Name: בדיקה פלואורומטרית מבוססת קליק-כימיה עבור אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז מאיפיון אנזים ועד סינון תפוקה גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: למדו איך לאפיין פעילות של אנזים apolipoprotein N-acyltransferase בחיידקים באמצעות שיטת פלואורסצנציה מבוססת כימיה קליק. הפרוטוקול מאפשר סינון תפוקה גבוהה של מעכבי אנזים לפיתוח אנטיביוטיקות חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפבריס אגו ואליקס בוצ'רלט מפלטפורמת הסינון הכימוגנומית והביולוגית, המרכז למשאבים טכנולוגיים ומחקר (C2RT) במכון פסטר פריז על הצעות מועילות לפרוטוקול, לכל חברי יחידת BGPB לתמיכה ודיונים מדעיים, ולסיימון לגוד על קריאה ביקורתית של כתב היד. העבודה מומנה על ידי יוזמות טיפול גלובליות של המכון קרנו מחלות זיהומיות והמכון קרנו מיקרובים ובריאות (15 CARN 0017-01 ו 16 CARN 0023-01).

1. הכנת אנזימים וסובסטרטים
<ol><li>טיהור אנזים
	<ol><li>לייצר ולטהר את אנזים Lnt מממברנות מסיסות דטרגנט כפי שתואר קודם לכן 4,8. בקצרה, לגרום לביטוי של הגן lnt-strep, קידוד Lnt עם תג C-terminal Strep, ב OD 600 של 0.6 עם טטרציקלין נטול מים (200 ng / mL) ב 37 °C במשך 16 שעות.</li>
		<li>קצירת תאים על ידי צנטריפוגה בגודל 4,000 x גרם למשך 10 דקות והשלכת הסופרנטנט.</li>
		<li>השהה את כדור התא במאגר WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) ל-100 OD600 יחידות למ"ל.</li>
		<li>לשבור את התאים על ידי שני מעברים דרך לחץ תא לחץ צרפתי ב 10,000 psi.</li>
		<li>הסר תאים רציפים ופסולת על ידי צנטריפוגה בגודל 13,000 x g למשך 20 דקות. שמור את הסופרנטנט והשלך את הכדור.</li>
		<li>צנטריפוגה supernatant ב 120,000 x גרם במשך 60 דקות ולאסוף את שלפוחית הממברנה (גלולה בצבע חום שקוף). השליכו את הסופר-נטנט.</li>
		<li>יש לבודד את חלבוני הממברנה האינטגרליים מכדור הממברנה עם 1% (w/v) n-דודציל β-D-מלטוזיד (DDM) במאגר WA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). צנטריפוגה והסרה של חומר בלתי מבודד ב 120,000 x גרם למשך 30 דקות. השתמש בחלק העליון לטיהור.</li>
		<li>יש לטהר את Lnt-strep על עמודת כרומטוגרפיית זיקה (ראו טבלת חומרים) ועמודת סינון ג'ל S400 (ראו טבלת חומרים) כמתואר על ידי Nozeret et al.8.</li>
		<li>אחסנו את האנזים המטוהר ב-buffer WA המכיל 0.05% DDM ו-10% גליצרול בטמפרטורה של -80°C. הערה: האנזים יציב למעלה מ-5 שנים.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת מצעי ליגנד מגרה אלקין-פוספוליפידים וביוטינילציה פיברובלסטים (FSL-1-ביוטין)
	<ol><li>Aliquot 100 μL של אלקין-POPE מסונתז בהתאמה אישית (1-הקסדק-15-ינואיל-2-אולאויל-sn-גליצרו-3-פוספוטאנולמין, ראו טבלת חומרים) מסולסל בכלורופורם לצינורות 1.5 מ"ל.</li>
		<li>חודרים את הצינורות עם מזרק ומאדים את הכלורופורם במהירות ב-RT למשך שעתיים. יש לאחסן את דגימות הפוספוליפידים היבשים בטמפרטורה של -20°C.</li>
		<li>יש להמיס את האלקין-POPE ב-0.1% Triton X-100 ב-500 μM לפני השימוש. הוסף שלב סוניקציה של 3 דקות באמבט מים קולי ב- RT כדי לבודד אלקיין-POPE במידת הצורך.</li>
		<li>יש למרוח את FSL-1-ביוטין במים בעוצמה של 445 מיקרומטר. הערה: ניתן לאחסן את שני הפתרונות בטמפרטורה של -20°C למשך חודשיים לפחות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. בדיקת צינור
הערה: ביום הראשון, הגדר את תגובת Lnt בצינורות 1.5 מ"ל (שלב 2.1) וצפה 96 צלחות באר עם סטרפטווידין (שלב 2.2).
<ol><li>הכנת תערובת מגיבים ותגובה אנזימטית
	<ol><li>עבור בדיקת Lnt סטנדרטית, יש לערבב אלקין-POPE (50 μM סופיים ממלאי של 500 μM) ו-FSL-1-ביוטין (ריכוז סופי של 50 μM ממלאי של 445 μM) במאגר התגובה Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100 המכיל 1% BSA) בנפח סופי של 18 μL בצינורות 1.5 מ"ל. בצע את כל התנאים במשולש.</li>
		<li>סוניקו את תערובת המצע (מוכנה בשלב 2.1.1) במשך 3 דקות באמבט מים קולי ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפני הוספת אנזים Lnt (שלב 2.1.3). הערה: MTSES (נתרן (2-סולפונטואתיל)מתנאתיוסולפונט), מגיב ספציפי לתיול, מעכב Lnt8. הוסף 10 mM MTSES (תמיסת מלאי של 100 mM ב- 100% DMSO) לצינורות התגובה (שלב 2.1.1) כדי לשמש כדגימות בקרה שלילית. כוונן את עוצמת הקול של מאגר התגובה Lnt כך שהנפח הכולל יהיה 18 μL.</li>
		<li>הוסף Lnt פעיל (1 ng/μL, המתאים ל-17.2 ננומטר) או לא פעיל Lnt (C387S) (2 μL מתוך מלאי של 10 ng/μL במאגר WA המכיל 0.05% DDM) וערבב עם המצעים (שלב 2.1.2) על-ידי צנרת למעלה ולמטה.</li>
		<li>לדגום את התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות בתרמומיקסר עם מכסה מחומם.</li>
	</ol></li>
	<li>ציפוי סטרפטווידין של 96 לוחות באר
	<ol><li>הכינו תמיסת מלאי של סטרפטאבידין במינון של 2 מ"ג/מ"ל ב-H2O. הערה: ניתן לאחסן תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים.</li>
		<li>מתמיסת המלאי יש להכין 10 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטאבידין במים כפתרון עובד. הוסף 100 μL של התמיסה לכל באר של צלחת 96 באר. קושרים סטרפטאבידין לצלחת על ידי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ללא מכסה לייבוש האוויר של הבארות.</li>
	</ol></li>
</ol>הערה: ביום 2 בצעו כימיה של קליקים (שלב 2.3), קשרו את תערובת התגובה Lnt ללוחות מצופים סטרפטאבידין (שלב 2.4), וזיהו פלואורסצנטיות ונתחו את התוצאות (שלב 2.5).
<ol start="3"><li>תגובת קליק-כימיה
	<ol><li>הכן פתרונות מלאי של Azido-FAM (5 mM ב- DMSO), TCEP (טריס (2-קרבוקסיאתיל) פוספין הידרוכלוריד; 50 mM מוכן במים), TBTA (טריס[(1-בנזיל-1H-1,2,3-טריאזול-4-yl)מתיל]אמין; 2 mM בטרט-בוטאנול:DMSO (4:1)), ו- CuSO4∙5H 2 O (50 mM מוכן טרי ב- H2O).</li>
		<li>בצינורות של 1.5 מ"ל המכילים את תערובת התגובה Lnt שהוכנה בשלב 2.1.4, בצע כימיה של קליקים על ידי הוספת הריאגנטים בסדר הבא: 0.2 μL של מלאי Azido-FAM (ריכוז סופי 50 μM), 0.4 μL של מלאי TCEP (ריכוז סופי 1 mM), 0.2 μL של מלאי TBTA (ריכוז סופי 0.02 mM).</li>
		<li>וורטקס הפתרון במשך 5 שניות. לאחר מכן להוסיף 0.4 μL של מלאי CuSO4 (ריכוז סופי 1 mM). וורטקס שוב במשך 5 שניות. דגרו את הדגימות בחושך ב-RT למשך שעה אחת.</li>
	</ol></li>
	<li>קשירת תערובת תגובת Lnt לצלחות מצופות סטרפטווידין
	<ol><li>לשטוף את הבארות של לוחות מצופה streptavidin לאחר הדגירה בלילה משלב 2.2.2 3x עם 200 μL של PBS-T1 (PBS המכיל 0.05% Tween-20). הערה: ניתן להשתמש בצלחות סטרפטווידין באופן מיידי או לאחסן יבשות בטמפרטורה של 4°C.</li>
		<li>העבר 18 μL מתערובת קליק-כימיה משלב 2.3.3 לבאר בצלחת מצופה סטרפטווידין 96 באר והוסף 100 μL של PBS-T1 כדי לקשור N-acyl-FSL-1-biotin-FAM המוצר ללוחות סטרפטאווידין.</li>
		<li>השתמש בביוטין-פלואורסצין (0.26 מיקרומטר ממלאי של 3.1 mM ב-DMSO) כבקרה חיובית עבור קשירת סטרפטאבידין וקריאת פלואורסצנציה.</li>
		<li>דגרו את הצלחות ב-RT במשך שעה אחת בחושך בתרמומיקסר, ורעדו ב-300 סל"ד.</li>
		<li>בצע שלבי שטיפה ידניים של 96 לוחות הבאר עם פיפטה אלקטרונית רב ערוצית כדלקמן: שש שטיפות עם 200 μL של PBS-T2 (PBS המכיל 1% Tween-20), שלוש שטיפות עם פיפטה, שלוש שטיפות עם 200 μL של PBS, שלוש שטיפות עם פיפטה.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהוי וניתוח פלואורסצנציה
	<ol><li>הוסף 200 μL של PBS ורשום את הפלואורסצנציה ב-520 ננומטר בקורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטי. שמור תוצאות בתוכנת גיליון אלקטרוני. הערה: ביוטין-פלואורסצין משמש כבקרה חיובית לקשירת סטרפטאבידין וזיהוי פלואורסצנטיות ב-520 ננומטר. קריאה ניתנת לשחזור של 30,000-40,000 A.U. עם 0.26 μM ביוטין-פלואורסצין צפויה. כל הדגימות מנותחות במשולש, כולל בקרות.</li>
		<li>חשב את סטיית התקן עבור כל תגובה ואת חישוב ערכי P עבור בקרות שליליות ודגימות חיוביות באמצעות בדיקת t לא מותאמת באמצעות תוכנה סטטיסטית.</li>
	</ol></li>
</ol>3. בדיקת צלחת מרובת בתים
הערה: ביום 1 הגדר את תגובת Lnt ב-384 צלחות באר (שלב 3.1) וצפה 384 צלחות באר עם סטרפטווידין (שלב 3.2).
<ol><li>הכנת תערובת מגיבים ותגובה אנזימטית הערה: כמות הריאגנטים והאנזים מופחתת בהשוואה לבדיקת הצינורית ותגובת Lnt מבוצעת ישירות ב-384 צלחות קידוח. זה מאפשר שימוש בפחות חומר והפחתת צעדים שניתן להפוך לאוטומטיים עוד יותר.<ol><li>ערבבו את המצעים באופן הבא: אלקין-POPE (ריכוז סופי של 50 מיקרומטר ממלאי של 500 מיקרומטר) ו-FSL-1-ביוטין (50 מיקרומטר סופיים ממלאי של 500 מיקרומטר) במאגר התגובה Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100 המכיל 1% BSA) בנפח של 13.5 μL לכל תגובה לכל באר בפורמט של צלחת באר 384. בצע את כל התנאים במשולש. חשב את הכמות הכוללת של ריאגנטים הנדרשת למספר התגובות שיש לבצע (כלומר, 5,184 μL עבור צלחת קידוח אחת של 384).</li>
		<li>סוניקו את תערובת המצע במשך 3 דקות באמבט מים קולי.</li>
		<li>Aliquot 13.5 μL של תערובת המצע לכל באר בלוח באר 384. הערה: כבקרה שלילית, ניתן להוסיף 10 mM של MTSES (תמיסת מלאי של 625 mM ב- 100% DMSO) לכל באר. התאם את עוצמת הקול של מאגר Lnt (שלב 3.1.1) כדי להגיע לנפח תגובה סופי של 13.5 μL.</li>
		<li>דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפני הוספת אנזים Lnt (שלב 3.1.5).</li>
		<li>הוסף 0.5 ng/μL (המקביל ל-8.6 ננומטר) אנזים Lnt פעיל, או גרסה לא פעילה (C387S) (1.5 μL ממלאי של 5 ng/μL במאגר WA המכיל 0.05% DDM) במאגר התגובה Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1% BSA) לכל באר המכילה את תערובת התגובה משלב 3.1.3. ערבבו ריאגנטים על ידי צנרת למעלה ולמטה. נפח התגובה הכולל הוא 15 μL.</li>
		<li>אטמו את הצלחת עם רדיד אלומיניום ללוחות מרובי-כלים.</li>
		<li>דגירה ב-37°C למשך 16 שעות בתרמומיקסר עם מכסה מחומם.</li>
	</ol></li>
	<li>ציפוי סטרפטאבידין 384 לוחות באר<ol><li>יש להשתמש ב-75 μL של סטרפטווידין (10 מיקרוגרם/מ"לב-H 2 O) משלב 2.2.2 כדי לצפות בארות של צלחת באר 384. תנו לסטרפטווידין להיקשר לצלחת על ידי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ללא מכסה לייבוש האווירי של הבארות.</li>
	</ol></li>
</ol>הערה: ביום 2 בצעו כימיה של קליקים (שלב 3.3), קשרו את תערובת התגובה Lnt ללוחות מצופים סטרפטאבידין (שלב 3.4), זיהו פלואורסצנטיות ונתחו את התוצאות (שלב 3.5).
<ol start="3"><li>תגובת קליק-כימיה<ol><li>הכן תמיסות מלאי של אזידו-FAM (1.2 mM ב-DMSO), TCEP (טריס(2-קרבוקסיאתיל)פוספין הידרוכלוריד; 24 mM מוכן ב-H 2 O), TBTA (טריס[(1-בנזיל-1H-1,2,3-טריאזול-4-yl)מתיל]אמין; 0.48 mM בטרט-בוטנול:DMSO (4:1)) ו-CuSO4∙5H 2 O (24 mM מוכן טרי ב-H2O).</li>
		<li>שלבו את שלושת הריאגנטים בכימיה של קליקים: תערובת של Azido-FAM (ריכוז סופי 50 μM), TCEP (1 mM סופי) ו-TBTA (0.02 mM סופי), כל אחד ב-0.75 μL בנפח סופי של 2.25 μL לכל באר. חשב את הנפח הנדרש לכל צלחת באר 384 (כלומר, השתמש ב- 864 μL כאשר נעשה שימוש בכל הבארות של צלחת הבאר 384). מערבבים במרץ.</li>
		<li>הוסף 2.25 μL של תמיסת הריאגנט לכל באר ישירות לתגובת Lnt שהושלמה בלוח הבאר 384 משלב 3.1.7.</li>
		<li>מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם פיפטה אלקטרונית רב ערוצית.</li>
		<li>הוסף CuSO4 (0.75 μL ממלאי של 24 mM לריכוז סופי של 1 mM) וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם פיפטה אלקטרונית רב-ערוצית.</li>
		<li>דגירה ב-RT למשך שעה אחת בחושך.</li>
	</ol></li>
	<li>קשירת תערובת תגובת Lnt ללוחות באר מצופים סטרפטווידין 384
	<ol><li>לשטוף את הבארות של לוחות מצופה streptavidin לאחר הדגירה בלילה משלב 3.2.1 1x עם 85 μL PBS-T1.</li>
		<li>העבר 11 μL של תגובת הקליק-כימיה מכל באר של לוחית הדגירה משלב 3.3.6 לצלחת המצופה סטרפטווידין משלב 3.4.1 כדי לקשור את המוצר N-acyl-FSL-1-biotin-FAM ללוחות הסטרפטאווידין.</li>
		<li>הוסף 64 μL של מאגר PBS-T1.</li>
		<li>כלול ביוטין-פלואורסצין (0.19 μM ממלאי של 3.1 mM ב-DMSO) כבקרה לקשירת בארות מצופות סטרפטאווידין.</li>
		<li>דגרו את 384 לוחות הקידוח ב-RT במשך שעה אחת בחושך בתרמומיקסר, רועדים ב-300 סל"ד.</li>
		<li>לשטוף את הצלחות באמצעות מכונת כביסה צלחת אוטומטית כדלקמן: 10 כביסות עם 85 μL PBS-T2, צלחות מזועזעות בין כביסות; 5 כביסות עם 85 μL PBS, צלחות מזועזעות בין הכביסה.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהוי וניתוח פלואורסצנציה
	<ol><li>הוסף PBS (85 μL) ורשום פלואורסצנטיות בקורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטיות במהירות של 535 ננומטר.</li>
		<li>ניתוח נתונים כמתואר (שלב 2.5.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how%2C+when+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li>
<li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li>
<li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+fatty+acids+from+the+1-position+of+phosphatidylethanolamine+to+the+major+outer+membrane+lipoprotein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).</li>
<li>Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+phospholipid+specificity+of+apolipoprotein+N-acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).</li>
<li>Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Visualization+and+Large-Scale+Profiling+of+Bacterial+Lipoproteins+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters.</a> Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).</li>
<li>Thiele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+fatty+acid+metabolism+by+click-chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry.</a> ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).</li>
<li>Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-Chemistry+Based+High+Throughput+Screening+Platform+for+Modulators+of+Ras+Palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation.</a> Science Reports. 7, 41147(2017).</li>
<li>Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+fluorescence-based+assay+to+monitor+enzymatic+activity+of+the+essential+integral+membrane+protein+Apolipoprotein+N-acyltransferase+%28Lnt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt).</a> Science Reports. 9 (1), 15978(2019).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecules+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Mao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+E.+coli+lipoprotein+diacylglyceryl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase.</a> Nature Communication. 7, 10198(2016).</li>
<li>Vogeley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+lipoprotein+signal+peptidase+II+action+and+inhibition+by+the+antibiotic+globomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin.</a> Science. 351 (6275), 876-880 (2016).</li>
<li>Wiktor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+the+membrane+integral+N-acyltransferase+step+in+bacterial+lipoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis.</a> Nature Communication. 8, 15952(2017).</li>
<li>Noland, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948(2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול של בדיקת Lnt המתואר כאן, המבוסס על זיהוי פלואורסצנטי של המוצר הטריאצילי, הוא רגיש וניתן לשחזור. ההיקשרות הספציפית והיעילה של ביוטין לסטרפטווידין היא מרכיב מרכזי בבדיקה. מצע Alkyne-POPE שנותר לאחר השלמת תגובת Lnt מסומן גם הוא באופן פלואורסצנטי עם FAM אך מוסר ביעילות לאחר קשירת לוחות הסטרפטווידין על ידי שלבי שטיפה מרובים. יתר על כן, הוספת DMSO אינה משפיעה על פעילות Lnt ואין לה השפעה על הבדיקה. גם הסובסטרט וגם האנזים הם מאוד ליפופיליים ודורשים תנאי תגובה במיקסים מעורבים. טכניקות התלויות באנזימים ומצעים מסיסים לזיה...

ליפופרוטאינים חיידקיים מאופיינים בחומצות שומן הקשורות באופן קוולנטי באמינו-טרמיני שלהם, שדרכן הם מעוגנים לממברנות 1,2. החלק הבוגר של החלבון מגוון מאוד במבנה ובתפקוד, ובכך מסביר את תפקידם של ליפופרוטאינים בתהליכים ביולוגיים שונים במעטפת התא החיידקי.
ליפופרוטאינים משתנים על ידי חומצות שומן שמקורן בפוספוליפידים לאחר החדרתם לקרום הציטופלסמי. הפרוליפופרוטאינים מכילים מוטיב חתימה, הליפובוקס, המכיל שאריות ציסטאין אינווריאנטיות שהופכות לאצילציה וחומצת האמינו הראשונה בחלבון הבוגר. השלב הראשון של מסלול זה מזורז על ידי פרוליפופרוטאין פוספטידילגליצרול::d iacylglyceryl transferase (Lgt), אשר מעביר את קבוצת הדיאצילגליצריל מפוספטידילגליצרול אל הפרוליפופרוטאין באמצעות קישור תיואתר בין דיאצילגליצריל לציסטאין. אות פפטידאז II (Lsp) מבקע את פפטיד האות מדיאצילגליצריל פרוליפופרוטאין, והתוצאה היא אפוליפופרוטאין המעוגן לתוך הממברנה דרך הדיאצילגליצריל מואטי שלו. השלב השלישי והאחרון הוא זרז על ידי אפוליפופרוטאין N-acyltransferase (Lnt), אשר מוסיף חומצת שומן ממיקום sn-1 של פוספוליפיד על אפוליפופרוטאין, וכתוצאה מכך ליפופרוטאין בוגר טריאצילציה (איור 1)3. תגובת Lnt היא תגובת פינג-פונג דו-שלבית שבה נוצר אנזים תיואסטר אציל יציב. תוצר הלוואי של הליזופוספוליפידים משתחרר לפני האצילציה של מצע האפוליפופרוטאין בשלב השני של התגובה.
הספציפיות של המצע הפוספוליפידי נקבעת בבדיקת Lnt בהתבסס על תזוזת הניידות של N-אציל דיאצילגליצריל פפטיד על אחוז גבוה של Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. פוספוליפידים עם קבוצות ראש קוטביות קטנות, רוויים [sn-1] ולא רוויים [sn-2], היו מצעים מועדפים4. בדיקת הסטת הג'ל אינה מתאימה למחקרים קינטיים נרחבים של אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז וגם לא ל-HTS לזיהוי מולקולות מעכבות. כימיה של קליקים באמצעות חומצות שומן אלקין שימשה בהצלחה לחקר שינוי ליפופרוטאין בחיידקים5 ומטבוליזם של חומצות שומן באאוקריוטים6. לאחרונה דווח על בדיקה חוץ-גופית של Ras palmitoylation לזיהוי מעכבים7.
בשיטה המתוארת כאן, Lnt פעיל מטוהר בדטרגנט הוא דגירה עם מצעים ב micelles מעורבים כדי ליצור פפטיד alkyne-triacylated כי הוא זוהה לאחר מכן על ידי ספקטרומטריה פלואורסצנטית.

<table><tbody><tr><td>&Auml; מערכת מטהר kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>NA</td><td>טוהר: NA Lnt טיהור</td></tr><tr><td>אלקין-POPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>900414P</td><td>טוהר: >99% מצע Lnt</td></tr><tr><td>Azido-FAM</td><td>Lumiprobe</td><td>A4130</td><td>טוהר: 100% (טהור) מגיב קליק</td></tr><tr><td>ביופוטומטר פלוס</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>טוהר: NA OD 600 ננומטר</td></tr><tr><td>BioTek ELX 405 מכונת כביסה נבחרת</td><td>BioTek</td><td>N&deg; סדרה 115800, n&deg; חומר 405 בחר</td><td>טוהר: NA שלבי כביסה</td></tr><tr><td>ביוטין-פלואורסצאין</td><td>סיגמא</td><td>53608</td><td>טוהר: &ge; 90% בקרת פלואורסצנטיות</td></tr><tr><td>נחושת (II) סולפט פנטהידראט</td><td>סיגמא</td><td>C3036</td><td>טוהר: &ge; 98% מגיב קליק</td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td>טוהר: &ge; 99% &beta;+&alpha;; < 15% &alpha; חומר ניקוי לטיהור Lnt</td></tr><tr><td>דימתיל-סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>D12435</td><td>טוהר: נטול מים מגיב פיפליזציה</td></tr><tr><td>אלקטרוני וויאג'ר 8 ערוצים 0.5-12.5 uL</td><td>INTEGRA</td><td>4721</td><td>טוהר: NA טיפול בריאגנטים</td></tr><tr><td>תא לחץ צרפתי</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>טוהר: NA שיבוש תאים</td></tr><tr><td>FSL-1-ביוטין</td><td>מיקרו-קולקציות EMC</td><td>L7030</td><td>טוהר: מצע NA Lnt</td></tr><tr><td>גריינר ביו-וואן 384 בארות סטנדרטי CELLSTAR פוליסטירן מיקרופלייט</td><td>גריינר</td><td>781091</td><td>טוהר: NA שחור עם תחתית שקופה (קריאה למעלה או למטה)</td></tr> <tr><td>Greiner Bio-One צלחת פוליסטירן סטרילית 96 בארות, גריינר 655097 כריכה גבוהה</td><td></td><td></td><td>טוהר: NA שחור עם תחתית שקופה (קריאה למעלה או למטה)</td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט אינסופי M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N / A</td><td>טוהר: NA זיהוי פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>MTSES (נתרן (2-סולפונטואתיל) מתאנטיוסולפונט)</td> <td>Anatrace</td><td>S110MT</td><td>טוהר: ~ 100% מעכב ספציפי לתיול</td></tr><tr><td>אופטי שקוף גיליונות חותם דבק</td><td>תרמו מדעי</td><td>AB-1170</td><td>טוהר: NA רדיד לאיטום צלחת מרובת בארות</td></tr><tr><td>Sephacryl S400 HR 16/60 ג'ל עמודת סינון</td><td>GE Healthcare</td><td>GE28-9356-04</td><td>טוהר: NA טיהור Lnt</td></tr><tr><td>StrepTactin Sepharose 50</td>% <td>IBA ביוטכנולוגיה</td><td>2-1201-010</td><td>טוהר: NA טיהור</td></tr><tr><td>Lnt סטרפטווידין</td><td>סיגמא</td><td>S4762-1MG</td><td>טוהר: &ge; 13 יחידות/מ"ג חלבון קושר ביוטין</td></tr><tr><td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine</td><td>Sigma</td><td>678937</td><td>טוהר: 97% מגיב קליק</td></tr><tr><td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>75259</td><td>טוהר: &ge; 98% מגיב קליק</td></tr><tr><td>TECAN Infinite F500</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>טוהר: NA זיהוי פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>טוהר: NA זיהוי פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>טוהר: NA מכסה מחומם</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>טוהר: 10% ב-H2O מאגר תגובה Lnt</td></tr><tr><td>אולטרה צנטריפוגה</td><td>בקמן LC</td><td>N/A</td><td>טוהר: NA פיצול תאים</td></tr></tbody></table>

בדיקה פלואורומטרית מבוססת קליק-כימיה עבור אפוליפופרוטאין n-אצילטרנספראז מאיפיון אנזים ועד סינון תפוקה גבוהה

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

ליפופרוטאינים מפרוטאובקטריה משתנים לאחר תרגום על ידי חומצות שומן שמקורן בפוספוליפידים של הממברנה על ידי פעולה של שלושה אנזימי ממברנה אינטגרליים, וכתוצאה מכך חלבונים טריאצילטים. השלב הראשון במסלול שינוי ליפופרוטאין כרוך בהעברת קבוצת דיאצילגליצריל מפוספטידילגליצרול אל הפרוליפופרוטאין, וכתוצאה מכך דיאצילגליצריל פרוליפופרוטאין. בשלב השני, פפטיד האות של פרוליפופרוטאין נבקע, ויוצר אפוליפופרוטאין, אשר בתורו משתנה על ידי חומצת שומן שלישית הנגזרת מפוספוליפיד. שלב אחרון זה הוא זרז על ידי אפוליפופרוטאין N-acyltransferase (Lnt). מסלול שינוי הליפופרוטאין חיוני ברוב הפרוטאובקטריה γ, מה שהופך אותו למטרה פוטנציאלית לפיתוח חומרים אנטיבקטריאליים חדשים. המתוארת כאן היא בדיקה רגישה עבור Lnt התואמת להקרנה בתפוקה גבוהה של מולקולות מעכבות קטנות. האנזים והסובסטרטים הם מולקולות משובצות ממברנה; לכן, הפיתוח של בדיקת מבחנה אינו פשוט. זה כולל טיהור של האנזים הפעיל בנוכחות דטרגנט, את הזמינות של אלקין-פוספוליפידים וסובסטרטים פפטידים diacylglyceryl, ואת תנאי התגובה במיזלים מעורבים. יתר על כן, על מנת להשתמש במבחן הפעילות במערך סינון בתפוקה גבוהה (HTS), עדיפה קריאה ישירה של מוצר התגובה על פני תגובות אנזימטיות מצומדות. בבדיקת אנזים פלואורומטרית זו, תוצר הפפטיד האלקין-טריאצטילטי הופך לפלואורסצנטי באמצעות תגובת קליק-כימיה ומזוהה בפורמט של צלחת מרובת בתים. שיטה זו ישימה לאצילטרנספראזות אחרות המשתמשות במצעים המכילים חומצות שומן, כולל פוספוליפידים ואציל-CoA.

בתגובת Lnt חומצת השומן sn-1 מפוספוליפידים מועברת לפפטיד דיאצילגליצריל, וכתוצאה מכך פפטיד טריאצילטי בוגר8. בדיקת Lnt במבחנה המתוארת כאן נועדה להשתמש בפוספוליפידים המכילים חומצת שומן אלקיין (אלקין-POPE) ו- FSL-1-ביוטין כמצעים, וכתוצאה מכך נוצרת אלקין-FSL-1-ביוטין. בתגובת קליק-כימיה עם אזידו-FAM, מוצר זה אמור להיות מסומן באופן פלואורסצנטי ומזוהה על-ידי ספקטרומטריית פלואורסצנציה (איור 2).
תנאי התגובה הותאמו לקריאה פלואורסצנטית מקסימלית...

מוצג כאן מבחן פלואורסצנטי רגיש לניטור פעילות אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז באמצעות פפטיד דיאצילגליצריל ואלקין-פוספוליפידים כמצעים עם כימיה של קליקים.

בדיקה פלואורומטרית מבוססת קליק-כימיה עבור אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז מאיפיון אנזים ועד סינון תפוקה גבוהה

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

פרוטוקול זה מתייחס לשני היבטים חשובים, אפיון של ממברנה אינטגרלית חיונית, אפוליפופרוטאין אצילטרנספראז של חיידקים, ופיתוח הבדיקה בפורמט HDS לסינון מעכבי האנזים. השיטה רגישה מאוד ומתאימה למטרות סינון. זה יכול לתרום לפיתוח אנטיביוטיקה חדשה פוטנציאלית.סרטון זה יעזור להדגיש שלבים קריטיים של פרוטוקול זה, כגון ערבוב, מערבולת, סוניקציה, תוך עבודה עם תרחיפים לא הומוגניים המכילים שומנים וחומרי ניקוי. מי שתדגים את ההליך יהיו קארין נוזרט, אורליה פרנין, שתיהן עמיתות בקבוצה שלי. התחל בהכנת תערובת המגיב לבדיקת אפוליפופרוטאין ואציל טרנספראז או LNT.מערבבים אלקין POPE ו-FSL-1-ביוטין עם מאגר תגובת LNT בצינורות של 1.5 מיליליטר בנפח סופי של 18 מיקרוליטר. הכן תערובות ריאגנטים משולשות לכל התנאים שנבדקו. סוניקציה של תערובות הריאגנטים למשך שלוש דקות באמבט מים קולי, ודגירה אותן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.לאחר מכן הוסיפו LNT פעיל או לא פעיל לריכוז סופי של ננוגרם אחד למיקרוליטר, ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות במיקסר תרמי עם מכסה מחומם. בינתיים, הכינו תמיסת מלאי של שני מיליגרם למיליליטר סטרפטווידין.ולדלל אותו ל -10 מיקרוגרם למיליליטר כדי ליצור פיתרון עובד. הוסף 100 מיקרוליטר מהתמיסה לכל באר של צלחת 96 בארות. לאחר מכן יבש את הבארות באוויר למשך הלילה על ידי דגירה של הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ללא מכסה.למחרת, הכינו תמיסות מלאי של 5 מילי-מולרי Azido-FAM, 50 מילי-מולרי TCEP, 2 מילי-מולרי TBTA ו-50 מילי-מולרי נחושת סולפט פנטהידרט. בצע כימיה של קליקים על ידי הוספת 0.2 מיקרוליטר של מלאי Azido-FAM, 0.4 מיקרוליטר של TCEP מלאי ו-0.2 מיקרוליטר של TBTA מלאי לצינורות התגובה של 1.5 מיליליטר LNT. מערבולת את התמיסה למשך חמש שניות.לאחר מכן הוסף 0.4 מיקרוליטר סולפט נחושת מלאי. מערבולת למשך חמש שניות נוספות ומדגר את התגובה למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. בזמן שתערובת הכימיה בקליק דוגרת, שטפו את הבארות של הצלחות המצופות סטרפטווידין שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBST1.העבירו 18 מיקרוליטר מתערובת הכימיה הקליק לבאר מצופה סטרפטווידין, והוסיפו 100 מיקרוליטר של PBST1 כדי לקשור את מוצר ה-N-acyl-FSL-1-biotin FAM לצלחת. הוסף ביוטין פלואורסצאין לצלחת כבקרה חיובית לקשירת סטרפטווידין וקריאת הקרינה. לאחר מכן דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה בחושך, תוך כדי טלטול ב -300 סל"ד.לאחר הדגירה השתמש בפיפטה אלקטרונית רב ערוצית כדי לשטוף ידנית את הצלחת שש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBST2. שטפו אותו שלוש פעמים עם הפיפטה. שטפו אותו שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS ושטפו אותו שלוש פעמים נוספות.הוסף 200 מיקרוליטר PBS לכל באר, וזהה את הקרינה ב-520 ננומטר בקורא מיקרו-פלטות. שמור את כל התוצאות בגיליון אלקטרוני, ולאחר מכן חשב את סטיית התקן עבור כל תגובה וכן את ערכי ה-P עבור בקרות שליליות ודגימות חיוביות עם בדיקת T לא מזווגת. בדיקת ה-LNT במבחנה המתוארת כאן משתמשת בפוספוליפידים המכילים חומצת שומן אלקין ו-FSL-1-ביוטין כמצעים ליצירת אלקין FSL-1-ביוטין.לאחר תגובת כימיה בלחיצה עם Azido-FAM, מוצר זה הופך למסומן פלואורסצנטי וניתן לזיהוי על ידי ספקטרומטריית פלואורסצנטיות. תנאי התגובה היו מותאמים לקריאת פלואורסצנטיות מקסימלית ב-520 ננומטר. בקרות שליליות כללו תגובות ללא אנזים, עם גרסה לא פעילה של האנזים, או עם מעכב ספציפי לתיול, MTSES.ביוטין פלואורסצאין שימש כבקרה פנימית לאות פלואורסצנטי מקסימלי. על מנת לפתח בדיקת סינון תפוקה גבוהה, התגובות בוצעו ישירות ב-384 לוחות באר. שלבי השטיפה היו אוטומטיים וכמות הריאגנטים הופחתה.התגובה הייתה רגישה וניתנת לשחזור עם הבדל משמעותי באות הפלואורסצנטי בין הבקרה השלילית לאנזים הפעיל. עבור סינון תפוקה גבוהה, הגורם הראשוני Z קובע אם התגובה בבדיקה גדולה מספיק למטרות סינון. גורם ה-Z הראשוני הממוצע היה גדול מ-0.6 עבור בדיקת LNT שבוצעה בפורמט של 384 בארות, מה שמרמז על כך שהוא היה יוצא מן הכלל.מבחן הצינור בסרטון זה פותח בפורמט מרובה צלחות התואם ל-HDS. ניתן להשתמש בו כדי לחקור אצילטרנספראזות אחרות ממגוון אורגניזמים.

click-chemistry-based-fluorometric-assay-for-apolipoprotein-n

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מוצג פרוטוקול לסינון תרופות מולקולרי קטן המבוסס על סינתזה באתרה של ננו-אשכולות זהב פלואורסצנטיים קטנים במיוחד (Au NCs) באמצעות חלבון טעון תרופות כתבנית. שיטה זו פשוטה לקביעת הזיקה של תרופות לחלבון מטרה על ידי אות פלואורסצנטי גלוי הנפלט מתבנית החלבון Au NCs.

מהיר וכמוני Fluorimetric שיטה להקרנת סמים מיקוד-חלבון מולקולה קטנה

עבודה זו מציגה שיטה לסריקת תפוקה גבוהה באמצעות מערכת סינון אנזימים גנטית אוניברסלית שניתן ליישם באופן תיאורטי על למעלה מ-200 אנזימים. כאן, מערכת הסינון היחידה מזהה שלושה אנזימים שונים (ליפאז, צלולאז ופוספטאז אלקליין) פשוט על ידי שינוי הסובסטרט המשמש (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ופניל פוספט).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

אנו מציגים ניתוח תוכן בקוד פתוח גבוה (HCA) מכשיר ניצול הדמית חי קרינה אוטומטי (FLIM) עבור assaying אינטראקציות חלבון באמצעות תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג) readouts המבוסס. רכישת נתונים עבור מכשיר openFLIM-HCA זו נשלטת על ידי תוכנות שנכתבו ב μManager וניתוח נתונים מבוצע FLIMfit.

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

אנו מציגים במחקר הנוכחי הוא assay קרינה מבוססת רומן באמצעות לימפוציטים נגזר עכבר מהונדס. Assay זה מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות ניחן קיבולת אחד עיכוב או קידום ההפעלה הלימפוציטים.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

נתאר כאן fluorometric assay ללא תא הביוכימי לקביעת ה-HDL-השומנים peroxidation. זה מהיר ולא לשחזור assay יכול לשמש כדי לקבוע פונקציה HDL במחקרים בקנה מידה גדול והוא יכול לתרום להבנת פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות.

ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

מדידה של קיבולת בזרימת במבחנה כולסטרול סרום או פלזמה במודלים macrophage התא הוא כלי מבטיח כמו סמן עבור טרשת עורקים. במחקר הנוכחי, אנו לייעל לתקנן שיטה בזרימת להארכה-כולסטרול פלורסנט, לפתח ניתוח תפוקה גבוהה באמצעות לוחות 96-ובכן.

תפוקה גבוהה התווית על-ידי Nitrobenzoxadiazole כולסטרול בזרימת Assay

באמצעות שיטת הסריקה (NADH)-ביחד התאמה ATPase הותאמה הקרנה חצי תפוקה גבוהה של מולקולה קטנה רירן מעכבי. זה שיטת הקינטי מופעל בפורמט 384-היטב אימונולוגיה עם כמויות התגובה הכולל של רק 20 μl לכל טוב. הפלטפורמה צריכה להיות ישימה כמעט כל הפקת האנזים.

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

פרוטוקול זה מציג שיטה למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד לקולטנים בזמן אמת בסביבה תאית. הקישור נמדד כהעברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) בין נגזרות נוקלאוטידים של טריניטרופניל לבין חלבון המסומן בחומצת אמינו פלואורסצנטית לא קנוני.

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

ניטור שינויים בטמפרטורת ההיתוך של חלבון יעד (כלומר,בדיקת משמרות תרמית, TSA) היא שיטה יעילה לבדיקת ספריות שברים של כמה מאות תרכובות. אנו מציגים פרוטוקול TSA המיישם פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית בסיוע רובוטיקה (nano-DSF) לניטור פלואורסצנטיות טריפטופן מהותית ופיזור גב אור להקרנת שברים.

פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית להקרנה בתגלית עופרת מבוססת שבר

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

בדיקות כימיות מהירות ומדויקות לסינון מעכבים ספציפיים הן כלי חשוב בארסנל פיתוח התרופות. כאן, אנו מציגים בדיקה כימית מדרגית של קליק אצטיל-קליק כדי למדוד את העיכוב של פעילות אצטילציה HAT1.

בדיקת כימיה של צטיל קליק למדידת אצטילטרנספראז היסטון 1 אצטילציה

למדו איך לאפיין פעילות של אנזים apolipoprotein N-acyltransferase בחיידקים באמצעות שיטת פלואורסצנציה מבוססת כימיה קליק. הפרוטוקול מאפשר סינון תפוקה גבוהה של מעכבי אנזים לפיתוח אנטיביוטיקות חדשות.

בדיקה פלואורומטרית מבוססת קליק-כימיה עבור אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז מאיפיון אנזים ועד סינון תפוקה גבוהה

גלה סרטונים נוספים