Name: מערכת גנוטוביוטית לחקר מכלול המיקרוביאום בפילולספירה ובתסיסה הצמחית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: חקור אינטראקציות מיקרוביאליות בפילוספירה של כרוב נאפה נטול חיידקים. שיטה זו מאפשרת לחבר בין מבנה הקהילה המיקרוביאלית לתפקודה בתסיסה ירקות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו תמכה במענק משרד החקלאות-NIFA: 2017-67013-26520. טרייסי דבנפורט וקלייר פוגן סיפקו תמיכה טכנית ורובי יה וקייסי Cosetta לספק הערות מועילות על גרסאות מוקדמות של כתב יד זה.

1. גידול כרובים ללא חיידקים
<ol><li>הכנת ציוד לגידול כרובים ללא חיידקים<ol>
<li>ניקוי החימר המכונה להסרת חלקיקי אבק משובחים<ol>
<li>לשטוף חימר המכונה (טבלת חומרים) לפחות 3x עם מים ברז; רוקן את המים. התראה: פלסטלינה מייצרת אבק משובח מאוד ומומלץ לחבוש מסכת הגנה (שולחן חומרים) בעת הכביסה.</li>
			<li>התפשטות חימר calcined החוצה כשכבה דקה (~ 4 ס מ) לתוך מגש החיטוי והחיטוי על מחזור יבש (121 מעלות צלזיוס עבור 20 דקות ו 20 דקות ייבוש זמן) כדי לחטא.</li>
			<li>הניחו לחימר להתייבש במלואו לפני השימוש על-ידי הפצת המגשים והצבת בחממה חמה (30-37 ° c) לפחות שבוע. מערבבים כדי לערבב כל 3 ימים כדי לייבש באופן מלא את חימר calcined כך הוא יספוג כמות אפילו של מורראשיג ו Skoog (MS) ציר מזינים (סעיף 1.2). הערה: ייבוש גם עוזר לשמור על נפח של חימר calcined גם כאשר הוא שקול לתוך צינורות. ייבוש באמצעים אחרים, כגון תנור ייבוש, יהיה גם מתאים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ניקוי כלי הזכוכית לגידול כרובים ללא חיידקים<ol>
<li>לנקות ולעקר ביסודיות את צינורות הזכוכית (טבלת חומרים) בין כל שימוש. להשרות צינורות עבור 30 דקות ב 30% תמיסת אקונומיקה ולשטוף היטב עם מי ברז לפני ניקוי בשטף חומצה על הגדרת בדיקות. חומצה-לשטוף כובעי בדיקה דוכיוון (טבלת חומרים) בין שימושים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>זרעי כרוב מחוטא<ol>
<li>מקום עד 100 כרוב נאפה (ב. ראפה var pekinensis) זרעים בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL. הערה: הוספת יותר מ 100 זרעים לצינור מיקרוצנטריפוגה אחד או שינוי גודל הצינור עשוי להשפיע על שיעורי נביטה של הזרעים עקב חוסר הסרת מעיל זרעים.</li>
			<li>הוסף 1 מ ל של 70% אתנול לזרעים ומערבולת עבור 5 דקות. להיפטר אתנול באמצעות פיפטה.</li>
			<li>הוסף 1 מ ל של 50% אקונומיקה ומערבולת עבור 5 דקות. למחוק את פתרון אקונומיקה באמצעות פיפטה.</li>
			<li>הוסיפו 1 מ ל של מים ומערבולת אוטומטיים במשך 5 דקות. להשליך את המים מוכי באמצעות פיפטה.</li>
			<li>חזור על השלב 1.1.3.4 3x לשטוף את כל אקונומיקה. משרים את הזרעים במים מעוקרים ועקרים עבור 2-8 שעות לפני שתילת לריכוך מעיל הזרע.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>גידול כרובים ללא חיידקים הערה: כרוב נאפה (נולד ב-ראקיאר פקינאנסיס) מגודלים בצינורות זכוכית (15 ס"מ x 2.5 ס מ) המכילים חימר שנספג ב מורראשיג ו Skoog (MS) מרק מזינים (איור 1).<ol>
<li>שוקל 10 גר' חימר calcined נקי לתוך צינור זכוכית נקייה (15 ס"מ x 2.5 ס מ).</li>
		<li>הכינו ציר תזונתי MS על ידי המסת 4.4 g של MS מדיום ב 1 L של מים מנולים. הוסף ציר מזינים MS (~ 9 מ"ל) על כל צינור זכוכית לכסות את חימר calcined באמצעות פיפטה. הערה: עומד נוזל בצינור ימנע את הזרע מן המונטינג כך שהוא עשוי להיות benecessary כדי להוסיף מעט פחות MS ציר לצינורות כמה.</li>
		<li>שפופרות זכוכית כיפה באופן רופף עם 22 מ"מ כמוסות מבחנה בשתי כיוון וכובעים (121 ° c עבור 60 דקות). בעת הסרתם מן החיטוי, לדחוף כובעים על צינורות זכוכית כדי לאטום אותם. צינורות מגניב לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</li>
		<li>בעדינות למקם אחד זרע כרוב סטרילי למרכז של כל צינור באמצעות סטרילי, בתוספת ארוכה (25.4 ס מ) מלקחיים. מניחים את הצינורות במגש של 7 כיוון ולאחר מכן מניחים תחת מתלה קל (ספקטרום מלא T5 נורות פלורסנט או הגדרת תאורה אחרת לצמיחה צמח) עם מחזור 16 h האור ב 24 ° c. הערה: זרעים לנבוט לילה ולפתח עלה האמיתי הראשון שלהם אחרי 5 ימים. עלה אמיתי הוא העלה כלי הדם הראשון לאחר שנוצרו הקוטונים. יש לו קצה מקומט יותר וברוב הכרוב מכוסה trichomes.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקת עקרות של כרובים ללא חיידקים הערה: כדי לבדוק אם הכרובים הם ללא חיידקים, בחרו מספר כרוב (5 עד 10) מכל אחת מהאצווה והלוח כדי לקבוע אם קיימים מושבות מסוימות.<ol>
<li>בעדינות להסיר את הכרוב מצינורות זכוכית על ידי מרתק את הבסיס של הצמח עם מלקחיים מעוקר ומושך אותו החוצה. לפני הסרת כרוב במלואו מן הצינור, לחתוך בזהירות את השורשים באמצעות מספריים לחיתוך מעוקר. לדחוס את הכרוב לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. הערה: כרובים גדולים יותר עשויים לדרוש הסרת אחד או שניים העלים הגדולים בעוד הכרוב הוא עדיין בצינור כדי להקל על הפיכת כרוב לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. אלה עלים גדולים ניתן להוסיף לצינור 1.5 mL לאחר שאר הכרוב הונחו לתוך הצינור אם הכרוב כולו נדרש.</li>
		<li>הוסף 400 μL של תמיסת מלח באגירה של 1 x פוספט (PBS) לכל שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL. בעזרת מיקרופטסל סטרילי, המגון משתמש בכרוב על ידי לימון 30x.</li>
		<li>לוחית 100 μL של כרוב המגון אכלו על צלחות אגר כדי לקבוע אם יש מזהמים כלשהם במדגם. רוב החיידקים שנמצאו ב-phyיוסה יגדלו על צלחות סויה טריטיות (TS) אגר. השתמש בטיפים לשימוש נרחב בצינורות כאשר כרוב הציפוי המגון כרוב כרוב לאכול עבה והוא יכול לסתום את הטיפים בצנרת רגילה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. המשך מענה לפיטוספירה עם פתרונות מיקרוביאלית
<ol><li>הכנת גליצרול למלאי החיסונים הערה: טבלה 1 מפרטת את החיידקים שניתן להשתמש בהם בשלב זה. ניתן להשתמש כאן גם בבודד phyיוסה אחרים.<ol>
<li>בצפיפות החוצה מושבות בודדות מתוך פס טרי, אל שתיים/שלוש צלחות חדשות של אותו מדיה כדי לקבל הרבה מושבות.</li>
		<li>בואו לגדול הפסים עבור 2-5 ימים לאחר מכן לגרד מושבות מכל הצלחות לתוך שפופרת של 15 מ ל המכיל 15 מ ל של 15% גליצרול, ומערבולת לערבב ביסודיות.</li>
		<li>העברת סדרת מחלקים של 1 מ ל של מלאי מעורב היטב גליצרול לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ולאחסן מניות גליצרול ב-80 ° צ' עד השימוש. שמרו את הנותרים 14 מ ל של מלאי גליצרול ב-80 ° צ' כמויות גדולות יחסית של פתרון חיסונים נדרשים כאשר מנווים כרובים.</li>
		<li>שבוע לפני השימוש, להפשיר את הצינור 1.5 mL המכיל 1 מ ל של גליצרול מלאי (משלב 2.1.3) על קרח, לדלל, ואת הצלחת בכמה מדלל שונים (g., 10-4, 10-5, ו 10-6) כדי לקבוע את הריכוז (יחידת המושבה ויוצרים [cfu] לכל μ</li>
	</ol></li>
	<li>בקבוקי ספריי לחיטוי<ol>
<li>לפרק את הכתום סביב בקבוקי משאבת בוסטון (59 mL) ולהשרות את כל הרכיבים (משאבה, צינור, כובע ובקבוק) ב 30% תמיסת אקונומיקה עבור 30 דקות במיכל פלסטיק גדול עם מכסה הולם היטב.</li>
		<li>לאחר הטבילה, שופכים בזהירות את כל האקונומיקה מן המיכל על ידי הרמת רק פינה אחת של המכסה של המיכל.</li>
		<li>שטפו את הבקבוקים על ידי מילוי מיכל הפלסטיק במים מפוהים באופן אוטומטי (~ 1 L תלוי בגודל המיכל) ובזהירות לשפוך מים מפוהים, שוב על ידי הרמת המכסה בפינה אחת.</li>
		<li>לחטא את הקבינט אבטחה טיחות על ידי ריסוס עם 70% אתנול פתרון והפעלת אור UV עבור 30 דקות. הערה: המשיכו בעבודה זו בארון הביובטיל, כך שאין כל סיכון לזיהום מחיידקים של הבקבוקים כאשר הם יבשים.</li>
		<li>הסירו בקבוקים ממיכל הפלסטיק הגדול ומלאו כל בקבוק במים מפוהים באמצעות פיפטה. לכנס את המשאבות ולמקם אחד בכל בקבוק. משאבה את המים הדימיים דרך כל בקבוק (10 תרסיסים לכל בקבוק) כדי להסיר אקונומיקה מרכיב המשאבה של הבקבוק.</li>
		<li>חזור על השלב 2.2.5 כדי לוודא שכל האקונומיקה יוסר מבקבוקי הזכוכית.</li>
		<li>בדוק אם בקבוקים סטרילי על ידי הצבת מספר על כל בקבוק (דבק קלטת המעבדה בצד של הבקבוק כאשר הוא יבש לגמרי) ולאחר מכן להוסיף 10 מ ל של 1x PBS לכל הבקבוקים ומשאבה 3 תרסיסים על צלחת TS אגר. לאחר הריסוס, מודסת את הצלחות לשבוע אחד בטמפרטורת החדר. אם מושבות כלשהן לגדול על צלחת זה מראה כי הבקבוק המתאים לא סטרילי ולא צריך לשמש ניסויים.</li>
		<li>לפני שאתם מאחסנים את הבקבוקים הסטריליים, מסירים את כל ה-PBS ומאפשרים לבקבוקים להתייבש ביסודיות בארונית הביובטיחות. אחסן בקבוקים סטריליים במיכל פלסטיק סטרילי (בדרך כלל המיכל המשמש להלבנת הבקבוקים) עד השימוש.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת החיידקים וריסוס כרובים ללא חיידקים התראה: יש לבצע את כל השלבים בארונית ביולוגית, משום שהריסוס מאפשר את פתרונות החיידקים שיכולים לזהם את משטחי העבודה או להוות סיכון בריאותי אם יבוצע על ספסל מעבדה. הערה: כרובים יוצרים עלים אמיתיים לאחר 5 ימים, לכן רצוי להמתין שבוע לאחר שתילת הכרוב לפני שהוא מדבר עם פתרונות מיקרוביאלית. כאשר הצינורות חתומים, אין צורך להשקות את הכרובים. ניסויים מבוצעים ביותר תוך חודש של נטיעת, כמו צינורות קטנים להגביל את צמיחת הכרוב.<ol>
<li>הפשרת מניות גליצרול על קרח ולדלל ב-1x PBS אל הריכוז הרצוי החיסון (הריכוז נקבע על ידי התפחסותו וציפוי של 1 mL בשלב 2.1.4). הערה: ניתן להשתמש במגוון רמות חיסון שונות, אך מבודד מסוג phyיוסה יכול לצמוח מ-104 עד 108 מטרים של כרוב בתוך 10 ימים.</li>
		<li>הוסף 10 מ ל של מלאי גליצרול מדולל לבקבוק משאבת סטרילי ומשאבה 5 תרסיסים לתוך הגביע הגדול אוסף פסולת כדי להסיר את כל PBS שיורית מרכיב משאבת בקבוק.</li>
		<li>הסר את המכסה מצינור כרוב, להטות את הכרוב כלפי בקבוק ספריי, ולרסס כל כרוב עם 3 משאבות של פתרון החיסונים, אשר מספק ~ 600 μL של האינת.</li>
		<li>לאחר שהוא מדבר, הקציר מערכת משנה של הכרובים כדי להעריך את הריכוז של קלט בפועל. להסיר את הכרוב מצינור עם מלקחיים מעוקר. לחתוך את השורשים עם מספריים לחיתוך סטרילי ולאחר מכן בזהירות למקם את הכרוב בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי מראש 1.5 mL. להקליט את המשקל של כרוב לחישובים עתידיים אם הדפוס/g של כרוב נדרש עבור חישובים.</li>
		<li>הוסף 400 μL של הערוץ 1x כדי כל שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL המכילה כרוב ולהשתמש micrope, סטרילי כדי המגון לסדר את הכרוב לתוך ה-PBS 1x ידי שיוף זה 30x.</li>
		<li>לדלל כרוב המגון (אם נדרש) ולוחית את תערובת כרוב שורק. השתמש בטיפים מלאים ללטף את הכרוב, כי זה יהיה עבה ומלא של חתיכות רקמה צמח.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הכנת תמצית ירקות סטרילית
הערה: שיטה זו היא גרסה שונה של ייצור מדיה סטרילית כרוב18,19.
<ol><li>. לרכוש כרוב מסופרמרקט במעבדה, להסיר ולמחוק את העלים החיצוני של הכרוב. קוצצים את כל הכרוב הנותרים כדי להתאים לבלנדר המגון כרוב לעיסה קנס, כלומר, כרוב לא יקבל כל טוב יותר עם מיזוג נוסף. הערה: כל בלנדר אשר יכול לקצוץ כרוב לעיסת הומוגנית חלקה צריך להיות מתאים לשיטה זו.</li>
	<li>שוקלים את כרוב ממוזג לאכול ולהוסיף 2 מ ל של מים מזוקקים לכל גרם של כרוב. מסננים את הכרוב הממוזג באמצעות 2 שכבות של מסנני קפה סל (נייר לא מולבן).</li>
	<li>לוותר על הכרוב כרוב לתוך צינורות צנטריפוגה (גודל תלוי בצנטריפוגה). צנטריפוגה את הכרוב כרוב מסוננים ב 20,000 x g עבור 20 דקות עד חלקיקים גדולים ליישב את הפתרון. הערה: הכרחי לצנטריפוגה את הכרוב כרוב במשך תקופה ארוכה כאשר חלקיקי כרוב מסננים במהירות את מסנן הפילטר.</li>
	<li>באמצעות הצינורות הסרולוגיים, להסיר את הסופרנטאנט מן הפסולת כרוב כרוב מטפלת לא להפריע כרוב הפלטד. אם במטרה ליצור מחדש תנאי תסיסה בהם ריכוזי מלח סטנדרטיים משמשים, להוסיף 2% w/v בשלב זה (כלומר, לפני הסינון עיקור).</li>
	<li>מסנן לעקר את תמצית ירקות באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר (500 mL או 1 L) מחובר ואקום. מדבקות לצינורות סטריליים (או שפופרות צנטריפוגה מ-50 mL או 15 מנורות צנטריפוגה) ומקפיאים ב-80 ° צ' עד השימוש.</li>
</ol>4. חיסון לתמצית ירקות סטרילית
<ol><li>הפשרת SVE ולוותר 490 μL לתוך 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות. השתמש בצינורות מספיקים כדי לקבל לפחות חמש משכפל לכל טיפול לכל נקודת זמן, כאשר כל מדידה של נקודת זמן היא הרסנית.</li>
	<li>הפשרת מלאי גליצרול של מיקרוביאלית מבודד על הקרח לדלל עם 1x PBS לריכוז הרצוי. הריכוז של חיידקים חומצה לקטית יכול להיות נמוך כמו 5,000 CFU לכל mL של SVE. כדי להשיג ריכוז זה, לדלל את המניות 250 CFUs/μL מכיוון 10 μL ישמש עבור חיסונים של נפח כולל של 500 μL.</li>
	<li>מחסן SVE עם 10 μL של בידוד חיידקים מדולל. הפיפטה עולה ויורדת כמה פעמים כדי לערבב ביסודיות. מודטה בטמפרטורה הרצויה (14 ° צלזיוס לטמפרטורת הייצור של קמחי או 24 ° c לתסיסה חמה בכרוב כבוש).</li>
	<li>שיעור מדידה של צמיחה של בידוד חיידקים ב SVE על ידי קצירת שכפול צינורות ביום 1, יום 2, יום 4, יום 7 ויום 14. הערה: התסיסה ממשיכה במהירות בהתחלה ומאיטה לאורך זמן. לכן, לאחר שנקודות הזמן הראשוניות יותר מעניקה רזולוציה רבה יותר לדינמיקה של אופן ההכנסות של תסיסה.</li>
	<li>בכל פעם, לערבב את הטוב SVE מחוסן על ידי מלטף למעלה ולמטה כמה פעמים. סרילית לדלל את SVE מחוסן ב-1x PBS ו צלחת על צלחות אגר. מודאת צלחות אגר עבור 4-7 ימים לפני ספירת המושבות. הערה: אדם, רוגוסה, ו שארפ (גברת) אגר יש להשתמש כדי לספור את כל החיידקים חומצה לקטית, peptone שמרים דקסטרוז (YPD) יש להשתמש עבור שמרים, ו-TS אגר עבור החיידקים האחרים רוב מבודד מתוך phyיוסה הספירה.</li>
	<li>הקלט את ה-pH של דגימות בכל פעם באמצעות בדיקה מיקרו pH. הערה: שלב זה צריך להתבצע לאחר הציפוי כי הבדיקה pH יעביר תאים בין צינורות/טיפולים.</li>
</ol>

<ol><li>Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+seasonality+of+core+phyllosphere+microbiota+on+perennial+biofuel+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops.</a> Nature Communications. 10 (1), 4135(2019).</li>
<li>Pii, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+interactions+in+the+rhizosphere%3A+beneficial+influences+of+plant+growth-promoting+rhizobacteria+on+nutrient+acquisition+process.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+and+Fertility+of+Soils%22%5BJournal%5D)">Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review.</a> Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).</li>
<li>Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rhizosphere+microbiome+and+plant+health%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The rhizosphere microbiome and plant health.</a> Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+overlap+of+the+Arabidopsis+leaf+and+root+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.</a> Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).</li>
<li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li>
<li>Dinu, L. D., Bach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+viable+but+nonculturable+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+the+phyllosphere+of+lettuce%3A+a+food+safety+risk+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).</li>
<li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).</li>
<li>Bringel, F., Couée, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+roles+of+phyllosphere+microorganisms+at+the+interface+between+plant+functioning+and+atmospheric+trace+gas+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 486(2015).</li>
<li>Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+succession+and+stochastic+variation+in+the+assembly+of+Arabidopsis+thaliana+phyllosphere+communities%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities.</a> mBio. 5 (1), e00682(2014).</li>
<li>Carlström, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbiota+reveal+priority+effects+and+keystone+strains+in+the+Arabidopsis+phyllosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).</li>
<li>Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiology+of+the+phyllosphere%3A+a+playground+for+testing+ecological+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts.</a> Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).</li>
<li>Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+abundance+of+phyllosphere+bacteria+are+linked+to+insect+herbivory%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory.</a> Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).</li>
<li>Williams, T. R., Marco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phyllosphere+microbiota+composition+and+microbial+community+transplantation+on+lettuce+plants+grown+indoors%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors.</a> mBio. 5 (4), e01564(2014).</li>
<li>Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+vegetables+and+fruits+through+lactic+acid+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation.</a> Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Köberl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+microbiome+shift+during+fermentation+of+medicinal+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13461(2019).</li>
<li>Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance%2C+diversity+and+plant-specific+adaptations+of+plant-associated+lactic+acid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria.</a> Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).</li>
<li>Miller, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+limitation+constrains+the+abundance+of+lactic+acid+bacteria+in+the+Napa+cabbage+phyllosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269(2019).</li>
<li>Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rates+and+fermentation+patterns+of+lactic+acid+bacteria+associated+with+sauerkraut+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Milk+and+Food+Technology%22%5BJournal%5D)">Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation.</a> Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).</li>
<li>Yildiz, F., Westhoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+growth+of+lactic+acid+bacteria+in+cabbage+juice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice.</a> Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).</li>
<li>Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+analysis+of+sauerkraut+fermentation+reveals+a+stable+and+rapidly+established+community%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community.</a> Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77(2018).</li>
<li>Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+tracking+and+succession+of+kimchi+lactic+acid+bacteria+during+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation.</a> Journal of Food Science. 80 (8), M1871(2015).</li>
<li>Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiny+Microbes%2C+Big+Yields%3A+enhancing+food+crop+production+with+biological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions.</a> Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).</li>
<li>Knief, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaproteogenomic+analysis+of+microbial+communities+in+the+phyllosphere+and+rhizosphere+of+rice%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice.</a> The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).</li>
<li>Wuyts, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carrot+Juice+Fermentations+as+Man-Made+Microbial+Ecosystems+Dominated+by+Lactic+Acid+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134(2018).</li>
<li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li>
<li>Steinkraus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+fermentation+in+the+production+of+foods+from+vegetables%2C+cereals+and+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

נבט ללא חיידקים צמחים כרוב נאפה שימשו כדי ללמוד הגבלת הפיזור של חיידקים חומצה לקטית בתוך הכרוב נאפה phyיוסה17. נבט חינם נאפה כרובים יכול לשמש גם כדי לבדוק את הצמיחה בודדים או זוג ביותר ב phyיוסה (איור 1). שיטות להכנת תמצית ירקות סטרילית נבדקה עבור שלושה זנים שונים של כרוב: אדום, ירוק ו נאפה. כל אחד מאותם משמשים כאמצעי צמיחה אמינים; חיידקים מחוסן לצמוח בעקביות על פני אמצעי התקשורת השונים. זן אחד שיעורי גדילה ב SVE (איור 2) להראות כי המעבדה...

מגוון מיקרוביאלית של ה phyיוסה ממלא תפקיד חשוב בשמירה על בריאות הצמח והוא יכול גם להשפיע על היכולת של צמחים לעמוד בלחץ סביבתי1,2,3,4,5. בתורו, בריאות היבול משפיע ישירות על בטיחות המזון ואיכות6,7. צמחים לשחק תפקיד בתפקוד המערכת האקולוגית ואת microbiomes המשויכים שלהם הן משפיעות על היכולת של צמחים לבצע פעילויות אלה, כמו גם השפעה ישירה על הסביבה עצמה8. בעוד מדענים החלו לפענח את הפונקציה ואת ההרכב של phyיוסה, התהליכים האקולוגיים המשפיעים על האסיפה הקהילתית של הפילוספירה לא מובנים לגמרי9,10. מיקרובידום phyיוסה היא מערכת ניסיונית מעולה לחקר האקולוגיה של microbiome11. קהילות אלה פשוטות יחסית ורבים מחברי הקהילה יכולים לגדול בתקשורת מעבדה סטנדרטית10,12,13.
ירקות תוססים הם מערכת אחת שבה למבנה הקהילתי של הפיללספירה יש השלכות חשובות. הן בכרוב החמוץ ובקימחי, החיידקים המתרחשים באופן טבעי על עלי הירק (מינים של כרוב כרוב ) משמש כרשת החימוץ לתסיסה14,15. חיידקים חומצה לקטית (LAB) נחשבים חברים בכל מקום של microbiomes ירקות, אולם הם יכולים להיות בשפע נמוך ב phyיוסה כדור16. בחירה מוצקה חזקה במהלך התסיסה כוננים משמרת בקומפוזיציה של הקהילה מיקרוביאלית המאפשרת לחיידקים חומצת חלב להגדיל בשפע. כמו המעבדה לצמוח, הם מייצרים חומצה לקטית אשר יוצר את הסביבה חומצי של מוצרי ירקות תוססים17. הקשר בין phyיוסה ואת התסיסה מספק הזדמנות להשתמש בירקות כמודל כדי להבין כיצד microbiomes בנויים.
פיתחנו שיטות לגדל חיידקים בעלי כרוב נאפה ולאפשר להם לחסן אותם עם קהילות מחיידקים ספציפיים באמצעות בקבוקי ריסוס. זוהי שיטה זולה ואמינה של שווה לדבר על כרוב עם חיידקים בודדים או קהילות מעורבות. תמצית ירקות סטרילית (SVE) פותחה גם משלושה סוגים שונים של כרוב/זנים: כרוב אדום וירוק(כרוב)וכרוב נאפה (ב. ראפא). תוספת המלח לאלה משכפל את סביבת התסיסה ומאפשרת מחקרים ניסיוניים בהיקפים קטנים ובקצב גבוה יחסית של הרכבה מיקרוביזום תסיסה. ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי ללמוד הרכבה קהילתית מיקרוביאלית בתחום הפילולספירה, וכיצד ניתן לקשר בין הדינמיקה הקהילתית של מיקרוביאלית להצלחת התסיסה הצמחית.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>VWR</td><td>20170-650</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>פלקון</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>מגש מגש 7 כיוונים</td><td>סיגמא מג'נטה</td><td>T8654</td><td></td></tr><tr><td>ענבר עגול בוסטון בקבוק</td><td></td> זכוכית <td>GPS 712OZSPPK12BR</td><td>הוזמן Amazon.com מספקים שונים</td></tr><tr><td>סל קפה מסנני אם</td><td>אכפת</td><td></td> <td>לך(נייר לא מולבן) נרכש מ- Wholefoods</td></tr><tr><td>Bleach (ללא כספית)</td>צינורות זכוכית בורוסיליקט <td>50-010-45</td><td></td> <td>של אוסטין</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>47729-586</td><td></td></tr><tr><td>חימר מסולסל</td><td></td><td>MVP</td><td>הוזמן ב-Amazon.com מ-Root Naturally 6 Quart Bags. גודל חלקיקים כ-3-5 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>בלנדר Cuisinart Cuisinart</td><td>מעבד מזון Mini-Prep Plus, מספריים לדיסקציה 3 כוסות</td>7-389-A מוצרים חינוכיים אמריקאים הוזמנו ב-Amazon.com אתנול VWR 89125-172 מלקחיים Aven 18434 הוזמן ב-Amazon.com גליצרול פישר <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>KleenGuard M10</td><td>Kimberley-Clark</td><td>64240</td><td></td></tr><tr><td>מיכל פלסטיק גדול</td><td>Rubbermaid</td><td></td><td>הוזמן על</td></tr><tr><td>Amazon.com מדפי אור</td><td>Gardner's Supply</td><td>39-357</td><td>נורות פלורסנט T5 בספקטרום מלא</td></tr><tr><td>מג'נטה tm כובעים דו-כיווניים</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1934</td><td></td></tr><tr><td>אדם, רוגוסה ושארפ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>DF0881-17-5</td><td>מדיה זו מיועדת למרק ומוסיפים 15 גרם אגר להכנת צלחות</td></tr><tr><td>בדיקת מיקרו pH</td><td>Thermo Scientific</td><td>8220BNWP</td><td></td></tr><tr><td>Micropestle</td><td>Carolina</td><td>215828</td><td>נקרא גם Pellet Pestle</td></tr><tr><td>MS מרק תזונתי</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5519</td><td>Murashige and Skoog Basal Medium</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>זרעי כרוב נאפה</td><td>Johnny's Select Seeds</td><td>2814G</td><td>B. rapa var pekinensis (Bilko)</td></tr><tr><td>מנת פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>פישר</td><td>FB0875712</td><td>משמש להכנת צלחות אגר</td></tr><tr><td>מאגר פוספט מלוח</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-842-941</td><td></td></tr><tr><td>Teknova קופסת תרבית רקמות צמחיות</td><td>Sigma</td><td>מג'נטה GA-7</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>דיבל סטרילי</td><td>פוריטני</td><td>10805-018</td><td>חיטוי לפני השימוש לעיקור</td></tr><tr><td>עיקור 0.2 ומיקרו; m filter</td><td>Nalgene</td><td>974103</td><td></td></tr><tr><td>אגר סויה טריפטי</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0370-17-3</td><td>מדיה זו מיועדת למרק ומוסיפים 15 גרם אגר להכנת צלחות</td></tr><tr><td>קצות פיפטה רחבים</td><td>Rainin</td><td>17007102</td><td></td></tr><tr><td>שמרים, פפטון ודקסטרוז</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0428-17-5</td><td>מדיה זו מתאימה אך ניתן להכין מדיה גם באמצעות שמרים, פפטון ודקסטרוז, להוסיף 15 גרם אגר בעת הכנת צלחות</td></tr></tbody></table>

מערכת גנוטוביוטית לחקר מכלול המיקרוביאום בפילולספירה ובתסיסה הצמחית

A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation

The phyיוסה, החלק הקרקע מעל הצמח שיכול להיות הקולוניה על ידי חיידקים, היא מערכת מודל שימושי כדי לזהות תהליכים של האסיפה הקהילה חיידקים. פרוטוקול זה מתאר מערכת לחקר הדינמיקה הקהילתית מיקרוביאלית של צמחי כרוב נאפה. הוא מתאר כיצד לצמוח צמחים ללא חיידקים בצינורות הבדיקה עם חימר calcined המצע הציר התזונתי. החיסונים של צמחים ללא חיידקים עם תרבויות מסוימות של חיידקים מספקים הזדמנויות למדוד צמיחה חיידקים ודינמיקה קהילתית ב phyיוסה. באמצעות תמצית ירקות סטרילית המיוצרים ממשמרות כרובים בקהילות מיקרוביאלית המתרחשות במהלך החימוץ ניתן גם להעריך. מערכת זו פשוטה יחסית וזולה להקים במעבדה וניתן להשתמש בה לטיפול בשאלות אקולוגיות מרכזיות בהרכבה קהילתית מיקרוביאלית. הוא גם מספק הזדמנויות כדי להבין כיצד הרכב הקהילה phyיוסה יכול להשפיע על מגוון חיידקים ואיכות של fermentations ירקות. גישה זו לפיתוח קהילות הגנוטוביוטיקה כרוב יכול להיות מיושם על מינים אחרים הצמח פראי וחקלאי.

שיעורי צמיחה של כרובים נאפה שיטת סירוס הזרעים נבדקה עם מספר כרוב של נאפה (ב. ראפא בר פקינז; משלימה איור 1) ממספר ספקים שונים וכולם גדלו בעקביות עם קצבי צמיחה דומים. עם זאת, בדיקת השיטות עם מינים שונים של הכרוב (ב. ראפא: העליון הסגול לפת; B. oleracea: קהיר היברידי, היברידית ענק טרופי; ב. קאמסטרis: פאק צ'וי טוי choy היברידית; ב. יונמית: ענק אדום חרדל) נתן הצלחה מוגבלת (איור משלים 2). ...

שיטה של גידול כרוב הנבט ללא חיידקים פותחה המאפשרת לחוקרים להעריך כיצד מינים בודדים או קהילות מיקרוביאלית מינים אינטראקציה על משטחים עלה כרוב. תמצית ירקות סטרילית מוצגת גם אשר ניתן להשתמש כדי למדוד משמרות בקומפוזיציה קהילתית במהלך תסיסה הירקות.

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial ...

באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים להתייחס לשאלות מפתח לגבי האופן שבו מיקרואורגניזמים מתאספים ומקיימים אינטראקציה בפילוספירה. יש לו יתרון נוסף כי באמצעות תמצית ירקות סטריליים, אנחנו יכולים לקשר את המבנה של קהילות כדור phyllo לתפקוד שלהם במהלך תסיסה צמחית. טכניקות אלה מאפשרות למדענים לבדוק כיצד מיקרואורגניזמים מתקשרים בתחום פילו ולאחר מכן לעקוב אחר האופן שבו קהילות כדור פילו אלה יכולות להשפיע על התסיסה.כדי לחשוף את זרעי הכרוב, להתחיל על ידי הצבת 100 זרעים בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של 70% אתנול לצינור ומערבולת אותו במשך חמש דקות. ואז להשתמש פיפטה כדי להשליך את האתנול.מוסיפים מיליליטר אחד של 50% אקונומיקה ומערבולת הצינור במשך חמש דקות, ואז להשליך את האקונומיקה. לשטוף את הזרעים ארבע פעמים, על ידי הוספת מיליליטר אחד של מים deionized autoclaved מערבולת הצינור, ולאחר מכן להשליך את המים. לאחר שטיפה האחרונה, להשרות את הזרעים במים מעוקרים deionized במשך שעתיים עד שמונה שעות כדי לרכך את מעיל הזרע לפני השתיל.לשקול 10 גרם של חימר סידן נקי לתוך צינור זכוכית 15 על ידי 2.5 ס"מ. מוסיפים כתשעה מיליליטר של מרק MS מוכן לכל צינור כדי לכסות את החימר סידן. מכסים באופן רופף את צינורות הזכוכית עם 22 מילימטר דו-כיוון כובעי מבחנה.אוטוקלאב הצינורות ב 121 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. בעת הסרת הצינורות מן autoclave, לדחוף את הכובעים על צינורות הזכוכית כדי לאטום אותם, ולאחר מכן לקרר את הצינורות לטמפרטורת החדר לפני השימוש. כאשר הצינורות התקררו, השתמשו במטחים ארוכים במיוחד כדי למקם בעדינות זרע כרוב סטרילי אחד במרכז כל צינור.תחרה את הצינורות במגש שבעה כיוון והמקום את המגש תחת מתלים אור עם מחזור אור 16 שעות ב 24 מעלות צלזיוס. הזרעים יפתחו את העלה האמיתי הראשון שלהם לאחר חמישה ימים, שהוא עלה כלי הדם הראשון לאחר הקוטילדונים נוצרו. יש לו קצה מקומט והוא מכוסה טריקומבות.כדי לבדוק את הכרוב ללא חיידקים לסטריליות, אוחזים בעדינות בבסיס הצמח במטחים מעוקרים ושולף אותו החוצה. לפני הסרת הכרוב באופן מלא מהצינור, בזהירות לחתוך את השורשים עם מספריים ניתוח מעוקר. לאחר מכן, לדחוס את עלי הכרוב לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.הוסיפו 400 מיקרוליטרים של PBS לכל צינור מיקרו צנטריפוגה ולהשתמש עלה מיקרו סטרילי כדי הומוגניזציה של הכרוב. להב 100 מיקרוליטרים של הכרוב הומוגניים על צלחות אגר, ומוודאים להשתמש בקצה פיפטה פתח רחב. כדי להפוך את מניות גליצרול של זנים מאמץ, בעדינות פסים מושבות בודדות על שתיים או שלוש צלחות חדשות של אותה מדיה.משורים את המושבות במשך יומיים עד חמישה ימים, ואז מגרדים אותן מהצלחות לצינור חרוט 15 מיליליטר עם 15 מיליליטר של 15% גליצרול. מערבולת הצינור ביסודיות לערבב. Aliquot מיליליטר אחד של מלאי גליצרול מעורב לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה ולאחסן אותו 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש יחד עם הנותרים 14 מיליליטר של מלאי גליצרול.שבוע לפני השימוש, להפשיר את aliquot מיליליטר אחד על קרח ומ מניחים אותו בכמה דילולים שונים כדי לקבוע את הריכוז של מלאי החיסון. כאשר מוכן לחסן את הכרוב, להפשיר את מלאי גליצרול על קרח לדלל אותו לריכוז הרצוי. הוסיפו 10 מיליליטר מהמלאי המדולל לבקבוק המשאבה הסטרילית והזרימה חמישה תרסיסים לתוך מקור איסוף פסולת גדול.מוציאים את המכסה מצינור הכרוב ומטה את הכרוב לכיוון בקבוק הריסוס. לרסס כל כרוב עם שלוש משאבות של פתרון החיסון, ולאחר מכן לקצור תת קבוצה של כרוב כדי להעריך את ריכוז חיסון קלט בפועל. כדי לקצור את הכרוב, הסר אותו מהצינור עם מדפים מעוקרים.חותכים את השורשים עם מספריים ניתוח סטריליים בזהירות למקם אותו צינור מיקרו סטרילי שקל מראש צנטריפוגה. רשום את משקל הכרוב לחישובים עתידיים. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של PBS לכל צינור עם הכרוב וטוחנים אותו 30 פעמים עם עלה מיקרו, ואז צלחת הומוגנט כרוב באמצעות טיפים רחבים פיפט פתח.מוציאים ומשליכים את העלים החיצוניים ביותר של הכרוב וקוצצים את כל הכרוב שנותר כדי להתאים לבלנדר. מערבבים אותו לעיסה עדין ומשקללים את הכרוב הומוגני. מוסיפים שני מיליליטר של מים מזוקקים לגרם כרוב.לאחר מכן לסנן את תרחיף הכרוב דרך שתי שכבות של מסנני קפה סל. מחלקים את תרחיף לתוך צינורות צנטריפוגה צנטריפוגה אותו ב 20, 000 פעמים G במשך 20 דקות או עד חלקיקים גדולים להתיישב מחוץ לפתרון. הסר את supernatant, דואג לא להפריע פסולת כרוב גלולה.כדי לשחזר את תנאי התסיסה עם ריכוזי מלח סטנדרטיים, להוסיף 2% משקל לנפח נתרן כלורי לתמצית. Bilder תמצית הירקות עם מסנן מיקרומטר 0.2 מחובר ואקום, לחלק אותו לתוך צינורות סטריליים להקפיא אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. שיטת עיקור הזרעים נבדקה עם כמה כרוב נאפה וכולנו הפגינו שיעורי צמיחה דומים.עם זאת, מינים אחרים של brassica נתן הצלחה מוגבלת כי הצמחים היו גם שיעורי נביטה נמוכים לאחר עיקור או הגבעול התארך במהירות כדי להפוך צמח לא בריא. מבודדים מיקרוביאליים היו מחוסנים או כמו זן יחיד מבודד או בשילוב עם בידוד אחר. בסך הכל נבדקו 15 כרובים ללא נבטים לכל טיפול ונקצרו באופן מיידי, בארבעה ימים או ב-10 ימים לאחר החיסון.המבודדים הדגימו צמיחה מהירה בפילוספירה של כרוב נאפה. שני שמרים ושלושה חיידקים היו מחוסנים לשלושה סוגים שונים של תמצית ירקות סטריליים או SVE עשוי כרוב אדום, ירוק נאפה. הצמיחה של החיסון נרשמה במשך 14 ימים על ידי ציפוי נקודת חמישה microliters של כל טיפול על צלחות אגר MRS או YPD.מדידות של pH לאורך כל התסיסה הראו כי חיידקי חומצה לקטית היו מסוגלים חומציות SVE לרמות מתחת pH ארבע, המציין תסיסה כי הוא בטוח לצריכה. שיטות אלה יישמו במיוחד על מיקרוביום הכרוב אבל יכול להיות שימושי במערכות צמחיות אחרות. זה יכול להיות מאתגר לשמור על המערכת סטרילית, פרוטוקולי המתאר שלנו מפורטים, אבל מצאנו שכל צעד חשוב.

a-gnotobiotic-system-for-studying-microbiome-assembly-phyllosphere

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

מקור: Nathoo, N., et al. מערכת גידול משותף הידרופונית לניתוח סימולטני ושיטתי של אינטראקציות ואיתות מולקולריות של צמח/חיידק. J. Vis. Exp. (2017).סרטון זה מדגים מערכת גידול משותף הידרופונית לחקר אינטראקציות בין צמחים לחיידקים בתנאים סטריליים. שתילי צמחים מועברים למצע גידול סטרילי וחומצי, מודגרים ונבדקים לאיתור זיהום לפני החיסון באגרובקטריום. החיידקים הפעילים נצמדים לשורשי הצמח, מעבירים T-DNA לתאי הצמח ומקדמים שינויים מולקולריים המשפרים את ההתיישבות של החיידקים.

מערכת גידול משותף לחקר התגובות המולקולריות של מארחי צמחים וחיידקים המקיימים אינטראקציה

מערכת cocultivation הידרופוני שתואר תומך צמחים שלם עם מסכי רשת מתכת cocultivates אותם עם חיידקים. רקמות הצמח, חיידקים, ומולקולות מופרדים אז ניתן לקצור בנפרד עבור ניתוחים במורד הזרם, בו זמנית מאפשר תגובות מולקולריות של שני המארחים צמח אינטראקציה חיידקים או microbiomes להיחקר.

הידרופוני Co- טיפוח מערכת לניתוח סימולטני ושיטתי של הצמח / מיקרובי אינטראקציות מולקולרית איתות

מאמר זה מתאר מפורטת פרוטוקולים עבור ייצור המערכת האקולוגית של התקנים (EcoFABs) המאפשרים את הלימודים של הצמחים והאינטראקציות צמח-חיידק בתנאי מעבדה מבוקרת מאוד.

המערכת האקולוגית פרוטוקולים פבריקציה נוספת (EcoFAB) להקמת מערכות אקולוגיות מעבדה שנועדה ללמוד אינטראקציות צמח-חיידק

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשיג אמפליקון רצף נתונים של קרקע, rhizosphere, microbiomes endosphere השורש. מידע זה יכול לשמש כדי לחקור את הרכב ואת הרב-גוניות של צמח-הקשורים קהילות מיקרוביאלי, מתאים לשימוש עם מגוון רחב של מיני צמחים.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

חפירה של שורשי צמחים מן השדה, כמו גם עיבוד של דגימות לתוך endosphere, rhizosphere ואדמה מתוארים בפירוט, כולל הפקת דנ א ושיטות ניתוח הנתונים. נייר זה נועד לאפשר מעבדות אחרות שימוש בטכניקות אלה לצורך המחקר של קרקע, endosphere, rhizosphere microbiomes.

בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי

כאן אנו מתארים ידרופוני צמח שיטת הצמיחה כדי נוכחות המינים ככמת ולהמחיש את התפלגות מרחבית של חיידקים במהלך הקולוניזציה הראשונית של שורשי הצמח ולאחר העברתם לסביבות צמיחה שונות.

ניטור מושבת חיידקי ותחזוקה על השורשים האראדותזיס thaliana במערכת ידרופוני צף

מיקרוקוסמוסים של קומפוסט מביאים את המגוון המיקרוביאלי שנמצא בטבע למעבדה כדי להקל על מחקר המיקרוביום ב-Caenorhabditis elegans. מובאים כאן פרוטוקולים להקמת ניסויי מיקרוקוסמוס, כאשר הניסויים מדגימים את היכולת לווסת את המגוון המיקרוביאלי הסביבתי כדי לחקור את הקשרים בין המגוון המיקרוביאלי הסביבתי לבין הרכב המיקרוביום של מעי התולעים.

מיקרוקוסמוסים של קומפוסט כסביבות טבעיות מגוונות מיקרוביאלית לחקר המיקרוביום ב-Caenorhabditis elegans

אנו מציגים פרוטוקול למערכת ניסויית סמי-הידרופונית מבוססת זכוכית התומכת בגידול של מגוון צמחים מובחנים פילוגנטית עם או בלי מיקרואורגניזמים. המערכת תואמת למצעי גידול שונים ומאפשרת דגימת הפרשה שורשית לא הרסנית לניתוח במורד הזרם.

מערכת צנצנות זכוכית רב-תכליתית ליצירת פרופיל הפרשה סמי-הידרופוני של שורשים

אנו מציעים פרוטוקול מיקרוסקופ אלקטרונים סורק אופטימלי להדמיית דגימות הטרוגניות ועדינות ביותר המכילות ביומסה צמחית ופטרייתית, יחד עם מיקרוביוטה וביופילם. פרוטוקול זה מאפשר לתאר את הממדים המרחביים של ארגון המיקרוביוטה.

מיקרוביוטה של גני נמלים אטיין: הדמיה של נוף מיקרוביאלי על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

פרוטוקול זה מפרט את הרכבת מערכי מיני-ביו-ריאקטור שישמשו לתרבית זרימה רציפה של קהילות צואה מורכבות בתנאים אנאירוביים. אנו דנים גם בשיטות ההרכבה, החיסון והדגימה של הכורים להמשך ניתוח.

מכלול ביו-ריאקטור לתרבית מתמשכת של קהילות צואה מורכבות

חקור אינטראקציות מיקרוביאליות בפילוספירה של כרוב נאפה נטול חיידקים. שיטה זו מאפשרת לחבר בין מבנה הקהילה המיקרוביאלית לתפקודה בתסיסה ירקות.

מערכת גנוטוביוטית לחקר מכלול המיקרוביאום בפילולספירה ובתסיסה הצמחית

גלה סרטונים נוספים