ערוץ אחד של שש שקופית זרימה היטב עם 30 microliters של 0.1% ג'לטין דגירה שקופית זו לפחות 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בנוסף לתאי זרימה מסחריים, ניתן להשתמש בתאי זרימה מותאמים אישית עם ממדים ספציפיים כדי לחקור את השפעת הגיאומטריה של כלי הדם על דינמיקת הקריש. בזמן שהשקופית דגירה, לאסוף את התאים מתרבות תאים אנדותל עורק ריאתי confluent עם EDTA ו טריפסין ומשקע כי תאים על ידי צנטריפוגה, להשעות את גלולה ב 600 microliters של תא אנדותל מלא בינוני בכוח אבל בעדינות, להוסיף 100 microliters של תאים לתוך כל ערוץ, להוסיף 50 microliters נוספים של תא אנדותל מלא מדיום לערוץ כדי לספק מדיום מספיק עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, לשנות את המדיום למחרת לשטוף את התאים הלא מאוגדים.

לאחר שישה ימים בתרבות, התאים היו צריכים להיווצר מונוליאר קונפלנטי יציב. ביום השביעי של תרבות תאי ה אנדותל עורק ריאתי, לרכוש דגימות דם הוורידי מנבדקים שאינם מקבלים טיפול נוגד קרישה לתוך 109 צינורות monosodium citrate נוגד קרישה ולהעביר את הדם לתוך צינור 50 מיליליטר. דם יכול להכיל וירוסים וסוכנים זיהומיות אחרים.

לכן חשוב תמיד ללבוש כפפות ולעקוב אחר הנחיות הבטיחות לעבודה עם חומר אנושי. פלואורסצנטי שכותרתו תאי הדם עם 1 עד 10, 000 ריכוז של Calcein AM אדום ו 50 מיקרוגרם למיליליטר ולהוסיף אלקסה 488 פיברינוגן, ולאחר מכן דגירה הדם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לאפשר ספיגה מלאה. 30 דקות לפני חיסון, לטפל בתאי אנדותל עורק ריאתי עם 100 microliters של היסטמין מיקרומולרי אחד בינוני תא אנדותל ו 1% סרום לב העובר ללא תוספים אחרים.

ולהשתמש מזרק 20 מיליליטר מלא חיץ לשטוף לשטוף את צינורות מערכת הזרימה, לטעון מזרק שלישי עד 20 מיליליטר עם שני מיליליטר של חיץ לשטוף לטעון את המזרק על משאבת מזרק. השתמש מזרק שני 20 מיליליטר כדי למלא את צינורות הזרימה עם היפים בתוספת חיץ המכיל אלבומין סרום 1%bovine ולהשתמש בצורת מרפק המחבר לורה כדי לחבר בזהירות את הצינורות לשקופית מיקרו, לחבר את השקע של השקופית למזרק, לתקן מיקרוסקופיה על ידי הצבת התא המכיל שקופית על הבמה והרכבת ההתקנה לניסוי התאם את המיקרוסקופ והגדר את הפרמטרים להדמיה. חישוב מחדש של דם נחות.

וזה מממן שותף שמח של קרישה, יתר על כן לנסות למנוע היווצרות של בועות אוויר כי זה יהיה פגום שכבת התא אנדותל ולהשפיע על התוצאות שלך. מיד לפני הזיכוי, לדלל את הדם פעמיים עם חיץ חישוב מחדש ולמקם את צינור inlet של המיקרו להחליק לתוך הצינור של הדם, לחץ להתחיל על משאבת המזרק. ברגע שהדם מתחיל לזרום מעל ה אנדותל, לחץ על המיקרוסקופ כדי לרכוש תמונות באמצעות ערוצים פעילים שנבחרו מראש ואזור של עמדות עניין, כל 15 שניות במשך חמש דקות.

בסוף הניתוח, לעצור את ההקלטה ואת משאבת המזרק ולנקות כראוי. תיוג טסיות דם עם Calcein AM אדום ותוספת של אלקסה 488 פיברינוגן משותף, מאפשר את החקירה של היווצרות טרומבוס על ידי הידבקות טסיות דם וסיבים ותצהיר. בתנאים שאינם מגורים, אין כריכה של טסיות דם או פיברין לאנדותל.

גירוי עם היסטמין גורם לעלייה מיידית בהיתוך טסיות הדם, שמגיע לרמה לאחר 2.5 דקות, בשלב זה, טסיות הדם מתחילות להפרש גורמים אוטוקריניים הגורמים לצבירה של טסיות דם ומחשוף פיברינוגן לפיברין, וכתוצאה מכך סיבים ותצהיר בשלוש דקות והיווצרות צבירה יציבה עם טסיות הדם לאחר ארבע דקות. טיפול נוגד קרישה ישיר, מעכב היווצרות קריש והן הידבקות טסיות דם בהשוואה לדם לא מטופל. ניתוח Immunofluorescent של אינטראקציות טסיות דם אנדותל עורק ריאתי לאחר חמש דקות של חיסון, מגלה תחזוקה של התא אנדותל, מגעים התא, כפי שאושר על ידי דלקת קדרטין אנדותל כלי דם, המציין כי קרישי הדם טופס על שכבות מודל אנדותל ולא על המטריצה הבסיסית בין פערי אנדותל.

תאי אנדותל ורידים אנושיים מדגימים פחות הידבקות טסיות דם ותצהיר פיברין בהשוואה לאנדותל עורק ריאתי. יש לציין, תאי אנדותל עורק ריאתי ראשוניים חולים מחולי יתר לחץ דם ריאתי תרומבואמבוליים כרוניים, מפגינים הידבקות מוגברת טסיות ותצהיר פיברין יותר בהשוואה לתאים בריאים. תרומבוגניות של אנדותל תלויה בגורמים מרובים כמו מקור מיטת כלי הדם או החלקים של הרקע הביולוגי.

באמצעות פרוטוקול זה, תפקוד לקוי מהותי של מרכיבי כלי הדם והדם, כמו גם את האפקטיביות של טיפול נגד קרישה ניתן לבדוק בשלבים שונים של חמוץ פקקת. פרוטוקול זה יכול לשמש להבנת אינטראקציות דם ותיאו, במחלות תרומבואמבוליות שונות עם הפוטנציאל האולטימטיבי לחזות תגובות ספציפיות למטופל לטיפול נגד קרישה.