החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

עריכת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים היא מאתגרת. פרוטוקול זה מספק את הליך הפירוט לעריכת גנום בתאים אלה באמצעות מארז Cas-90 מזווג בשילוב עם וקטור המטרה. זה אמין וקל לעקוב אחריו.

היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שמדובר בעריכה גנומית חלקה. הבחירה הדו-שלבית עוזרת להגדיל את התאים הממוקדים והפכה את סינון הגנוטיפ ליעיל יותר. שמור על תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על משטחים מקודדים למינין רקומביננטי 21 במדיום mTeSR1.

התאים צריכים להגיע למפגש של 70 עד 85%, 72 שעות לאחר יחס פיצול של אחד לשלוש. ביום הטרנספקציה מצפים מספיק בארות של צלחת 24 בארות עם 300 מיקרוליטר מתמיסת הלמינין 521, ודוגרים את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. לאחר הדגירה הסר בעדינות את תמיסת הציפוי והוסף מיד 300 מיקרוליטר של מדיום mTeSR1 טרי, בתוספת 10 מעכבי ROCK מיקרומולריים לכל באר.

ואז החזירו את הצלחת לחממה. הוציאו את מלאי תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים מהאינקובטור. הסר את המדיום המושקע ושטוף את התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של DPBS סטרילי.

לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה עדין של תאים לכל באר ודגר אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שש עד שמונה דקות כדי לנתק את התאים. הקש בעדינות על הצלחת כדי לוודא שהתאים יכולים להתנתק בקלות. לאחר מכן השתמש בקצה P1000 כדי להרים את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

הוסף שני מיליליטר של מדיום mTeSR1 עם מעכב ROCK כדי לסיים את הדיסוציאציה. מערבבים היטב את המתלה ומעבירים אותו לצינור של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 200 גרם למשך שלוש דקות.

לאחר מכן הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים בשני מיליליטר של מדיום mTeSR1 עם מעכב ROCK. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר וטריפן כחול. העבירו 800,000 עד מיליון תאים לצינור של 1.5 מיליליטר עבור כל תגובת נוקלאופקציה וצנטריפוגה אותם ב-200 גרם למשך שלוש דקות.

ואז שאפו בזהירות את הסופרנטנט. מערבבים שלושה מיקרוגרם של פלסמידים לביטוי RNA מדריך יחיד Cas-9n וחמישה מיקרוגרם של פלסמיד וקטורי מכוון ב-100 מיקרוליטר של תמיסת נוקלאופקציה מעורבת מערכת נוקלאופקציה של תאי גזע אנושיים. הכן גם תערובת פלסמיד בקרת GFP.

השעו מחדש את התאים עם תערובת ה-DNA והעבירו אותם לקוביית אלקטרופורציה, והקפידו להימנע מבועות אוויר. אלקטרופורציה של התאים עם מכשיר הגרעין באמצעות המצב האופטימלי לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. הוסף מיד 500 מיקרוליטר של מדיום mTeSR1 טרי וחם בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומולר לתאים האלקטרופורטיים.

לאחר מכן העבירו את התערובת לשתי בארות של צלחת 24 הבארות שהוכנה בעבר. הכניסו את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס המסופק עם 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר לתאים להתאושש. החלף את מדיום תחזוקת התא לאחר 12 עד 16 שעות, ומשוך את מעכב ה-ROCK אם התאים יוצרים מגע בין תא לתא.

לאחר 24 עד 48 שעות, בדוק את יעילות הנוקלאופקציה על ידי בחינת ביטוי GFP בתאי הבקרה. התחל לבחור תאים על ידי השלמת מדיום mTeSR1 במיקרוגרם אחד למיליליטר פורומיצין, 48 שעות לאחר הנוקלאופקציה. לאחר 72 שעות יש להשלים את המדיום עם 0.5 מיקרוגרם למיליליטר פורומיצין.

אם מפגש התאים נמוך מ-30%, השלם גם את המדיום עם מעכב ROCK 10 מיקרו-מולרי. ארבעה עד שישה ימים לאחר מעבר הגרעין התאים העמידים לפורומיצין ל-10 עד 15 96 צלחות באר בריכוז של 0.8 תאים לבאר. הקפידו להשלים את המדיום עם מעכב ROCK ופורומיצין.

שמור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-10% פחמן דו חמצני למשך 10 עד 12 ימים ליצירת מושבות שמקורן בתאים בודדים. מילוי המדיום שבעה ימים לאחר הזריעה. סמנו בארות המכילות מושבה אחת והחליפו את המדיום במדיום mTeSR1 טרי, המכיל 0.5 מיקרוגרם למיליליטר פורומיצין, אך ללא מעכב ROCK.

גדל את התאים במשך יומיים נוספים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן החלף מדיום לבארות המכילות מושבות לא מובחנות. מגרדים בעדינות את המושבות ומעבירים את תרחיף התאים ממושבה אחת לשתי בארות חדשות על צלחות נפרדות של 96 בארות.

אחד לגנוטיפ, ואחד לתחזוקה. ברגע שהמפגש של תאי הגנוטיפ מגיע ל-50% ומעלה, זרוק את המדיום המושקע ושטוף את התאים פעם אחת עם DPBS. ליז את התאים עם Bradley Lysis Buffer ולבודד DNA גנומי מכל באר.

לאחר ביצוע שלושה פריימר צומת PCR וריצוף המוצרים, שמור את המושבות עם הגנוטיפ הנכון והשליך את השאר. הרחב את המושבות הנכונות תחת ברירה רציפה של פורומיצין, והקפיא אותן במעבר המוקדם ביותר האפשרי. פרוטוקול זה שימש להחדרת שתי מוטציות נקודתיות ל-Exon8 של הגן אלפא גורם גרעיני הפטוציטים.

נעשה שימוש בשיטת PCR מבוססת שלושה פריימרים כדי לסנן תאים ממוקדים כהלכה, וריצוף סנגר בוצע כדי לאשר את תוצאות ה-PCR. לאחר הסרת קלטת הבחירה, האזור ששונה רוצף שוב כדי לאשר את ההחדרה הנכונה של מוטציות נקודתיות רצויות. נבחרו מושבות עם הגנוטיפ הנכון והתאים אופיינו לפני ניתוח נוסף.

התאים הערוכים הם בעלי אותה מורפולוגיה כמו תאי ההורה ומבטאים סמנים מייצגים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים כולל גורמי שעתוק Nanog ו-Oct4, כמו גם סמני פני התא, SSEA-4 ו-TRA-160. כאשר מנסים הליך זה חשוב לזכור לבדוק את מפגש התאים לאחר בחירת פורומיצין במהלך 24 השעות הראשונות. חיוני להשלים את החציון עם מעכב ROCK.

אם מפגש התאים נמוך מ-30%כדי לשמור על התאים פועלים. לאחר הקמת קווי תאי הגזע הפלוריפוטנטיים הערוכים בגנום, ניתן להשתמש בהם לחקר תפקוד גנים או התמיינות מכוונת. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לחקור שאלות שונות, כגון התפקוד הספציפי של גנים או תיקון גנים ממוקד למחלות גנטיות.