וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

בפרוצדורות של התפרצויות המתווכות על ידי ארבּו-וירוס (arbovirus), הצעדים למניעה מוגבלים במידה רבה להדברת יתושים. לכן, ניתוחים של כשירות וקטורית (vector competence) הם אסטרטגיות מניעה קריטיות, כיוון שהם קובעים אילו אוכלוסיות ומיני יתושים יכולים לשמש כווקטורים עבור ארבּו-וירוס מסוים, ולפיכך צריכים להוות את היעד להדברה. לפיכך, אחד הרכיבים החשובים ביותר בארגז הכלים שלנו להערכת תפקידם של יתושים ושל וקטורים אחרים בהעברת מחלות זיהומיות הוא מחקר כשירות וקטורית. אלו הם ניסויים שבהם אנו יכולים לשלוט בדיוק רב, לא רק במין היתוש או הקרציה, למשל, אלא גם בזנים גיאוגרפיים, וכן בזנים ספציפיים מאוד של וירוס שונה או אורגניזם זיהומי אחר, כדי לקבל נתונים מדויקים ומבוקרים היטב על הסיכון של מינים שונים להעברת גורמים שונים בחלקים ספציפיים מאוד של העולם. עבודה עם יתושים נגועים דורשת מתקנים ייעודיים, הכשרה, ניסיון ותכנון קפדני כדי למזער את הסיכונים עבור הנסיין, כמו גם את הסיכונים הנובעים מבריחה של יתוש נגוע. לכן, חשוב מאוד שאנשים חדשים במתקנים אלו יקדישו זמן לעבוד עם יתושים שאינם נגועים בדם, כדי להכיר את הטכניקות ואת זרימת העבודה.

ביום החשיפה, הפעילו את מקור המתח במתקן להכלה של פרוקי רגליים כדי לחמם מראש את יחידות ההאכלה. ערבבו דם אנושי שנקטף טרי, שעובד עם ציטראט או הפרין, עם מלאי נגיפי ביחס נפחי של אחד לאחד, וכסו יחידת מאגר סטנדרטית של שלושה מיליליטר בעורה של עכבר נאיבי שאינו נגוע. הניחו את המאגר המכוסה על נייר סופג לבן, והוסיפו למאגר כשני מיליליטר של דם זיהומי, בתוספות של מיליליטר אחד בכל פעם.

לאחר מכן, בדקו בעזרת נייר סופג כדי לוודא שאין דליפות. 24 שעות לפני ביצוע הבדיקה לזיהומיות, הכינו פלטות תרביות תאים של 24 בארות עם תאי Vero, וסמנו כל בארה בזהות היתוש והדגימה. בבוקר שבו יעמדו היתושים לחשיפה לארוחת דם זיהומית, הסירו את כדורי הצמר הספוגים במים, וחברו למוליכי יחידת ההאכלה מאגרי דם מלאכותיים באמצעות קופסת כפפות פלסטית שקופה לאיסור.

הניחו את קופסת הקרטון עם היתושים המורעבים בתוך תא הכפפות מתחת ליחידת ההאכלה. עם סיום ההאכלה, הוציאו את המאגר ושקעו אותו בתמיסת אקונומיקה 10% שהוכנה טרי. בתוך תא הכפפות, שפכו את היתושים המורדמים והקרים לתוך צלחת פטרי על קרח, והפרידו בין היתושים השבעים לאלו שלא שבעו.

שפכו את הפשישים השבעים חזרה אל קופסת הקרטון, וכסו אותה במהירות בעזרת רשת ומכסה. גזרו את שאריות רשת המגן מקופסת הקרטון, ואבטחו את המכסה בעזרת סרט דביק. הוסיפו לרשת כדור צמר ספוג ב-10% sucrose מסונן וסטרילי, והניחו את הקופסה בתוך מיכל פלסטיק משני גדול עם ספוג לח לשמירה על הלחות.

דגרו את המכל המשני בטמפרטורה של 27 degrees Celsius, ואפשרו ליתושים גישה ad libitum לסוכרוז עד לסיום הניסויים. השתמשו בשואב מכני כדי לאסוף מספר קבוע מראש של יתושים מדוגר מהקרטון, וסגרו את שפיית האיסוף באמצעות פד כותנה בסיום הפעולה. בעבודה בתוך תא כפפות, שפכו את היתושים המורדמים והקרים אל צלחת פטרי על קרח.

הסר את כל שש הרגליים של כל פיתוש, והנח אותן בתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר המסומנת מראש, המכילה מיסב כדור מפלדת אל חלודה סטרילית ו-500 microliters של מדיום לאסוף פיתושים, או MCM. הנח בעדינות את הפיתוש על טיפה של שמן מינרלי, תוך הקפדה שהשמן לא יבוא במגע עם ראש הפיתוש או עם החרטום שלו. הכנס את החרטום לתוך קצה של מיקרו-פיפט המולא ב-10 microliters של FBS שעבר נטרול בחום, ואפשר לפיתוש להפריש רוק במשך 30 דקות.

הוצא את טיפ הפ pipette עם הרוק אל תוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה המכילה 100 µL של MCM, והנח את הגוף למבחנה נפרדת של 2 mm המכילה כדור פלדה סטרילי ו-500 µL של MCM. העבר את המבחנות למכשיר הומוגניזציה של רקמות באמצעות טחינת חרוצים בתוך קבלית בטיחות ביולוגית, וטחון את כל דגימות הגוף והרגליים בתדר של 26 Hz למשך חמש דקות כדי לשחרר חלקיקים נגיפיים אל התסמינן. הבהר את כל הדגימות באמצעות צנטריפוגציה ב-200 ×g למשך חמש דקות כדי להשקיע את השאריות התאיות.

מיד לפני ההחדרה של הדגימות, הסר את המצע מתאי ה-Vero שהוכשרו מראש. חלק בזהירות 100 µL של על-נוזל (supernatant) מזוקק מגוף או מהרגליים לכל באר, תוך הקפדה לא להפריע לשאריות תאי היתוש שנמצאים במשקע. לאחר מכן, דגור את הפלטות למשך שעה אחת.

לאחר הדגירה, הוסף מיליליטר אחד של שכבת כיסוי מתילצלולוז (methylcellulose overlay) לכל באר, והחזר את הפלטות לאינקובטור למשך שלושה עד שבעה ימים. הוצא את הפלטות עם שכבת הכיסוי מהאינקובטור והעבר אותן לקבינה לבטיחות ביולוגית. שאף את שכבת הכיסוי של המתילצלולוז למגש המכיל 10% אקונומיקה, ושטוף כל באר פעמיים עם PBS, תוך שפיכת כל שטיפה למגש.

הסיר את ה-PBS, הוסף מיליליטר אחד של methanol-acetone לכל באר, והמת 30 דקות לסיום קיבוע התאים לפלטה. לאחר מכן, שפוך את חומר הקיבוע והשאר את הפלטות להתייבש. שטוף כל באר שלוש פעמים עם PBS לא סטרילי על רשק פלטות אורביטלי (orbital plate rocker) למשך 15 דקות לכל שטיפה, ולאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תמיסת חסמה (blocking solution) לכל באר, והנח לפלטה להתנדנד למשך 15 דקות נוספות.

הוסיפו 100 microliters של נוגדן ראשוני נגד נגיף הזיקה (anti-Zika Virus), או נוגדן ראשוני נגד פלאביווירוס (anti-flavivirus), לכל באר, והדגירו את הפלטה בערבול (rocking) למשך הלילה. למחרת, הסירו את הנוגדן הראשוני, וחזרו על השטיפות עם PBS. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 100 microliters של נוגדים שניוניים, והדגירו את הפלטה בערבול למשך שעה אחת.

חזור על השטיפות עם PBS, ולאחר מכן הוסף 100 µL של ריאגנט פיתוח סובסטרט לכל באר, ונער את הפלטה בתנועות עגולות (rocking) במשך 15 דקות. כאשר המוקדים (foci) או הפלאקים (plaques) מתפתחים, עצור את התגובה על ידי שטיפת הפלטה במי ברז. שפוך את מי הברז והשאר את הפלטות להתייבש באוויר, ולאחר מכן כמת את המוקדים הווירוסליים כדי לקבוע את מספר יחידות היווצרות המוקדים (focus forming units) הנוכחות בדגימה הנתונה.

שלוש אוכלוסיות של יתושים נחשפו לזן של התפרצות נגיף הזיקה בטווח של ריכוזי דם שונים. במהלך השבועיים הבאים, תת-קבוצות של יתושים עובדו כדי לקבוע את שיעורי ההדבקה, ההפצה וההעברה הפוטנציאלית. בריכוזי הדם הנמוכים, היתושים מסלבדור, ברזיל, הודבקו לאחר 4, 10 ו-14 ימים של דגירה חיצונית, ללא עדות להדבקה מופצת שנצפתה ברגליים שנבחנו.

בטטר הגבוה ביותר, הווירוס זוהה ברגליים של הפיתוחיות, אך לא ברוק. הפיתוחיות מהרפובליקה הדומיניקנית נמצאו כהרגישות ביותר להדבקה, ובעלות יכולת ההעברה הגבוהה ביותר בכל טטרי הארוחות דמיות שנבדקו. פיתוחיות שניזונות משלושת המינונים הראו הפצה תוך שבעה ימים, ויכולת העברה 14 ימים לאחר ההדבקה.

יתושים מעמק ריו גרנדה בטקסס, שנחשפו לטרטרים נמוכים יותר של ארוחות דם, הוצמדו לזיהום כבר ארבעה ימים לאחר ההדבקה, בעוד שזיהומים מפוזרים נמצאו לאחר 14 ימים. בקבוצה שנחשפה לטרטר הגבוה ביותר, נצפתה הדבקה החל מהיום השני לאחר ההדבקה, והיא הגיעה לשיאים ביומיים 4, 10 ו-14. זיהומים מפוזרים נצפו בשבעה ימים, ורק יתוש בודד היה מסוגל להנחילה את הזיהום ביום ה-10.

בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לעבוד בבטיחות ולא במהירות. לכן, יש לטפל תמיד ביתושים נגועים או כאלה שעלולים להיות נגועים בתוך תא כפפות או קבינה לבטיחות ביולוגית, עד להסרת הרגליים או הכנפיים שלהם. ניתן להתאים את זרימת העבודה הבסיסית של בדיקת כשירות הווקטור כדי להפיק יתושים נגועים עבור ניתוחים המשכיים, כגון מחקרי העברה, וכן כדי לבחון את האינטראקציות בין היתושים, הנגיף והמיקרוביומה.

בדיקת כשירות הווקטור (Vector competence) מהווה כלי חשוב ביותר להבנת תפקידם של יתושים בהעברת נגיפים במהלך מגפות של מחלות נגיפיות, ודבר זה נכון כבר עשורים רבים. אך זוהי גם שיטה שהתפתחה עם השנים כדי לכלול מידע חדש, ככל שהוא נלמד, על האינטראקציות בין נגיפים אלו לבין היתושים המשמשים כווקטורים. כדוגמה לשני מקרים: התוצאות מראות כי האוכלוסייה הגנטית של הנגיף והמורכבות של האוכלוסייה בתוך היתוש הן בעלות חשיבות רבה ליכולת ההעברה שלו, וכעת אנו יכולים לכלול זאת במחקרי כשירות ווקטורים באמצעות שיטות חדשות לריצוף האוכלוסייה הנגיפית.

אנו יודעים כעת גם כי לאוכלוסיית החיידקים ואורגניזמים אחרים החיים במערכת העיכול של הפקיד יכולה להיות השפעה משמעותית על יכולת ההדבקה שלהם, וכעת אנו יכולים להעריך אוכלוסייה זו באמצעות שיטות ריצוף חדשניות. לפיכך, מדידת כשירות הווקטור (vector competence) היא שיטה שהתפתחה וממשיכה להתפתח ככל שאנו לומדים יותר על אינטראקציות מורכבות אלו.