דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

הליך זה הוקם כדי לשמש לפיתוח תרבויות חזה 3D מתקדמות במבחנה, אשר יכול לספק הערכה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית של הסיכונים genotoxic הקשורים חשיפות ננו חומריים על פני משטרי מינון חריפה או ארוכת טווח, חוזרים ונשנים.

מודל Hep G2 זה מספק אלטרנטיבה רלוונטית למערכת בדיקות מבחנה כדי להעריך בצורה מהימנה יותר את האינדוקציה הפוטנציאלית של נזק קבוע ל-DNA בעקבות חשיפה ארוכת טווח לננו-חומר במטרה למזער את הצורך בניסוי בבעלי חיים. למודל הספרואיד Hep G2 יש את היכולת להישאר בר-קיימא ותפקודי לאורך תקופה של 14 יום, כמו גם לשמור על רמת התפשטות מתאימה. זה תומך בבדיקה של מגוון נקודות קצה ביוכימיות וגנוטוקסיות, כולל בדיקת המיקרו-גרעין.

לפני שתנסה את הפרוטוקול הזה, אני מציע לך לעשות כמה ריצות תרגול קודם. היזהר בעת זריעת תאים או החלפת מדיה, מכיוון שאלה דורשים גישה עדינה. התחל בהוספת 100 מיקרוליטר PBS סטרילי בטמפרטורת החדר לבארות של צלחת תרבית 96 בארות.

הפוך את מכסה הצלחת ופיפטה בזהירות 20 טיפות מיקרוליטר של מתלה התא למרכז כל חריץ באר של המכסה. השתמש בפיפטה רב-ערוצית, הוסף שתיים עד ארבע טיפות בכל פעם, כדי להבטיח דיוק במיקום. זרע רק ארבעה סטרואידים בכל פעם וודא שכל קצות הפיפטה מיושרים לפני שמתחילים.

הזווית שבה אתה מחזיק את הרב-ערוצי תעשה את ההבדל באופן היווצרות הספרואידים. וודאו שהטיפות מרוכזות בתוך חריצי הבארות שעל המכסה, ולאחר מכן הפכו בעדינות את המכסה על גבי הצלחת כך שהטיפות יתלו מעל הבארות בעזרת PBS. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים לפני העברת הכדור לאגרוז.

לאחר הדגירה, הסר את הצלחת מהחממה והרם בזהירות את המכסה מהצלחת, השליך את ה-PBS, הקש על הצלחת כדי להסיר שאריות נוזל, ואפשר לצלחות להתייבש באוויר במשך שתיים-שלוש דקות. לאחר המסת האגרוז, סובבו אותה בעדינות כדי להסיר בועות והוסיפו 50 מיקרוליטר לבסיס כל באר. השאירו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות, ואז הוסיפו 100 מיקרוליטר של DMEM מחומם מראש על גבי שכבת האגרוז המוצקה בכל באר.

הנח את המכסה עם טיפות הכדור הזה בחזרה על גבי הצלחת כך שהספרואידים שוב תלויים, ואז צנטריפוגה את הצלחת למשך שלוש דקות ב-200 פעמים G כדי להעביר את הספרואידים לבארות הבודדות של הצלחת. דגרו את הצלחת למשך 24 שעות נוספות כדי לאפשר לספרואידים להתייצב. לאחר פיזור הננו-חומרים המהונדסים, או ENMs, יש לדלל אותם לריכוז הרצוי הסופי עם DMEM מחומם מראש.

שאפו 50 מיקרוליטר בינוני מכל באר עם הספרואידים והחליפו אותו ב-50 מיקרוליטר מדיום עם ה-ENM. כדי לקצור את הספרואידים, השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לשאוב את 100 המיקרוליטר של מדיום תרבית התאים עם הרקמה הספרואידית מכל באר, תוך הקפדה על הימנעות ממגע עם האגרוז. אוספים את הספרואידים בצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה את התרחיף הספרואיד ב-230 פעמים G למשך חמש דקות, ואז הסר את הסופרנטנט ואחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף. שטפו את כדור הכדורים במיליליטר אחד של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר, ואז צנטריפוגה אותם ב-230 פעמים G למשך שלוש דקות והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הספרואידים ב-500 מיקרוליטר של תמיסת 0.05% טריפסין-EDTA ודגרו אותם במשך שש עד שמונה דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר הדגירה, פיפטה בעדינות את תאי ה-Hep G2 הטריפסינזים למעלה ולמטה כדי להתנתק לחלוטין ולהשעות אותם מחדש לפני נטרול עם מיליליטר אחד של DMEM. צנטריפוגה של תרחיף התא ב-230 פעמים G למשך חמש דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא בשני מיליליטר של PBS. כדי ליצור משפך קובטה, הנח את שקופית המיקרוסקופ המוכנה לתוך תומך המתכת, הנח כרטיס סינון על גבי השקופית, ולאחר מכן אבטח את משפך הקובט למעלה.

מסדרים את משפכי הקובט בציטו-צנטריפוגה כשהמשפך פונה כלפי מעלה כך שניתן להוסיף ישירות 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל אחד מהם. לאחר מכן המשך בתיקון השקופיות לפי הוראות כתב היד. הכן תמיסת צביעה של 20% Giemsa מדוללת במאגר פוספטאז.

פיפטה בעדינות את התמיסה למעלה ולמטה כדי לערבב אותה, ואז לסנן אותה עם נייר סינון מקופל במשפך. השתמש בפיפטה של פסטר כדי להוסיף שלוש עד חמש טיפות של תמיסת Giemsa מסוננת לציטודוט בכל שקופית והשאיר אותה למשך שמונה עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות בשתי שטיפות חיץ פוספטאז רצופות.

לאחר מכן שטפו אותם בקצרה תחת מים קרים כדי להסיר כתם עודף והשאירו אותם לייבוש באוויר. לפני כל הערכה טוקסיקולוגית במבחנה, חשוב לבדוק שהספרואידים התלת-ממדיים HepG2 נוצרו כראוי. ארבעה ימים לאחר הזריעה, אמורים להיווצר ספרואידים קומפקטיים בצורת כדור עם משטח חלק וללא הקרנות חזותיות.

ספרואידים באיכות טובה ובאיכות ירודה ארבעה ימים לאחר הזריעה מודגמים כאן. בדרך כלל, 90 עד 95% מהספרואידים שנוצרו בכל צלחת ייווצרו כהלכה ויהיו ברי קיימא לניסויים נוספים. הכדאיות והתפקוד דמוי הכבד הוערכו על פני תקופת תרבית של 14 יום כדי לקבוע את אורך החיים של מודל הספרואידים בכבד ולקבוע אם הוא יכול לתמוך ב-ENM ארוך טווח או בהערכת סיכונים מבוססת כימיקלים.

ריכוז האלבומין נשאר עקבי לאורך תקופת התרבית, בעוד שייצור האוריאה לכדור גדל לפני שהחל לרדת ביום ה-14. להערכת גנוטוקסיות, נעשה שימוש בבדיקת המיקרו-גרעין כדי לקבוע את נוכחותם של מיקרו-גרעינים לאחר חשיפות חריפות וארוכות טווח ל-ENM. הספרואידים נחשפו לשני ENMs, טיטניום דו חמצני וכסף.

מגמה דומה של גנוטוקסיות נצפתה לאחר חשיפה חריפה לשני ה-ENMs, אך התגובה הגנוטוקסית המוגברת לא ניכרה לאחר חשיפה ארוכת טווח של חמישה ימים. בעקבות שיטה זו, ניתן לקצור גם את הסופרנטנט וגם את הספרואידים עבור מספר רב של נקודות קצה ביוכימיות. אלה כוללים כדאיות תאים, בדיקות תפקודי כבד, ניתוח SID 450, סמנים דלקתיים גרועים וביטוי גנים.

טכניקה זו נבדקת כעת במספר מעבדות מחקר שרוצות ליישם אותה בבדיקות גיאוטוקסיות שגרתיות של כימיקלים וננו-חומרים. יש לכך פוטנציאל להפחית את ההסתמכות על גישות בדיקה in vivo.