Flypub ללמוד אתנול המושרה ביטול עכבה התנהגותית הרגישות
18 במאי 2020
השיטת Flypub מודדת את ההתנהגויות שבהן מציג הפרי את מלאנוזופילה מלוגסטר תחת השפעת האתנול. ניתן לשלוט בקלות על ידי הניסויים בכל הרמות וליישם גירויים שונים, הקלה על שימוש בסמים ולימודי התמכרות.
המחת של Flypub מודדת התנהגויות לא מנופחות תחת השפעת אלכוהול. ובכך להקל על המחקר המקניסטי של הפרעת שימוש באלכוהול. אלכוהול הוא אחד הסמים הזמינים ביותר בשימוש נרחב בעולם.
המנגנון הנוירוביולוגי שבבסיס הפרעת השימוש באלכוהול, לעומת זאת, מובן באופן לא שלם. זבוב הפירות, Drosophila melanogaster, שימש בהרחבה לחקר ההשפעות של אתנול על אופוריה, תנועה, disinhibition, ו sedation. הוא משמש גם כדי ללמוד את השינויים הארוכים והתמשך שלה בהתנהגות רלוונטי התמכרות כגון סובלנות, רגישות, ואתנול מחפש.
מחקרים רבים ב Drosophila ומודלים אחרים של בעלי חיים להתמקד לוקומוטור הפעלת ההשפעות של אתנול. ההשפעה המובהק של אתנול היא ביטול חיים התנהגותי. עם זאת, המחקר שלו הוא די מיוצג.
כדי לטפל בבעיה מרכזית זו, פיתחנו את המחתר Flypub כדי למדוד התנהגות חסרת מעצורים תחת השפעת אתנול. כדי להרכיב את תא Flypub, לקחת בקבוק עגול לחתוך את החלק התחתון של סימן 25 מיליליטר עם סכין גילוח. צור חור בסימן 50 מיליליטר באמצעות ברזל הלחמה חם.
זוהי נקודת הגישה שבה יוצגו זבובים. מניחים רשת עגולה בקוטר 54 מילימטרים בסימן 75 מיליליטר, ומאבטחים אותה באמצעות דבק חם. מקם יריעת פלסטיק שקופה בקוטר 70 מילימטרים בקצה התחתון הפתוח, ואבטח אותה באמצעות דבק חם.
כדי להבטיח כי סיבוב הפלסטיק מחובר היטב לתחתית, לחץ למטה באמצעות משקולות. לאסוף זבובים זכר לתוך קבוצה של 33. מניחים אותם בצד של בקבוקון מזון.
מניחים אותם באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס עם לפחות 50% לחות יחסית ואור של 12 שעות, מחזור כהה של 12 שעות במשך יומיים לפני החשיפה לאתנול. הכן את תחנת המרשם Flypub על-ידי הדלקת אורות, מחשב ומצלמה להקלטת וידאו. הכינו שישה פאבים לסט ניסויים.
תייג אותם במספרים 1 עד 6. בעדינות להכניס את הזבובים לתוך הפאב באמצעות משפך קטן. סגור את הפאב באמצעות קלטת.
להתאקלם את הזבובים במשך 10 דקות. במהלך ההתאקלמות, התאימו את מוקד המצלמה והקליטו את חמש הדקות האחרונות של ההתאקלמות. במהלך ההתאקלמות להכין רפידות כותנה למשלוח אתנול.
חותכים כרית כותנה לארבעה רבעים שווים ולאחר מכן לקצץ את הפינות כדי להפוך אותו להתאים לתוך צלחת פטרי. מוסיפים כרית כותנה לצלחת פטרי. מוסיפים מיליליטר אחד של 95% אתנול ל כרית הכותנה.
הקפד פתרון אתנול להיות מופץ באופן שווה על כל האזור של כרית. מכסים במהירות צלחת פטרי עם מגבוני מעבדה. מניחים בזהירות אתנול המכיל צלחת פטרי מתחת לכל פאב.
יישר את הפאבים על הבמה. התחל בהקלטה ולהתחיל בו-זמנית שעון זמן. הקלט עד שטסים יפסיקו לחזר או לזוז.
הסר את האתנול המכיל צלחת פטרי כאשר מעל 90% מהזבובים הם מרומם. מעבירים בעדינות את הזבובים הרותמים בחזרה לבקבוקוני מזון. שים אותם בחזרה לתוך החממה.
חזור על השלבים הקודמים כל 24 שעות במשך שישה ימים רצופים. פתח את הווידאו באמצעות נגן מדיה. ואז ציון מספר הזכרים העוסקים בפעילויות חיזור כל 10 שניות.
פעילויות החיזור שיש להבקיע כוללות: הארכת כנף חד צדדית, שרשרת חיזור, מעגל חיזור, כיפוף בטן והתהוות. מוצגות הקלטות מייצגות של אופן הפעולה של fly. במהלך ההתאקלמות שבה הזכרים אינם מראים פעילות רבה.
במהלך החשיפה הראשונה שבה גברים מפגינים חיזור ספורדי. ובמהלך החשיפה השישית שבה גברים מציגים חיזור פעילות. הזן את מספר הזכרים המציגים חיזור בבלוק זמן עשר שני.
השתמש במספר המרבי של זכרי חיזור לשלוש חסימות רצופות של 10 שניות כנקודת נתונים מייצגת. הממוצע של 10 נקודות נתונים רצופות בעלות הערך הגבוה ביותר מייצג את אחוז החיזור הבין-עורי לכל פאב. סוג הבר קנטון-S התערוכה גדל בהדרגה פעילויות של חיזור disinhibited על חשיפה אתנול חוזר ונשנה.
זה מייצג רגישות התנהגותית לאפקט disinhibition של אתנול. בדקנו את תפקיד התמנון ברגישות על ידי בדיקת הזבובים שחסרים בהם טיראמין בטא-הידרוקסילאז, T beta H, ובכך חסרים תמנון. כמו קנטון-S, המוטנטים T beta H הראו תגובות הסלים לחשיפה אתנול חוזר, אבל ברמה מופחתת.
כאשר השווינו את T beta H וקנטון-S, ראינו כי זכרי המוטנטים T beta H התבונו חיזור פחות מנוכר מאשר זכרי קנטון-S בכל חשיפה המציינת כי תמנון עשוי להיות חשוב לרגישות. עכשיו אתה יכול להגדיר, לנהל, ולנתח התנהגויות הנגרמות על ידי אתנול באמצעות בדיקה Flypub. נקודות המפתח שיש לזכור כוללות, אחד, הרכבה נכונה של הפאב.
שתיים, מסירת אתנול עקבית, ושלוש, ציון התנהגותי מדויק ובלתי משוחד. ל-Flypub יש יתרונות רבים. זה פשוט, זול להגדיר, וקל ללמוד.
כמו כן, קבוצות מרובות של זבובים ניתן לתחקר בו זמנית, להקל על מחקר זה כדי לזהות את ההשפעות של מניפולציות גנטיות או ניסיוניות. ההערכה Flypub הוא מאוד מושך לניסויים בכל הרמות כולל יסודי דרך התיכון, סטודנטים לתואר ראשון ושני, פוסט דוק ופקולטה. לסיכום, מישן Flypub יאפשר לך לזהות שחקנים מולקולריים, מסלולים תאיים, מעגלי מוח, וגורמי סיכון התורמים להפרעת שימוש באלכוהול.
סקירה כללית
בדיקת ה-Flypub מודדת התנהגויות חסרות עכבה בזבוב הפירות Drosophila melanogaster תחת השפעת אתנול. בדיקה זו נועדה להקל על חקר הפרעות בשימוש באלכוהול וניתנת ללמידה קלה על ידי חוקרים בכל הרמות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- מחקר על הפרעות בשימוש באלכוהול
רקע
- אלכוהול נמצא בשימוש לרעה באופן נרחב, אך המכניזמים הנוירוביולוגיים שלו אינם מובנים באופן מלא.
- Drosophila melanogaster משמשת כאורגניזם מודל לחקר ההשפעות של אתנול.
- בדיקת ה-Flypub מתייחסת באופן ספציפי לחקר המבצעי המוגבל של ביטול עכבות התנהגותי הנגרם על ידי אתנול.
- מחקרים קודמים התמקדו בעיקר בהשפעות על תנועתיות (locomotor effects) ולא בביטול עכבות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה למדידת התנהגות חסרת עכבות בתגובה לאתנול.
- בחינת תפקידו של האוקטופמין בתהליכי רגישות התנהגותית הקשורים לחשיפה לאלכוהול.
- אספקת בדיקה פשוטה ואפקטיבית לחוקרים לצורך לימוד מנגנוני התמכרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבת תא ה-Flypub באמצעות בקבוק שעבר התאמה.
- הכנת זכרי Drosophila לחשיפה לאתנול.
- הקלטת וידאו של התנהגות הזבובים במהלך פעילויות חיזור.
- דירוג התנהגויות חיזור להערכת השפעות של ביטול עכבה (disinhibition).
תוצאות עיקריות
- זבובים מסוג פרא Canton-S הפגינו עלייה בהתנהגות חיזור חסרת עכבות בעקבות חשיפה חוזרת לאתנול.
- מוטנטים של T beta H הראו ירידה בחסר העכבות בהשוואה ל-Canton-S, מה שמעיד על תפקידו של האוקטופמין.
- הבדיקה מאפשרת בדיקה סימולטנית של מספר קבוצות זבובים.
- הגשה עקבית של אתנול ודירוג מדויק הם קריטיים לקבלת תוצאות מהימנות.
מסקנות
- בדיקת ה-Flypub היא כלי בעל ערך לחקר השפעות האתנול על ההתנהגות.
- היא יכולה לסייע בזיהוי מנגנונים מולקולריים ותאיים המעורבים בהפרעות בשימוש באלכוהול.
- הבדיקה נגישה לחוקרים ברמות השכלה שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקת ה-Flypub נותנת מענה לפער קריטי במחקר של הפרעות בשימוש באלכוהול על ידי התמקדות בחוסר עכבה התנהגותי המושרה על ידי אתנול, שינוי 적פטיבי מרכזי העומד בבסיס ההתמכרות. על ידי מתן אפשרות למדידה של עלייה בחסר עכבה במהלך החיזור ב-Drosophila melanogaster, הבדיקה תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. הפשטות, היכולת להרחבה (scalability) והתאימות לכלים גנטיים מגבירות את הביטחון החזוי בחקירת מסלולים ומעגלים במנגנוני התמכרות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת עלייה בהתנהגות חסרת עכבות (disinhibited behavior) כמדד לרגישות (sensitization) לאתנול.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות גנטיות, כגון רכיבים במסלול האוקטופמין, באמצעות פנוטיפים של הפחתה בחסרת עכבות.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי כימות רגישות התנהגותית בין גנוטיפים שונים, ובכך מסייע בתיעדוף מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקה בהמשך על ידי קביעת תגובות בסיס ותגובות עכבה מופחתת (disinhibition) רגישות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של מתן האתנול ושל הניסוב ההתנהגותי, ובכך מבטיח הדירות בין סדרות ניסוייות ומעבדות שונות.
- ערך ניתנות להרחבה: מאפשר בדיקה סימולטנית של מספר קבוצות זבובים, מה שמקל על הערכה מקבילה של מניפולציות גנטיות או פרמקולוגיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: מקשר בין רגישות להסרת עכבות בזבובים לבין מודלים של התמכרות ביונקים, ובכך תומך בתיקוף של מטרות חוצות-מינים.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאפשר ניתוח של שחקנים מולקולריים, מסלולים תאיים ומעגלים מוחיים התורמים לשינויים התנהגותיים המושרים על ידי אתנול.
- המשכיות ניבוית: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קישור מודולציה של מטרות לפנוטיפים של הסרת עכבות לאורך חשיפות חוזרות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקת ה-Flypub משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לזיהוי מוביל (lead identification), במיוחד עבור מטרות הקשורות להתמכרות המשפיעות על ויסות התנהגותי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי גנים ומסלולים המעורבים בתגובה לאתנול, כגון tyramine beta-hydroxylase ואיתות של octopamine.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות תאים סטנדרטיים, הכנה עקבית של אתנול ודירוג מדיד של התנהגות חיזור מדי 10 שניות.
- אנליטיקה: מייצר מדידות כמותיות של משתנים תלויים — אחוז חיזור בין זכרים לכל זבוב — המאפשרות השוואה בין תנאים וגנוטיפים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין רגישות לחסר עיכוב (disinhibition sensitization) לרלוונטיות פרה-קלינית על ידי מידול תגובות מוגברות הדומות להתנהגויות של התמכרות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה רב-פעמית להערכת משנים גנטיים, פרמקולוגיים או סביבתיים של התגובה לאתנול לאורך פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית סביב רגישות לדה-אינהיביציה (disinhibition sensitization).
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות הרכבה סטנדרטית של התא, הזרקת אתנול ודירוג התנהגותי עיוור.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת פנוטיפים כמותיים מבוססי הסלמה המשקפים ניורואדפטציות רלוונטיות להתמכרות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון בהתבסס על השפעתן על מסלולי רגישות התנהגותית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, בתצפית התנהגותית ובדירוג מבוסס וידאו.
- תלוי בציוד להגשת אתנול, הקלטת וידאו ובקרה סביבתית (25°C, 50% לחות, מחזור אור/חושך של 12h).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של קריטריוני חיזור ומרווחי דירוג כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה כאשר מרחיבים את הבדיקה למדידת התנהגויות אחרות המושרות על ידי אתנול מעבר להסרת העכבות בחיזור.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הטיות של המדרג ושונות במוטיבציה של הזבובים, המומתנות על ידי שימוש בחיזור מקסימלי לאורך בלוקים של זמן רצופים.
