בדיקה פלואורומטרית מבוססת קליק-כימיה עבור אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז מאיפיון אנזים ועד סינון תפוקה גבוהה

פרוטוקול זה מתייחס לשני היבטים חשובים, אפיון של ממברנה אינטגרלית חיונית, אפוליפופרוטאין אצילטרנספראז של חיידקים, ופיתוח הבדיקה בפורמט HDS לסינון מעכבי האנזים. השיטה רגישה מאוד ומתאימה למטרות סינון. זה יכול לתרום לפיתוח אנטיביוטיקה חדשה פוטנציאלית.

סרטון זה יעזור להדגיש שלבים קריטיים של פרוטוקול זה, כגון ערבוב, מערבולת, סוניקציה, תוך עבודה עם תרחיפים לא הומוגניים המכילים שומנים וחומרי ניקוי. מי שתדגים את ההליך יהיו קארין נוזרט, אורליה פרנין, שתיהן עמיתות בקבוצה שלי. התחל בהכנת תערובת המגיב לבדיקת אפוליפופרוטאין ואציל טרנספראז או LNT.

מערבבים אלקין POPE ו-FSL-1-ביוטין עם מאגר תגובת LNT בצינורות של 1.5 מיליליטר בנפח סופי של 18 מיקרוליטר. הכן תערובות ריאגנטים משולשות לכל התנאים שנבדקו. סוניקציה של תערובות הריאגנטים למשך שלוש דקות באמבט מים קולי, ודגירה אותן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר מכן הוסיפו LNT פעיל או לא פעיל לריכוז סופי של ננוגרם אחד למיקרוליטר, ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות במיקסר תרמי עם מכסה מחומם. בינתיים, הכינו תמיסת מלאי של שני מיליגרם למיליליטר סטרפטווידין.

ולדלל אותו ל -10 מיקרוגרם למיליליטר כדי ליצור פיתרון עובד. הוסף 100 מיקרוליטר מהתמיסה לכל באר של צלחת 96 בארות. לאחר מכן יבש את הבארות באוויר למשך הלילה על ידי דגירה של הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ללא מכסה.

למחרת, הכינו תמיסות מלאי של 5 מילי-מולרי Azido-FAM, 50 מילי-מולרי TCEP, 2 מילי-מולרי TBTA ו-50 מילי-מולרי נחושת סולפט פנטהידרט. בצע כימיה של קליקים על ידי הוספת 0.2 מיקרוליטר של מלאי Azido-FAM, 0.4 מיקרוליטר של TCEP מלאי ו-0.2 מיקרוליטר של TBTA מלאי לצינורות התגובה של 1.5 מיליליטר LNT. מערבולת את התמיסה למשך חמש שניות.

לאחר מכן הוסף 0.4 מיקרוליטר סולפט נחושת מלאי. מערבולת למשך חמש שניות נוספות ומדגר את התגובה למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. בזמן שתערובת הכימיה בקליק דוגרת, שטפו את הבארות של הצלחות המצופות סטרפטווידין שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBST1.

העבירו 18 מיקרוליטר מתערובת הכימיה הקליק לבאר מצופה סטרפטווידין, והוסיפו 100 מיקרוליטר של PBST1 כדי לקשור את מוצר ה-N-acyl-FSL-1-biotin FAM לצלחת. הוסף ביוטין פלואורסצאין לצלחת כבקרה חיובית לקשירת סטרפטווידין וקריאת הקרינה. לאחר מכן דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה בחושך, תוך כדי טלטול ב -300 סל"ד.

לאחר הדגירה השתמש בפיפטה אלקטרונית רב ערוצית כדי לשטוף ידנית את הצלחת שש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBST2. שטפו אותו שלוש פעמים עם הפיפטה. שטפו אותו שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS ושטפו אותו שלוש פעמים נוספות.

הוסף 200 מיקרוליטר PBS לכל באר, וזהה את הקרינה ב-520 ננומטר בקורא מיקרו-פלטות. שמור את כל התוצאות בגיליון אלקטרוני, ולאחר מכן חשב את סטיית התקן עבור כל תגובה וכן את ערכי ה-P עבור בקרות שליליות ודגימות חיוביות עם בדיקת T לא מזווגת. בדיקת ה-LNT במבחנה המתוארת כאן משתמשת בפוספוליפידים המכילים חומצת שומן אלקין ו-FSL-1-ביוטין כמצעים ליצירת אלקין FSL-1-ביוטין.

לאחר תגובת כימיה בלחיצה עם Azido-FAM, מוצר זה הופך למסומן פלואורסצנטי וניתן לזיהוי על ידי ספקטרומטריית פלואורסצנטיות. תנאי התגובה היו מותאמים לקריאת פלואורסצנטיות מקסימלית ב-520 ננומטר. בקרות שליליות כללו תגובות ללא אנזים, עם גרסה לא פעילה של האנזים, או עם מעכב ספציפי לתיול, MTSES.

ביוטין פלואורסצאין שימש כבקרה פנימית לאות פלואורסצנטי מקסימלי. על מנת לפתח בדיקת סינון תפוקה גבוהה, התגובות בוצעו ישירות ב-384 לוחות באר. שלבי השטיפה היו אוטומטיים וכמות הריאגנטים הופחתה.

התגובה הייתה רגישה וניתנת לשחזור עם הבדל משמעותי באות הפלואורסצנטי בין הבקרה השלילית לאנזים הפעיל. עבור סינון תפוקה גבוהה, הגורם הראשוני Z קובע אם התגובה בבדיקה גדולה מספיק למטרות סינון. גורם ה-Z הראשוני הממוצע היה גדול מ-0.6 עבור בדיקת LNT שבוצעה בפורמט של 384 בארות, מה שמרמז על כך שהוא היה יוצא מן הכלל.

מבחן הצינור בסרטון זה פותח בפורמט מרובה צלחות התואם ל-HDS. ניתן להשתמש בו כדי לחקור אצילטרנספראזות אחרות ממגוון אורגניזמים.