ייצור של ברוילרים ללא חיידקים הגדלים במהירות מקו מסחרי ללימודי מיקרוביוטה

עד כה, ייצור ציפורים ללא חיידקים הוגבל לגזע בעלי חיים לצורך מחקר. אנו מראים כאן שאפשר לעשות זאת עם בעלי חיים מסחריים. טכניקה זו מאפשרת לבצע מחקרים על השפעת המיקרוביוטה באמצעות הרקע הגנטי של ציפורי משק.

כאשר מנסים פרוטוקול זה, חשוב לשלוט בגידול המין הנבחר בתנאים הסטנדרטיים ולהיות בעלי ידע רב בעבודה במבודדים. התחל בהתקנת צינורות של 50 מיליליטר, פיפטות פלסטיק, הזנה מוקרנת, מים חיטוי ומיכלי פלסטיק אטומים סטריליים במבודד קשיח בלחץ חיובי. מלאו את מלכודת קוטל החיידקים ההעברה בתמיסת אמוניום רבעונית של 2% ועיקרו את המבודד שלוש פעמים עם אדי פורמלדהיד המעבירים את החומרים בתוך המבודד בין כל עיקור כדי להבטיח חיטוי של כל משטחי המגע.

לפחות יומיים לפני הכנסת הביצים, הגדר את טמפרטורת המבודד ל -37 מעלות צלזיוס. ביום ההיכרות, הגדר את ההידרומטר ל-65 עד 70% מהלחות היחסית. לאחר בחירת ביצים נקיות וללא רבב, יש לטהר מיד את פני הביצה על ידי טבילתן בתמיסת חומצה פראצטית של 1.5% למשך חמש דקות, ולאחר מכן להעביר את הביצים למתקן הניסוי באמצעות קופסה מטוהרת באדי פורמלדהיד.

אחסן את הביצים למשך 24 שעות בחום של 14 מעלות צלזיוס, ואז חזור על העיקור עם חומצה פראצטית של 1.5% והניח את הביצים בחממת בקיעה למשך 19 יום. ביום ה-19, ודא את הפוריות, הכדאיות וההתפתחות של העובר באמצעות נר ביצים בהיר בתנאים סטריליים. בחר ביצים חיות ועובריות וטהר אותן על ידי ריסוס בתמיסת חומצה פראצטית של 1.5% למשך 30 שניות או עד שכל פני השטח של כל ביצה מכוסים.

העבירו את הביצים למבודדי הבקיעה הסטריליים ושטפו אותן במים דה-מינרליים סטריליים לפני שמניחים אותן בחלל הבקיעה. לאחר הבקיעה, החיות מוחזקות במבודדים הסטריליים, מוזנות אד ליביטום בתזונה מסחרית מעוקרת על ידי קרינת גמא ומושקות במי ברז אוטוקלאבים. יום לאחר הבקיעה, קחו דגימת צואה ישירות מפי הטבעת של אפרוחים שונים ואחסנו אותם בצינור זכוכית מעוקר.

הוסף מיליליטר אחד של צואה לתשעה מיליליטר של מרק תיוגליקולט עם רזזורין והוסף את הדגימה הנותרת לתשעה מיליליטר של עירוי לב מוח או מרק BHI. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מבלי לנער במשך 18 עד 48 שעות. לאחר 18 שעות, בדוק ויזואלית את הצינורות עבור כל שינוי באמצעי הגידול.

לאחר 48 שעות, קחו טיפה מאמצעי מרק הצואה של BHI, הניחו אותה על מגלשת זכוכית והתבוננו בה במיקרוסקופ. אם יש חשד לנוכחות חיידקים, קחו דגימה מתרבית BHI וזרעו אותה על צלחת אגר BHI, ואז דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות למשך 18 עד 48 שעות. אם מופיעות מושבות, זהה את החיידקים באמצעות טכניקה בעלת תפוקה גבוהה כגון ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF.

שש ריצות של יצירת אפרוחים ללא חיידקים נערכו עם ביצי ROSS PM3 שהגיעו משתי חוות צרפתיות שונות. בסך הכל נאספו 853 ביצים ולאחר שני שלבי טיהור ו-19 ימי דגירה, 86.40% היו ברי קיימא. מתוך הביצים הקיימות, 490 עברו שלב טיהור שלישי והוכנסו למבודדי בקיעה שונים בשיעור בקיעה ממוצע של 79.80%, זה מייצג שיעור בקיעה של 68.94% בהשוואה למספר הביצים הראשוני שנאספו.

תוצאות הבקיעה משתנות באופן משמעותי בין 41.67% ל-88.16% מהאפרוחים בני הקיימא בהשוואה למספר הביצים שנאספו. השפעה זו הייתה בקורלציה ישירה עם גיל התרנגולות המטילות, שם ביצים שהגיעו מתרנגולות מבוגרות היו פחות ברות-קיימא. שש הריצות בוצעו באמצעות ארבעה מבודדי בקיעה שונים.

לאחר הדברה בקטריולוגית, בעלי החיים מ-14 מתוך 16 המבודדים אושרו כנקיים מחיידקים, המקבילים לשיעור הצלחה של 86.5%נקודת המפתח של הליך זה היא שמירה על סטריליות המבודד. זה דורש עמידה בהליכי חיטוי ומעל לכל, שליטה על הכנסת האלמנטים דרך נעילת האוויר הנוזלית. הליך זה מספק לבעלי חיים למדוד את השפעת המיקרוביוטה על הפיזיולוגיה והבריאות של ציפורים.

ניתן להתאים אותו ולהשתמש בו כדי לחקור מיקרוביוטה של ציפורים מחוות אחרות או חיות בר אם הביצים נגישות.