מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עכבר נוירונים באמצעות כרומטין Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

היתרון העיקרי של שיטת ChIP-exo שלנו הוא רזולוציית המיפוי המשופרת של אינטראקציות DNA חלבון בתא בהשוואה לשיטת הכרומטין הקונבנציונלית. להכנת חרוזים מגנטיים של חלבון G ל- ChIP, מערבבים את החרוזים המגנטיים עד לקבלת תערובת אחידה. לאחר מכן הוסף 25 מיקרוליטר של החרוזים המגנטיים לצינור קשירה נמוך של חלבון של שני מיליליטר.

הוסף מיליליטר אחד של תמיסת חסימה לחרוזים. מערבבים היטב על ידי פיפטינג, ואז מניחים את הצינור על רשת מגנטית למשך דקה. ברגע שהסופרנטנט צלול, הסר אותו.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת חסימה לחרוזים. הנח את הצינור על משטח נדנדה בארבע מעלות צלזיוס ונדנד במשך 10 דקות, ואז סובב את הצינור בקצרה. הנח את הצינור על המתלה המגנטי והסר את ה-supernatant.

הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לחרוזים המגנטיים. סובב לזמן קצר את הנוגדן כנגד Islet-1, ולאחר מכן הוסף ארבעה מיקרוגרם של הנוגדן לצינור המכיל את החרוזים המגנטיים. הנח את הצינור המכיל חרוזים מגנטיים ונוגדני Islet-1 על משטח נדנדה בארבע מעלות צלזיוס וסלע למשך שש עד 24 שעות.

כדי להתחיל את המשקעים החיסוניים של הכרומטין, שטפו את החרוזים המצופים בנוגדנים במיליליטר אחד של תמיסת חסימה. הניחו את הצינור המכיל את החרוזים המצופים בנוגדנים על משטח נדנדה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר סיבוב קצר, הנח את הצינור על מתלה מגנטי והסר את הסופרנטנט.

השעו מחדש את החרוזים המצופים בנוגדנים ב-50 מיקרוליטר של תמיסת חסימה. הוסף מיליליטר אחד של ליזטים סוניקטיביים לחרוזים המצופים בנוגדנים, ולאחר מכן דגר את הדגימה על משטח נדנדה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר שאפשרו לדגימה לדגור למשך הלילה, אספו נוזלים מהמכסה על ידי סיבוב קצר של הצינור, ולאחר מכן הניחו את הצינור על מתלה מגנטי.

ואחרי דקה אחת, הסר את הסופרנטנט בזהירות בעזרת פיפטה. לאחר מכן, בצע סדרה של כביסות כדלקמן. הוסף לדגימה מיליליטר אחד של מאגר כביסה קרה המכיל CPI.

מערבבים את הדגימה על משטח נדנדה בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. סובב בקצרה את צינור הדגימה, ואז הניח על מתלה מגנטי. לאחר דקה אחת, הסר את הסופרנטנט בעזרת פיפטה.

עבור התגובה האנזימטית הראשונה ותיקון וזנב DA, הוסף לדגימה 38 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים שעברו חיטוי, ולאחר מכן הוסף תערובת תגובת הכנה סופית ותערובת אנזימי הכנה סופית. מערבבים את תכולת הצינור על ידי פיפטינג, ואז מדגרים את הדגימה בחום של 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את חרוזי הדגימה עם מאגר שטיפת מלח גבוה, מאגר שטיפת ליתיום כלוריד ומאגר מימן כלורי טריס 10 מילי-מולר כמתואר קודם לכן.

כדי לבצע את קשירת מתאם האינדקס, הוסף לדגימה 27 מיקרוליטר של מאגר טריס מימן כלורי קר של 10 מילי-מולרי. לאחר מכן הוסף מתאם אינדקס, משפר קשירה ותערובת מאסטר ליגאז. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

שוב, שטפו את חרוזי הדגימה עם מאגר שטיפת מלח גבוה, מאגר שטיפת ליתיום כלוריד ומאגר מימן כלורי טריס 10 מילי-מולרי. לאחר מכן הוסף לדגימה 47 מיקרוליטר של מאגר טריס מימן כלורי קר של 10 מילי-מולרי. כדי לתקן את החתך ב-DNA הנובע מהקשר הפוספודיאסטר החסר, הוסף לדגימה 11.1 מיקרוליטר מתערובת המילוי.

דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר סדרה של כביסות, הוסף לדגימה 50 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים קרים. כדי לעכל את ה-DNA של ChIP בחמישה כיוונים ראשוניים עד שלושה ראשוניים, הוסף מאגר אקסונוקלאז למבדה ואקסונוקלאז למבדה וערבב את הדגימה על ידי פיפטינג.

דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר השלמת העיכול, חזור על שלוש הכביסות בפעם האחרונה. כדי להוציא דגימת ChIP מהחרוזים, השעו מחדש את הדגימה ב-75 מיקרוליטר של מאגר פליטה וחממה ChIP ב-65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב-130 פעמים G.הוסף לדגימה 2.5 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K.

מערבלים את הדגימה לזמן קצר, ואז מדגרים למשך הלילה ב-65 מעלות צלזיוס. סובב בקצרה את הדגימה והניח על מתלה מגנטי. לאחר דקה אחת, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר.

לטהר ולסלק את ה-DNA. לאחר טיהור ה-DNA המנוקה, העבירו 16 מיקרוליטר מדגימת ה-DNA שחולצה לצינור PCR. הוסף לדגימה 1.2 מיקרוליטר של תערובת חישול דנטורציה ופריימר.

שימוש בתוכנית המתוארת בטבלה שש של כתב היד, דנטורציה וחישול פריימרים ל-DNA של התבנית. הוסף שלושה מיקרוליטרים של תערובת הרחבת פריימר לדגימה והפעל את תוכנית ה-PCR המתוארת בטבלה שביעית של כתב היד. הוסף 4.1 מיקרוליטר של תערובת זנב DA לדגימה והפעל את הדגימה באמצעות תוכנית PCR בטבלה שמונה של כתב היד.

לאחר מכן הוסיפו לדגימה 21.5 מיקרוליטר של תערובת קשירת מתאם אוניברסלית ודגרו למשך 15 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. הוסף 29 מיקרוליטר של תערובת LM-PCR לדגימה, ולאחר מכן הפעל את הדגימה באמצעות התוכנית מטבלה 10 של כתב היד. לאחר 18 מחזורים של LM-PCR, דגימות ChIP-exo מנוירונים מוטוריים של עכבר עברו אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1.5%.

התוצאות עבור ChIP-exo Islet-1 הראו ספריות DNA מוגברות בסביבות 200 עד 400 זוגות בסיסים, מה שמצביע על כך שספריות ChIP-exo הוגברו בהצלחה על ידי LM-PCR. הרצועה סביב 100 זוגות בסיסים מייצגת חפצים ממתאמים ופריימרים PCR. בקרת היעדר נוגדנים מדגימה כי DNA רקע לא ספציפי עוכל על ידי הטיפול באקסונוקלאז למבדה.

באמצעות ChIP-exo ו-ChIP-seq, זוהו מיקומים קשורים לאי-1. אות ה-ChIP-exo היה ממוקד מאוד באתרי קשירה של Islet-1 וזיהה דפוסי קשירה מרובים של גורם שעתוק Islet-1. אות ה-ChIP-seq הציג אותות רחבים יותר המצביעים על כך של-ChIP-exo הייתה רזולוציית מיפוי גבוהה יותר מאשר ChIP-seq עבור Islet-1.

גורמי שעתוק מרובים קושרים לעתים קרובות DNA זה ליד זה כקומפלקס חלבון-DNA. ChIP-exo מאפשר לנו לחקור כיצד גורמי שעתוק מרובים מזהים ומווסתים את ה-DNA המטרה.