ניטור הישרדות וירוס שפעת מחוץ למארח באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת

שיטות לכימות חלקיקים שונות מייצגות היבט קריטי של רוב מחקרי הביולוגיה. פרוטוקול זה מאפשר כימות מדויק של הנתונים הנגיפיים בזמן אמת. טכניקה זו מחליפה את המדידה המסורתית של נתונים ויראליים.

על-ידי נתונים אובייקטיביים בזמן אמת, אנו נמצאים מתחת למרווח הביטחון שלנו, תוך הימנעות מנקודות קצה עתירות עבודה. שיטה זו יכולה לשמש עבור כל הווירוסים הגורמים לאפקט ציטופתי. מי שידגים את ההליך יהיה קוונטין גראסין, טכנאי מעבדה מהמעבדה שלנו.

כדי להפיץ ולהגביר וירוסי H1N1, זרע 7.5 כפול 10 ל 6 תאי MDCK על שני צלוחיות תרבית רקמות 75 ס"מ רבוע על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, ודגר את התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס כדי להגיע 90 עד 100% מפגש. למחרת, לשטוף את התאים פעמיים עם חמישה מיליליטרים של PBS סטרילי לכל בקבוקון לכל לשטוף, ולתייג בקבוקון אחד כמו הפקד. לאחר מכן, לדלל בקבוקון מופשר של שפעת מלאי וירוסים לריכוז הניסיוני המתאים בצינור 1.5 מיליליטר המכיל מדיום התפשטות וירוס טרי.

השתמש מיליליטר אחד של המלאי המדולל כדי להדביק את תאי MDCK בריבוי של זיהום של 1 כפול 10 למינוס 3, או 1 כפול 10 למינוס 4 יחידות יוצרות פלאק לכל תא, ולהוסיף מיליליטר אחד של מדיום התפשטות וירוס לבקבוק הבקרה. ספיחה הנגיף לתאים במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר, עם ערבוב כל 15 דקות. בסוף הדגירה, להסיר את inoculum ולהחליף אותו עם 15 מיליליטר של מדיום התפשטות וירוס בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של טריפסין TPCK כדי להקל על מחשוף של hemagglutinin נגיפי HA0 לתוך יחידות משנה HA1 ו HA2.

לאחר מכן מניחים את הבקבוקון בחממה של 35 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. בסוף הדגירה, השווה את התאים בכל תרבית תחת מטרה של 40x על מיקרוסקופ אור כדי להעריך את ההשפעות הציטוטפתיות על התאים. כאשר ההשפעה הציטופתית הושלמה, הוסף את supernatants תרבית התאים לצינור 15 מ"מ ולאסוף את הפסולת התאית מכל תרבות על ידי צנטריפוגה.

לאחר מכן, העבירו את תרבות הנגיף המובהקת לצינור של 15 מיליליטר, והעבירו את נגיפי הצאצאים לבקבוקונים קריוגניים סטריליים לשימוש חד פעמי לאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לקבוע את כמות התא המתאים לזיהום תאים, להכין 24 שעות ביממה כ 80% תרביות תא MDCK משולב כפי שהודגם לפני שטיפת התאים עם PBS ולקצור אותם עם דגירה של 45 דקות בשלוש מיליליטר של 0.25%טריפסין-EDTA לכל בקבוק ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים מתנתקים, הפסיקו את התגובה עם שבעה מיליליטרים של תרבית טרייה בינונית לכל בקבוקון, וספרו את התאים מכל תרבית.

לדלל את התאים ל 4 פעמים 10 לתאים 5 למיליליטר של מדיום תרבית התא ולבצע דילול טורי כפול של התאים כפי שצוין. מניחים צלחת אלקטרונית בטמפרטורת החדר במשך מספר דקות לפני הוספת 100 מיקרוליטרים של תרבית תאים בינונית לכל באר מבלי לגעת באלקטרודות של הצלחת האלקטרונית. פתחו את העריסות והכניסו את הקצה הקדמי של הצלחת לכיס העריסה של מכשיר מדידת העכבה.

סגור את דלת האינקובטור ופתח את התוכנה. בהגדרת תבנית הניסוי המוגדרת כברירת מחדל, סמן את העריסות שנבחרו ולחץ פעמיים בעמוד העליון כדי להזין את שם הניסוי. לחץ על פריסה והזן את המידע לדוגמה הדרוש עבור כל באר שנבחרה בלוח.

לחץ על תזמון, שלבים והוסף שלב. התוכנה תוסיף באופן אוטומטי שלב של שנייה אחת כדי למדוד את העכבה ברקע לחץ על ביצוע והתחלה, המשך. לחץ על התווה והוסף כדי לבחור את הבארות המתאימות, המאשרות כי עכבה ברקע היא בין מינוס 0.1 ל- 0.1 לפני שתמשיך לשלב הבא.

לאחר מכן, להסיר את הצלחת מן העריסה ולהוסיף 100 microliters של כל השעיה תא לבארות המתאימות בשכפול. השאירו את צלחת E במכסה המנוע לזרימה למינארית במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר חלוקה אחידה של התאים על קרקעיות הבארות לפני טעינת צלחת E לכיס העריסה. לחץ על תזמן והוסף שלב והזן ערכים כדי לפקח על התאים כל 30 דקות במשך 200 חזרות לפני בחירת התחל, המשך.

כדי לבדוק ולהתוות את נתוני עכבה התא, לחץ על התווה ובחר את ריכוז התאים שנמצא ממש לפני השלב הנייח 24 שעות לאחר הזריעה כדי להשיג תאים שעדיין נמצאים בשלב גידול במהלך הזיהום הנגיפי. כדי לקבוע את המתאם בין ערכי CIT50 לבין ריבוי הזיהום, לאחר כת 3 כפול 10 עד 4 תאי MDCK שזה עתה התפצלו לכל באר של צלחת המיקרוטיטר האלקטרונית למשך 24 שעות, שטפו את התאים פעמיים עם 100 מיקרוליטרים של מדיום התפשטות וירוס טרי לבאר, לכל שטיפה, והשתמשו בפיפטה חד-ערוצית כדי להוסיף 100 מיקרוליטרים של השעיה ויראלית לכל באר. כאשר כל דילול הנגיף נוספו, טען בעדינות את הצלחת לכיס העריסה של המכשיר ב 35 מעלות צלזיוס, ולהתחיל ניטור עכבה התא כל 15 דקות לפחות 100 שעות, כפי שהוכח.

לאחר שני מחזורים של מדידות, לחץ כדי להשהות את המנגנון, ולהסיר את צלחת E מהעריסה. הוסף 100 מיקרוליטרים של מדיום התפשטות וירוס בתוספת טריפסין TPCK לכל באר ולהחזיר את צלחת E לכיס העריסה. לאחר מכן, התחל את הניתוח.

כדי להעריך את שפעת A וירוס הישרדות קינטיקה, להוסיף נתרן כלורי לריכוז סופי של 35 גרם לליטר במים מזוקקים, ולהוסיף 900 microliters של תמיסת מלח וכתוצאה מכך שתי מיקרו-צינורות קריו. הוסף 100 מיקרוליטרים מלאי ויראלי לכל קריו-שפופרת והנח את הצינורות בחממה של 35 מעלות צלזיוס לפרק הזמן הניסיוני המתאים. יום לפני תום הדגירה, זרעים 3 כפול 10 עד 4 תאי MDCK מפוצלים טריים ו -100 מיקרוליטרים של מדיום התפשטות וירוסים לבאר בצלחת מיקרוטיטר של 16 בארות בשלבים חוזרים, המאפשרים מדידה של עכבה ברקע וחלוקה אחידה של התאים לתחתית הבארות.

לאחר מכן לגדל את התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% דו תחמוצת הפחמן. למחרת, לשטוף את התאים פעמיים, ולאחר מכן להדביק את התאים עם 100 microliters של הנגיף מזוקק מלוחים מדולל 10 פעמים במדיום תרבית טרי, כפי שהוכח, ולפקח על עכבה התא כל 15 דקות לפחות 100 שעות. כאן, נתונים גולמיים המתקבלים לאחר 120 שעות עם ריכוזים שונים של תאי MDCK מוצגים.

לאחר 24 שעות, מדידות מדד התאים גילו כי תאים בבארות שנזרעו עם 3 כפול 10 עד 4 התאים היו עדיין בשלב המעריכי של הצמיחה, ולכן, ריכוז תאים זה שימש לניסויים הבאים. תרביות תאים MDCK להפגין קשר ליניארי ברור בין CIT50 ואת הריבוי הראשוני של זיהום על ידי וירוס שפעת. התוצאות מניסוי קינטי הישרדות טיפוסי מראות ירידה במדד התאים עקב השפעה ציטופתית הנגרמת על ידי וירוס.

ניתן להשתמש ב- CIT50 כדי לחשב את שיפוע ההשבתה הנגיפי עבור כל וירוס בכל תנאי לקביעה איזה וירוס היה היציבות הגדולה ביותר בסביבה הנחקרת. היציבות של הנגיף בקורלציה עקיפה למדרון ההשבתה, ומאפשרת, למשל, שאריות חומצות אמינו בגליקופרוטאין המגלוטין המעורבים בשפעת A הישרדות וירוס מחוץ לפונדקאי להיות מזוהה. טכניקה זו רגישה מאוד לווריאציות קטנות.

לכן, מומלץ להשתמש במונה תאים אוטומטי על מנת להשיג תוצאות הניתנות לשחזור בין ניסויים. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להשוות את השכפול של וירוסים שונים, כדי לחקור את הטרופיזם וירוס עבור מספר קווי תאים בכל פעם, או ללמוד שלבים ספציפיים של מחזור הנגיף.