עכבר כרית הרגליים מודל לחקר ויראלי המושרה תגובות נוירודלקתיות

פרוטוקול זה מאפשר את המחקר של ייזום ופיתוח של תגובות נוירו-אינפלציה במערכת העצבים ההיקפית של העכבר במהלך זיהום ויראלי. עם מודל זה, זיהומים לנסוע מרחק גדול יותר מהפריפריה למערכת העצבים ההיקפית והמרכזית, המאפשר הערכה מקסימלית של הקינטיקה של התגובה neuroinflammatory. לאחר הצבת עכבר C57BL/6 הרדמה בן חמישה עד שבעה שבועות בתדר השופע על כרית כירורגית, לאשר חוסר תגובה רפלקס הדוושה.

ולהשתמש 100 כדי 180 לוח אמרי חצץ, כדי לשחוק בעדינות את העור glabrous של רגל אחורית אחת בין העקב ואת רפידות הליכה עם כ 20 מעברים של הלוח. לאחר מכן השתמש במקלפים עדין כדי לקלף לאט את הקרנית שכבה מנותק על ידי שחיקה לחשוף את השכבות בזלה. לאחר ערבוב עדין, למרוח topically 20 microliters של טיטר המתאים של אינוקולום וירוס על footpad abraded.

לבצע חיסונים מדומה עם בינוני רק ב footpads abraded של חיות בקרה במקביל. לאחר כל יישום, בעדינות לשפשף את footpad 10 פעמים עם פיר של מחט כדי להקל על הספחת הנגיף כל 10 דקות במשך 30 דקות. כאשר משטח הרגליים abraded מיובש, לאפשר לעכברים להתאושש עם ניטור עד recumbency עצם החזה לפני הצבת בעלי החיים לתוך כלובים בודדים למעקב קליני ודגימה.

בנקודות הזמן הניסיוניות המתאימות, אספו את האיברים החשופים לנגיף, כולל הלב, הריאות, הטחול, הלבלב, הכבד, הכליות ושלפוחית השתן למיקרו-צינורות בודדים של 1.5 מיליליטר על קרח. לאחר מכן לקצור את כפות הרגליים abraded בין העקב ואת רפידות הליכה ולמקום את הדגימות לתוך צינורות בודדים 1.5 מיליליטר על קרח. לאחר מכן, מניחים את העכבר במצב נוטה להרטיב את הפרווה עם 70% אתנול.

כדי לחשוף את עמוד החוליות, בצע חתך קטן באזור האגן והפשט את העור מהגפיים האחוריות לכיוון הראש. כדי להסיר את החלק הראשון ואת הגפיים האחוריות, השתמש במספריים כדי לחתוך במקביל וקרוב לעמוד השדרה משני הצדדים. ולהסיר את הראש בבסיס הגולגולת.

השתמש במספריים כדי לפתוח את הגולגולת מאגנום foramen לעצם הקדמית. ולהשתמש במקלות כדי למשוך לפתוח את הגולגולת בכיוון הרוחווי. לאחר מכן השתמש בממטרים כדי לגרוף בעדינות את המוח ול למקם את המוח לתוך microtube 1.5 מיליליטר על קרח.

השתמש מספריים מעוגלים כדי לנקות את עמוד השדרה של שריר, שומן, ורקמות רכות, ולהסיר את הזנב. ואז למקם את עמוד השדרה שלם לתוך צינור 15 מיליליטר של PBS קר כקרח סטרילי על קרח במשך לא יותר משלוש שעות. לאחר הניתוח, להעביר את חוט השדרה לתוך צלחת תרבית רקמות כדי לאפשר הסרה של כל רקמה רכה שנותרה.

השתמש בסכין גילוח כדי לבצע שלושה חתכים רוחביים דרך עמוד השדרה בחוליות S2, L1 ו- T1. מעבירים את החלקים למנות בודדות של 15 מ"מ המכילות PBS סטרילי קר כקרח. מעקב וסימון מקורות המקטעים לצורך ניתוח מאוחר יותר.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לאבטח צד דורסל מקטע אחד למעלה ולהשתמש בסכין גילוח כדי לבצע חתך אחד, אורך למטה דרך קו האמצע כדי לפצל את העמודה בשני חצאים שווים. מניחים את שני החצאים בצלחת פטרי חדשה המכילה PBS טרי, סטרילי קר כקרח בכיוון המקורי כדי להיות מסוגל להבחין בין הצדדים השמאליים והימין של עמוד השדרה. תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש במקלפים עדין כדי לקלף בעדינות את חוט השדרה מתוך כל מחצית של עמוד החוליות בכיוון rostral כדי caudal.

לאחר מכן מניחים את שני חצאי חוט השדרה במיקרו-צינורות בודדים של 1.5 מיליליטר המכילים 500 מיקרוליטרים של PBS סטרילי קר כקרח על קרח. כדי לחשוף את גנגליון השורש הגבי, הסר בעדינות את קרום המוח מצד אחד של עמוד השדרה לצד השני. ולמשוך את עצב עמוד השדרה הלבן החשוף מעמוד השדרה.

קוצרים את גנגליון השורש הגבי העגול והשקוף ממקטע עמוד השדרה לצלחת פטרי 15 מ"מ של PBS קר כקרח. ולאסוף את גנגליון שורש הגב של Ipsilateral ו contralateral כפי שהוכח רק. לאחר קצירת עצב עמוד השדרה וגנגליון שורש הגב משני מקטעי עמוד השדרה האחרים כפי שהוכח זה בלבד, צנטריפוגה כל צינורות הרקמה במהירות גבוהה.

לאחר מכן שאפו את העל-טבעיים והקפיאו את הדגימות בחנקן נוזלי, ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד להומוגניזציה. עבור הומוגניזציה של רקמות, להפשיר את הצינורות של רקמה קפואה על קרח לפני שקילה החוצה 100 מיליגרם של כל מדגם. מעבירים לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר המכיל חרוזים סטריליים ו-500 מיקרוליטרים של חיץ בדיקה של רדיואימון-פריציפציפציה.

לאחר מכן, לשבש את הרקמות בטמפרטורת החדר על homogenizer ב 20 מחזורים לשנייה במשך שתי דקות, ואחריו תקופת המתנה של דקה אחת, ו 20 מחזורים לשנייה במשך שתי דקות נוספות. לאחר הסיבוב השני של הומוגניזציה, צנטריפוגה הרקמות במהירות גבוהה לפני העברת 500 microliters של כל על טבעי לתוך צינור חדש שכותרתו כראוי. יש לאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לניתוח במורד הזרם.

אתר השחיטות גלוי במשטח הבקרה. וזה אופייני עבור קרום להיווצר באתר שחיקה כחלק מתהליך הריפוי. לעומת זאת, עכברים מחוסנים עם פסאודורביות, מדגימים דלקת חמורה של כף הרגל בנקודת הקצה ההומנית המאופיינת בנפיחות ואדמומיות.

בדיקה היסטופתולוגית של משטח הליכה מחוסן וגנגליון שורש הגב חושף נמק אפידרמיס ודלקת עורית חמורה בתוך קטעי כף הרגל הנגועים פסאודורביים. חדירה של נויטרופילים נצפתה גם בסעיפי DRG נגועים פסאודורביים. עלייה משמעותית בביטוי חלבון G-CSF נמדדת במשטח הרגליים ובגנגליון השורש הגבי של עכברים נגועים פסאודורביים בהשוואה לפקדים הן בשבעה והן ב-82 שעות לאחר ההדבקה.

רמות G-CSF משמעותיות נצפו גם ב 82 שעות לאחר זיהום בחוט השדרה, המוח, הלב, ורקמות הכבד של עכברים נגועים pseudorabies לעומת פקדים. יתר על כן, רמות משמעותיות של IL-6 מזוהים בכל הרקמות שנבדקו של עכברים נגועים pseudorabies החל 24 שעות לאחר ההדבקה. במצב מורבידי, התגלו פסאודורביים במשטח הרגליים, גנגליון שורש הגבי, חוט השדרה והמוח.

עם הביטוי הציטופלסמי הגבוה של פסאודורביס גליקופרוטאין gB בנוירונים של גנגליון השורש הגבי בעכברים נגועים פסאודורביים. כדי להבטיח זיהום מוצלח, חשוב כי טיפה של וירוס בעמודה לא נופל מן footpad abraded. מודל זה של בעלי חיים עשוי לשמש פלטפורמה לבדיקת היעילות של תרופות אנטי דלקתיות ואנטי ויראליות על מנת למנוע נוירופתיות היקפיות הנגרמות על ידי ויראלי.