שיטת תפוקה גבוהה עבור מדידת אלכוהול הרגעה זמן של הפרט דרוזופילה מלאנוגסטר

Drosophila מספק מודל מצוין ללמוד את תריסים גנטיים של רגישות לאלכוהול כי אתה יכול לכמת את הרגישות לאלכוהול דווקא תחת רקע גנטי מבוקר ותנאים סביבתיים. השיטות הנוכחיות למדידת רגישות לאלכוהול בקבוצות בדיקה Drosophila של זבובים. אנו מציגים שיטה פשוטה, בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה כדי להעריך את הרגישות לאלכוהול במספר רב של זבובים בודדים.

וריאציה ברגישות לאלכוהול ב Drosophila ניתן לתרגם פנוטיפים דומים בבני אדם כי זבובים חולקים כ 75% מהגנים שלהם עם אורתולוגים אנושיים. ניתן ליישם את הראיה שפיתחנו גם כדי למדוד את ההשפעות של רעילות חריפה של נדיפים על חרקים אחרים, כולל מיני זבובים אחרים או וקטורים של מחלות. התחל ביצירת תבנית קרטון של צלחת תרבות תאים 24 באר.

תאתר את הצלחת, ותחתוך את האזור המיועד. לאחר מכן השתמש בתבנית הקרטון כדי ליצור חתיכת רשת מסך חרקים קטנה בגודל הצלחת. מניחים שורה קטנה של דבק חם סביב ההיקף של צלחת תרבות 24 בארות, ולהדביק את רשת המסך על גבי הבארים.

לאחר מכן השתמש באקדח הדבק החם כדי לאבטח מקל מלאכה מעץ לשלושה צדדים של צלחת התרבות. הכינו כמה שיותר צלחות שיכולות להתאים לתא הצילום. כדי ליצור את תא הצילום, לחתוך חור בגודל של עדשת מצלמת וידאו בצד אחד של תיבת פוליסטירן וחץ נוסף על גודל כרית התאורה בצד הנגדי.

הכנס את כרית התאורה לתוך ההארכה, והצב את המצלמה בחור העדשה מעל כרית התאורה. מניחים את כל חומרי הבדיקה בסביבה מבוקרת, רצוי תא התנהגותי עם כ 30% לחות, 25 מעלות צלזיוס טמפרטורה, זרימת אוויר אחידה, ורמות רעש פחות מ 65 דציבלים. השתמש בתבנית הקרטון שנעשתה בעבר כדי לחתוך שתי חתיכות של מטלית גבינה.

ואז פיפטה מיליליטר אחד של 100% אתנול דרך רשת המסך לתוך כל באר. מייבשים את רשת, ומ מניחים את שתי חתיכות הגבינה על גבי. חותכים חתיכה קטנה של קרש חיתוך דק, גמיש, פלסטיק באמצעות תבנית קרטון כמדריך להרחבת האזור על ידי אחד עד שני סנטימטרים על אחד הצדדים הקצרים.

לאחר החיתוך, ודא כי הפלסטיק עדיין מתאים בין שלושת מקלות מלאכה עץ על מנגנון הבדיקה אבל תלוי בקצה אחד. הכינו שאפתן לפי הוראות כתב היד, ולהשתמש בו כדי להעביר זבוב אחד לתוך צלחת תרבות תאים 24 בארות, מכסה את כל הבארים עם זבובים שאפו בעבר עם פלסטיק גמיש. רשום את מיקום הבאר ואת כל המידע הרלוונטי של גנוטיפ או פנוטיפ של כל זבוב.

החזק את סומק פלסטיק גמיש עם החלק העליון של צלחת תרבות התא המכיל את הזבובים, ולהפוך את הצלחת על החלק העליון של צלחת תרבות התא שונה עם אתנול. השתמש במקלות מלאכה כדי ליישר את צלחת תרבות התא ההפוך, לוודא כי כל טוב עם אתנול מתיישר עם כל באר המכילה זבוב. ודאו שפד התאורה דולק במלוא הבהירות, והתחלו להקליט באמצעות מצלמת הווידאו.

חשוף את הזבובים לאתנול על ידי הסרה זהירה של הפלסטיק בין שתי הצלחות, הקפד לא לנתק את מטלית הגבינה. כאשר יש חשד כי כל הזבובים איבדו שליטה יציבה, הקש בחוזקה במרכז הצלחת. אם יש תנועה, המשיכו להקליט, הקשה כל דקה עד שתי דקות עד שלא תתרחש תנועה.

סיים את ההקלטה ברגע שאין תנועה. כדי לשחזר את הזבובים, להסיר את הצלחת העליונה מן מנגנון הבדיקה, ולזעוף בודדים לתוך מיכלים שנבחרו. החלף את האתנול צלחות תאים שונה לפחות פעם בשעה כדי לשמור על חשיפה אתנול עקבי לאורך כל ההתמדה, ולחזור על הניסוי עבור דגימות רבות ככל הרצוי.

צפה בהקלטת הווידאו כדי לקבוע את זמן הרגעה לטוס, אשר מוגדר כרגע זבוב מאבד שליטה יציבה ויכולת לוקומוטור. כדי להבטיח דיוק, צפה בסרט הפוך והקליט את הזמן שבו הזבוב מתחיל לנוע. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי ליצור נתונים על מספר גדול של זבובים בתוך 10 דקות.

שתי צלחות 24 באר שימשו בו זמנית למדוד זמני סם אתנול עבור 48 זבובים בודדים של שני קווי DGRP עם רגישויות שונות לאלכוהול. גדלי מדגם גדולים מגבירים את הדיוק ומפחיתים את השגיאה לשינויים סביבתיים. RAL_555 היו פחות רגישים מזבובי RAL-177.

זכרים ונקבות RAL_177 לא הראו השפעה שונה מבחינה מינית, ואילו הנקבות של קו RAL_555 היו פחות רגישות לחשיפה לאתנול מאשר הזכרים. כאשר מנסים פרוטוקול זה, חיוני לבצע את השאיפה של זבובים היפוך של צלחת תרבות התא עם דיוק כדי להשיג את התוצאה הרצויה. מאז היכולת להעריך זבובים בודדים נמנע השפעות מבלבלות עקב אינטראקציות קבוצתיות, הערכה זו משפרת את התועלת של מודל Drosophila עבור מחקרים תפוקה גבוהה על השפעות חריפות של חשיפה לאלכוהול.