מודל של מחלות לב איסכמיות והשוואה מבוססת וידאו של התכווצות קרדיומיוציטים באמצעות קרדיומיוציטים נגזר hiPSC
5 במאי 2020
אנו מציגים מודל של מחלת לב איסכמית באמצעות cardiomyocytes נגזר תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם, יחד עם שיטה להערכה כמותית של נזק לרקמות הנגרמת על ידי איסכמיה. מודל זה יכול לספק פלטפורמה שימושית לסינון תרופות ומחקר נוסף על מחלות לב איסכמיות.
מחקר מחלות לב מבוצע לעתים קרובות בקטנים ויונקים כגון מכרסמים. עם זאת, הפיזיולוגיה של הלב האנושי שונה באופן משמעותי מזה של לב המכרסם. הפרוטוקול שלנו משתמש בקרדיומיוציטים המובדלים מתאים אנושיים של IPS כדי ליצור מודל למחלות לב איסכמיות ולכמת את הנזק והפגיעה התפקודית של קרדיומיוציטים איסכמיים.
פרוטוקול זה עשוי לספק שיטה נוחה להקרנת תרופות מותאמות אישית באמצעות תאי iPS הנגזרים מחולים בודדים, הטיפול המתאים בתאי IPS, כגון שימוש במדיום טרי, ושינוי המדיום לאט ובדייקנות הוא קריטי להבטחת התבלטות מוצלחת לקרדיומיוציטים תפקודיים. הדגמת ההליך עם יון ליו, יין ליאנג ומנגקסו וואנג יהיה צ'ן וואנג, דוקטורנט ממעבדה. כדי לגרום להתמדה של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם לתאי לב, ראשית מצפים את הבאר של צלחת תרבות באר 96 עם 100 מיקרוליטרים של 1.675 מיקרוגרם למיליליטר של למינין ב- PBS.
לאחר דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לראות שלוש פעמים 10 לתאי הגזע הרביעי ב 200 microliters של אמצעי תחזוקה IPS בתוספת 10 micromolar Y27632 לתוך כל באר, ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא. לאחר 24 שעות, החלף את אמצעי העל ב-200 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה של IPS ל הבאר, והחזר את הלוחית לאנקובטור לתרבות התאים למשך יומיים-שלושה נוספים. כאשר התאים מגיעים ל- 70 עד 80%confluency.
החלף את המדיום בכל באר עם 200 microliters של אמצעי התברות מחומם מראש A ולהחזיר את הצלחת לחממה תרבות התא עוד 48 שעות. בסוף האינקובציה החליף לאט את העל-טבעי בכל באר עם 200 מיקרוליטרים של בידול מחומם מראש בינוני B והחזיר את הצלחת לחממה לתרבות התאים. לאחר יומיים, החליפו את העל-טבעיים ב-200 מיקרוליטרים של מדיום תחזוקה קרדיומיוציט מחומם מראש ל הבאר והחזירו את הצלחת לחממת תרבות התאים למשך עד 30 יום.
כדי להעריך את ההתכווצות של cardiomyocytes, להתקין את תמונת החלקיקים velocimetry תמונה j תוסף ולהשתמש מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ואת המטרה מזלגות להקליט תמונות וידאו של התאים בערך 20 מסגרות לשנייה במשך כ 10 שניות. לאחר מכן שמור את קובץ הווידאו כפי שניתח את ה- API שלנו וצור מבנה תיקיות כמצוין. כדי לנתח שדות וקטוריים דו מימדיים דיסקרטיים של תזוזה סלולרית, הפעל VG ובחר תוספים, פקודות מאקרו וערוך כדי לפתוח ניתוח וקטורי.
ijm, ולאחר מכן לחץ על הפעל את הניתוח תבוצע באופן אוטומטי. לטיפול איסכמי, החלף את העל-טבעי בכל באר ב-200 מיקרוליטרים של dmem ללא גלוקוז וסרום, ולאחר מכן הנח את הצלחת בתא היפוקסי ואז החדר גז חנקן לתא, תוך שמירה על ריכוז החמצן הפנימי ב-2% ועל ריכוז הפחמן הדו-חמצני ב-5% למשך 24 שעות. תאים מובחנים בהצלחה, מדגים התכווצות ספונטנית כפי שנצפה תחת המיקרוסקופ עם 50% מ בארות התרבות בדרך כלל מפגינים התכווצות ספונטנית בפחות מ -20 יום.
חלבון סמן לב יכול לשמש גם כדי לאשר התבלטות מוצלחת תאים מהקבוצה האיסכמי בדרך כלל להפגין כדאיות נמוכה יותר בבדיקת MTT, והתכווצות נמוכה יותר מאשר אלה של קבוצת הביקורת הנורמוקסית. היחס בין תאים חיוביים פרופידיום יודיד הוא גם גבוה יותר בקבוצה איסכמי, מאשר בקבוצת הביקורת, המציין שכיחות גבוהה יותר של נזק תאי. חשוב שתאתר במדויק את אזורי העניין בצלחת הלכידה כדי לאפשר השוואה של התכווצות הקרדיומיוציטים.
טכניקה זו יכולה לשמש להקרנת סמים, באמצעות תאי iPS שמקורם בחולה. הוא גם מספק פלטפורמה ייחודית להבהרה נוספת של המנגנונים שבבסיס מחלות לב איסכמיות
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול למודלינג של מחלת לב איסכמית באמצעות קרדיומיוציטים שהבדילו מתאי גזע אנושיים פלוריפוטנטיים מושריים (hiPS-CMs). השיטה מאפשרת כימות של נזק תאי וליקוי תפקודי בתנאי איסכמיה, ובכך מספקת פלטפורמה בעלת רלוונטיות קלינית למחקר של מחלות לב ולסריקת תרופות מותאמת אישית.
מרכיבים מרכזיים של המחקר
תחום המדע
- מחקר קרדיווסקולרי
- ביולוגיה של תאי גזע
- פיזיולוגיה תאית
רקע
- מחלה איסכמית של הלב היא סיבה מובילה לתמותה ברחבי העולם.
- מודלים של מכרסמים נמצאים בשימוש נרחב, אך הם שונים משמעותית מהפיזיולוגיה של הלב האנושי.
- קרדיומיוציטים המופקים מתאי iPS אנושיים מציעים מודל רלוונטי יותר לחקר מחלות לב אנושיות.
- קיים צורך בפלטפורמות המאפשרות הן מידול של מחלות והן סריקת תרופות בהקשר אנושי.
מטרת המחקר
- קביעת פרוטוקול להגזלגול של תאי iPS אנושיים לתאי שריר לב (cardiomyocytes).
- מידול מחלה איסכמית של הלב in vitro באמצעות hiPS-CMs.
- כימות הנזק התאי והליקוי התפקודי בתנאי איסכמיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הבדלה של תאי iPS אנושיים לתאי שריר לב (cardiomyocytes) באמצעות מצעי תרבית עוקבים ופלטות מצופים בלמינין.
- השראת איסכמיה על ידי חשיפה של hiPS-CMs ל-2% חמצן ומצע נטול גלוקוז/סרום למשך 24 שעות בתא היפוקסי.
- הערכת חיוניות התאים באמצעות בדיקות MTT וצביעה בפרופידיום יודיד.
- מדידת כושר התכווצות באמצעות ניתוח שדה וקטורי של העתקה, תוך שימוש במיקרוסקופיית ניגודיות פאזה ותוכנת PIV (particle image velocimetry).
תוצאות עיקריות
- תנאים איסכמיים הגבירו את אחוז התאים הפגועים, כפי שהתבטא בצביעה גבוהה יותר של propidium iodide.
- חיוניות התאים פחתה בקבוצה האיסכמית בהשוואה לקבוצות הביקורת.
- הכושר התכווצות של hiPS-CMs פחת תחת תנאים איסכמיים.
- בקירוב 50% מבארות התרבית הראו התכווצות ספונטנית בתוך 20 ימים מהדיפרנציאציה.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק מודל in vitro חסון למחלה איסכמית של הלב תוך שימוש בתאי שריר לבביים (cardiomyocytes) ממקור אנושי.
- מערכת זו מאפשרת כימות הן של הנזק התאי והן של הליקוי התפקודי.
- המודל מתאים לסריקת תרופות מותאמה אישית ולמחקרים מכניסטיים נוספים של מחלה איסכמית של הלב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים של תאי שריר לב (cardiomyocytes) המופקים מ-iPSC אנושיים מגשרים על הפער התרגומי בין מחקרים במכרסמים לבין מחלות לב אנושיות, ובכך מאפשרים גילוי מדויק יותר בשלבים מוקדמים עבור מחלה לב איסכמית. ניתוח כיווציות כמותי מבוסס-וידאו ובדיקות חיוניות מספקים נתונים יישומיים לתיקוף מטרות ולצמצום סיכונים מכניסטיים. פלטפורמה זו תומכת בקבלת החלטות בתיקי פיתוח מותאמות סיכון ובאסטרטגיות לסריקת תרופות מותאמת אישית במחקר ופיתוח (R&D) קרדיווסקולרי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנוני פגיעה איסכמית במערכת רלוונטית לבני אדם.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מדדי כיווץ וחיוניות כמותיים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מידול תגובות תאיות הרלוונטיות למחלה.
- משפר את הביטחון החזוי לצורך מיון מוקדם של פורטפוליו בתוכניות קרדיו-וסקולריות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה סטנדרטית של קרדיומיוציטים מהפכים (hiPSC-cardiomyocyte) להערכה הדירה של תרכובות.
- מספקת מדדי כיווצות כמותיים באמצעות ניתוח שדה וקטורי של ההעתקה.
- מאפשרת סריקה מבוססת וידאו, ניתנת להרחבה, לצורך זיהוי ליקויים תפקודיים תחת תנאי איסכמיה.
- תומכת במוכנות של הבדיקה לסריקת תרופות להמשך ולמחקרים מכניסטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מעמיד את הממצאים in vitro בהלימה עם הביולוגיה של מחלות בבני אדם לצורך רציפות תרגומנית.
- מאפשר שימוש בתאים המופקים מחולים לצורך פרופיל תגובה מותאם אישית לתרופות.
- מפחית את ההסתמכות על מודלים שאינם אנושיים, ובכך משפר את הרלוונטיות למחלה של נתונים פרה-קליניים.
- תומך בגילוי ובתיקוף של סמנים ביולוגיים (biomarkers) בהקשר רלוונטי קלינית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מודל איסכמיה של תאי שריר לב (cardiomyocytes) המופקים מ-hiPSC מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים, זיהוי מולקולות מובילות (lead identification) ומחקר תרגומי, על ידי אספקת נקודות קצה תפקודיות ומדדי חיוניות ספציפיים לבני אדם.
- ביולוגיה של גילוי: מכמת פגיעה איסכמית וליקוי תפקודי התכווצות לצורך בדיקת השערות ואנליזה של מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספק פלטי של כושר התכווצות וחיוניות כמותיים וניתנים לשחזור לצורך מיון תרכובות.
- אנליטיקה: משלב אנליזת העתקה מבוססת וידאו ובדיקות חיוניות לצורך השוואה סטטיסטית חסונה.
- מחקר תרגומי: מאפשר מידול ספציפי למטופל ותומך בהתאמת סממנים ביולוגיים עם נקודות סוף קליניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה לגילוי תרופות קרדיווסקולריות ומחקרים מכניסטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות תפקודיות ותומך בזרימות עבודה הניתנות לשכפול ולהרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום של נכסים קרדיווסקולריים בהתאם לסיכון המותאם.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרבית hiPSC, בידול ותיקוף של סממנים לבביים.
- נדרשת גישה לתאי היפוקסיה, למיקרוסקופיית ניגודיות פאזה ולתוכנה לניתוח וידאו.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת הדירות של הבדיקה ויכולת השוואה של הנתונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור שורות iPSC שונות המופקות מחולים או עבור תת-סוגים של מחלות.
- בחירה קפדנית של אזור העניין (ROI) היא קריטית להשוואה מדויקת של כושר התכווצות.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:05
Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC) Cardiac Differentiation Induction
2:30
Induced Pluripotent Stem Cell-Cardiomyocyte (iPS-CM) Contractility Assessment
3:15
Ischemia Exposure
3:42
Results: Representative Cardiac Cell Differentiation
4:27
Conclusion
