הערכה של עקה חמצונית בדגימות ביולוגיות באמצעות חומצה Thiobarbituric חומרים תגובתיים אסייד

המטרה של חומרים תגובתיים חומצה thiobarbituric assay היא להעריך מתח חמצוני בדגימות ביולוגיות על ידי מדידת הייצור של מוצרי peroxidation השומנים, בעיקר malondialdehyde, באמצעות ספקטרופוטומטריית אורך גל גלוי ב 532 ננומטר. השיטה המתוארת כאן ניתן ליישם סרום אנושי, ליסאטים תאים, ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה.

לכן בדיקת TBARS משמשת בצורה הטובה ביותר להערכה כללית תוך מעבדתית של מתח חמצוני בדגימות ביולוגיות, שבה מושווים ישירות רמות TBARS יחסיות בין דגימות שאוחסנו ועובדו יחד. לבדיקה זו יש עלות נמוכה ביותר של כ-3 לבדיקת 96 דגימות בהשוואה לערכות זמינות מסחרית, שעולות כ-400, ומאפשרות לנתח רק דגימות אצווה אחת. ניתן להתאים את השיטה המתוארת כאן ליישומים ספציפיים כולל מחקרי יציבות של דגימות ביולוגיות, וכאלה שעבורם תוספת של נוגדי חמצון או סוגים אחרים של חומרים משמרים לדגימות לפני הניתוח מתאימה או מחייבת.

כדי להימנע מתוצאות משתנות מאוד, הכינו ריאגנטים טריים, וודאו שה-pH אינו גדול מארבעה עבור ריאגנטים לצבע והסירו בועות בצלחת הנפיחות של הנידזה לפני מדידת הספיגה. התחל בהכנת תמיסה מימית של 0.8% של חומצה תיוברביטורית. הכן תמיסת נתרן הידרוקסיד חמש טוחנות על ידי המסת ארבעה גרם חרוזי נתרן הידרוקסיד ב -20 מיליליטר מים.

אחסן את התמיסה במיכל פלסטיק. זה צריך להיות מוכן טרי לכל אצווה. הוסף ארבעה גרם של חומצה תיוברביטורית ל-450 מיליליטר מים נטולי יונים והשתמש במוט ערבוב מגנטי כדי להמיס אותם בעדינות.

הוסף לאט כארבעה מיליליטר מתמיסת הנתרן הידרוקסיד במרווחים של 100 מיקרוליטר, ובדוק את ה- pH כאשר חלקיקי החומצה התיוברביטורית מתמוססים. המשיכו להוסיף את הנתרן הידרוקסיד עד שכל החלקיקים נמסים. ודא שה-pH של התמיסה אינו גבוה מארבע עם רצועת pH, ואז הביא את הנפח הסופי ל-500 מיליליטר עם מים נטולי יונים ואחסן את תמיסת החומצה הברברית התיוברביטורית המימית בטמפרטורת החדר.

הכן תמיסות עקומה סטנדרטיות של MDA bis dimethyl acetal בשני צינורות פוליפרופילן של כובע הצמד של מיליליטר. על ידי דילול תמיסת מלאי 200 מיקרו-מולרית במים כמתואר בכתב היד הטקסטואלי. מערבולת הדגימות.

סמן את צינורות הזכוכית עבור הדגימות שיש לנתח, ולאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר מהדגימה המוכנה לכל צינור. הוסף 200 מיקרוליטר של 8.1% SDS לכל דגימה וסובב בעדינות את צינור הזכוכית בתנועה סיבובית לערבוב. הוסף 1.5 מיליליטר של 3.5 מולארי נתרן אצטט לכל דגימה, ולאחר מכן הוסף 1.5 מיליליטר מתמיסת החומצה התיוברביטורית המימית 0.8%.

הביאו את הסופי בכל צינור לארבעה מיליליטר על ידי הוספת 700 מיקרוליטר מים נטולי יונים. מכסים היטב את צינורות הזכוכית ומדגרים אותם בגוש חימום המוגדר ל 95 מעלות צלזיוס למשך שעה. מכסים את הצינורות בנייר אלומיניום כדי למנוע עיבוי, ואז מוציאים את הצינורות מהבלוק ודוגרים אותם על קרח למשך 30 דקות.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימות והתקנים ב -1, 500 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו 150 מיקרוליטר של סופרנטנט מכל צינור לבאר בצלחת של 96 בארות, והסירו את כל בועות האוויר עם קצה הפיפטה. מדוד את הספיגה של הדגימות ב-532 ננומטר, ולאחר מכן הפחת את קריאת הספיגה הממוצעת של הדגימות הריקות מכל קריאות הסופגים האחרות.

צור עקומה סטנדרטית והשתמש בה כדי לחשב ריכוזי דגימה לא ידועים. עקומות סטנדרטיות של MDA bis dimethyl acetol נוצרו כדי לקבוע את גבולות הזיהוי והרגישות של הבדיקה ורמות החמצון בשלוש דגימות ביולוגיות שונות. בסך הכל בוצעו 9 בדיקות TBAR על שלוש הדגימות בימים שונים.

כדי לקבוע את גבולות הזיהוי, נמדדה ספיגה של דגימות ריקות בשלושה ימים שונים. הריכוז המינימלי של חומר TBARS הדרוש כדי לתת אות שאינו סופג רעש הניתן לזיהוי הוא 1.1 מיקרומולר. והרגישות של הבדיקה היא כ-0.0016 יחידות סופגים לכל עלייה מיקרומולרית בריכוז.

ניתן להשתמש בבדיקת TBARS כדי לזהות שינויים בחמצון השומנים של מטריצות ביולוגיות שונות. כדי להדגים נחושת זו נעשה שימוש בשני כלורידים כדי לגרום לחמצון חוץ גופי של ליזאטים של תאי HEPG2 בסרום אנושי וליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה. בדיקת TBARS בוצעה על דגימות LDL המכילות EDTA ורמות ה-TBARS לא השתנו בין שתי דגימות ה-LDL שטופלו ולא טופלו.

עם זאת, לאחר ש-EDTA הוסר על ידי סינון ספין, LDL עבר חמצון שני מתווך נחושת. כדי להמחיש את הטווח הדינמי של בדיקת TBARS בסרום אנושי, נוסף לדגימות ריכוז של שני מילי-מולרי נחושת שני יונים, מה שהביא לעלייה של פי שישה עד שבעה ב-TBARS. כאשר מנסים פרוטוקול זה, אל תשאיר את הדגימות על הקרח למשך יותר מ-10 דקות, והשאיר אותן בטמפרטורת החדר לאחר הצנטריפוגה.

עבור קבוצות או תת-קבוצות של דגימות ביולוגיות שלא נאספו, עובדו ואוחסנו במקור יחד, יש להעריך סטטיסטית את הנתונים עבור השפעות אצווה כדי להבטיח שחמצון מלאכותי לא תרם לתוצאות. חמצון מכוון הניתן לכימות של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאפשר להבין כיצד חמצון משפיע על הביולוגיה המתפקדת שלו.