ייצור של מגלי גל במצב אפס למיקרוסקופיה של מולקולה בודדת בריכוז גבוה
12 במאי 2020
מתואר כאן שיטת ליטוגרפיה ננוספירה לייצור מקביל של מגלי גל במצב אפס, שהם מערכים של ננו-פטרטורים במיקרוסקופיה זכוכית מצופה מתכת עבור הדמיית מולקולה בודדת בריכוזים ננו-למיקרומולרים של פלואורופורים. השיטה מנצלת את ההרכבה העצמית של הגביש הקולואידי כדי ליצור תבנית מגיד גל.
פרוטוקול הליתוגרפיה הננו-ספירה המוצג כאן לייצור מוליכי גל במצב אפס הוא שיטה נגישה בעלות נמוכה שאינה דורשת כלי ייצור או מתקנים מיוחדים. שיטה זו תהיה שימושית לביופיזיקה של מולקולה בודדת ותאפשר לחוקרים נוספים לבצע ניסויים במולקולה בודדת בריכוזים רלוונטיים מבחינה ביולוגית של ריאגנטים פלואורסצנטיים. כדי ליצור משטח נקי לתצהיר אידוי של חלקיקים קולואידים, הנח כיסויי זכוכית בורוסיליקט אופטיים בתוספות המחורצות של צנצנת צביעה מזכוכית קופלין.
מלאו את צנצנת הצביעה במספיק אצטון כדי לכסות את הכיסויים ולכסות את הצנצנת. סוניקציה של הצנצנת למשך 10 דקות בחום של 40 מעלות צלזיוס. שופכים את האצטון ושוטפים את הכיסויים שלוש פעמים במים מזוקקים.
לאחר חזרה על הסוניקציה והאצטון, מלאו את הצנצנת במספיק אשלגן הידרוקסיד כדי לכסות את הכיסויים. סוניקציה של הצנצנת שוב, מכוסה, למשך 20 דקות בחום של 40 מעלות צלזיוס. שטפו את הכיסויים במים מזוקקים שש פעמים, ולאחר מכן הפכו אותם לסוניקציה באתנול למשך 10 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
לאחר שטיפת הכיסויים שלוש פעמים במים מזוקקים, הרם בעדינות כל כיסוי בקצה בעזרת מלקחיים. יבש כל כיסוי בגז חנקן והניח כל כיסוי נקי ויבש וצלחת פטרי משלה. צנטריפוגה 50 מיקרוליטר של מיקרון אחד חרוזי פוליסטירן לא מתפקדים.
השליכו את הסופרנטנט והשאירו כמה שפחות מים. השעו מחדש את החרוזים ב -50 מיקרוליטר ממס, ואז ערבבו היטב על ידי פיפטינג. כדי להקים תא לחות לתצהיר, סדרו שש צלחות פטרי ברציפות.
הניחו כיסוי אחד בכל צלחת פטרי והשאירו את המכסים מעט פתוחים כשהכיסויים ממוקמים כך שייחשפו לסביבה. מרכז מד לחות ומאוורר חשמלי קטן מאחורי צלחות הפטרי, ואז רשום את הלחות היחסית במעבדה. מלאו של 200 מיליליטר ב-150 עד 200 מיליליטר מים בטמפרטורה של כ-75 מעלות צלזיוס והניחו את הכוס מאחורי המאוורר.
הפעל את המאוורר ולאחר מכן כסה את כלי הפטרי, המאוורר, הכוס ומד הלחות במיכל אחסון פלסטיק שקוף הפוך. כאשר הלחות היחסית מגיעה ל-70 עד 75%, הרם מעט את מיכל האחסון מפלסטיק וסגור במהירות את מכסי כלי הפטרי כדי למנוע הרטבת יתר של הכיסויים. כאשר הלחות היחסית בתא מגיעה ל 85% פיפטה חמישה מיקרוליטר של מתלה החרוזים על מרכז כל כיסוי.
מכסים כל צלחת פטרי מיד לאחר התצהיר ושומרים על הכל מכוסה במיכל האחסון בין התצהירים. יש להשלים את תצהירי החרוזים במהירות האפשרית כדי למזער את אובדן הלחות. אם התצהירים יבשים או רטובים מדי, לחות החדר היא המשתנה החשוב ביותר לאופטימיזציה.
לאחר השלמת כל ששת התצהירים, רשום את הלחות היחסית בתא ותן לטיפות החרוזים להתפשט ולהתייבש במשך חמש דקות. כדי לספק משטח טמפרטורה אחיד לחישול חרוזי הפוליסטירן, הניחו צלחת אלומיניום שטוחה וטחונה על גבי פלטה קרמית רגילה והגדירו את טמפרטורת הפלטה החמה ל-107 מעלות צלזיוס, טמפרטורת מעבר הזכוכית של פוליסטירן. הניחו כיסוי המכיל את תבנית החרוזים על צלחת האלומיניום החמה.
לאחר חישול למשך 20 שניות, הסר את הכיסוי מלוח האלומיניום והנח אותו מיד על משטח אלומיניום בטמפרטורת החדר להתקררות. באמצעות תצהיר אידוי תרמי, הפקידו 300 ננומטר נחושת בשני אנגסטרומים לשנייה על גבי תלושי כיסוי המכילים את תבניות החרוזים. זה ייצור עמודים במרווחים בין החרוזים.
כדי להסיר את עודפי הנחושת מהחרוזים, לחץ בעדינות פיסת סרט על פני השטח ואז קלף לאט את הסרט. ממיסים את חרוזי הפוליסטירן על ידי הנחת הכיסויים בטולון והשארתם למשך הלילה. יש לטפל בזהירות בהחלקות הכיסוי, לשטוף אותן פעם אחת בכלורופורם ופעמיים באתנול.
יבש את התבניות בחנקן. הניחו אותם במנקה פלזמה חמצן למשך 30 דקות כדי להסיר שאריות פולימר ומזהמים. באמצעות שקיעת אידוי תרמית, הפקידו שלושה ננומטרים של שכבת הידבקות טיטניום באנגסטרום אחד לשנייה, ולאחר מכן הניחו 100 עד 150 ננומטר אלומיניום בארבעה אנגסטרומים לשנייה סביב עמודי הנחושת.
ודא שהדגימות אינן מסתובבות במהלך התצהיר כפי שנעשה אוטומטית בחלק מיחידות התצהיר. כדי להמיס את עמודי הנחושת, יש להשרות את הכיסויים בתחריט נחושת למשך שעתיים. לאחר שטיפת הכיסויים במים מזוקקים, יבשו אותם בחנקן, ולאחר מכן שטפו בעדינות את המשטח בנייר עדשות כדי לחשוף את כל העמודים שעדיין מכוסים בחיפוי.
משרים את הכיסויים בתחריט נחושת למשך שעתיים נוספות, ואז שוטפים אותם שוב במים מזוקקים ומייבשים אותם בחנקן. לאחר פסיבציה של פני השטח, ניתן לשייך כיסוי מוליך גל במצב אפס עם שקופיות קוורץ באמצעות סרט דביק דו צדדי ליצירת תאי זרימה מיקרופלואידיים להדמיית מולקולה בודדת. הצלחת ההרכבה העצמית של התבנית הקולואידית תלויה באופן קריטי בלחות היחסית.
בתבנית מעוצבת היטב, אזור החרוזים הוא עגול עם גבולות המוגדרים על ידי טבעת רב-שכבתית אטומה. בתבניות מעוצבות היטב, רוב התבניות צריכות להכיל חרוזים ארוזים בצורת משושה. יהיו כמה פגמים בין הגרגירים עקב חסימה במהלך שקיעת האידוי.
לאחר שקיעת נחושת ופירוק חרוזי הפוליסטירן, עמודי הנחושת צריכים להיות בקוטר של פחות מ-150 ננומטר. עבור עומק שקיעת נחושת של 300 ננומטר, העמודים הם בגובה של כ-250 ננומטר. לאחר שקיעת חיפוי אלומיניום ופירוק עמודי הנחושת, מוליכי הגל צריכים להיות גלויים במיקרוסקופ כוח אטומי ולהיות מרווחים זה מזה כ-550 ננומטר
.חישול תבניות הפוליסטירן למשך 20 שניות ייצר מוליכי גל מאלומיניום בקוטר של 118 ננומטר, קטנים מספיק כדי לנתק את התפשטות האור הנראה. שדה טיפוסי של ZMWs להדמיה מכיל 3,000 מוליכי גל בשדה ראייה של 40 על 80 מיקרון. מולקולה בודדת FRET בוצעה כדי לבדוק את הפונקציונליות של ZMW.
עקבות FRET של מולקולה בודדת היו ניתנות לזיהוי בכל הריכוזים של פלואורפור Cy5 הסביבה שנבדקו. לשם השוואה, מולקולות בודדות יהיו ניתנות לזיהוי רק בתאורת TERF עם ריכוזים פיקומולריים עד ננו-מולאריים נמוכים. לאחר ייצור מוליך גל במצב אפס, ניתן לבצע פסיבציה של המכשירים עם פולימרים כדי להפחית אינטראקציות לא ספציפיות במהלך הדמיית מולקולה בודדת.
ניתן גם לחרוט מעט את תחתיות הזכוכית של מוליכי הגל במצב אפס כדי לשפר את פליטת המולקולה הבודדת. בסך הכל, שיטת ייצור מוליכי גל חדשה זו תאפשר לחוקרים לחקור ביתר קלות תהליכים ביוכימיים דינמיים, כגון שעתוק או תרגום בריכוזים ובקצבים קרובים יותר לאלה שבתא.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטת ליתוגרפיה של ננו-ספירות ליצירה מקבילית של מדריכי גל בעלי מצב אפס (zero mode waveguides), המאפשרים דימוי של מולקולה בודדת בריכוזים נמוכים של פלואורופורים. השיטה משתמשת בהרכבה עצמית של גביש קולואידי כדי ליצור תבנית של מדריך גל על לית המכסה מזכוכית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביופיזיקה
- ננוטכנולוגיה
- דימוי של מולקולה בודדת
רקע
- מדריכי גלי אפס (Zero mode waveguides) חיוניים לחקר מולקולות בודדות.
- שיטות ייצור מסורתיות עלולות להיות יקרות ולדרוש כלים ייעודיים.
- שיטה זו שואפת לפשט את התהליך.
- הרכבה עצמית קולואידית היא טכניקה מבטיחה ליצירת ננו-מבנים.
מטרת המחקר
- להצגת שיטה נגישה לייצור של zero mode waveguides.
- לאפשר לחוקרים רבים יותר לבצע ניסויי מולקולה בודדת.
- להקל על ביצוע מחקרים בריכוזים רלוונטיים ביולוגית של ריאגנטים פלואורסצנטיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בכיסויי זכוכית בורוסיליקט אופטיים.
- סוניקציה באצטון לניקוי פני השטח.
- שקיעה באידוי של חלקיקים קולואידיים.
- יצירת תבנית מוליך גל לצורך הדמיה.
תוצאות עיקריות
- השיטה היא בעלת עלות נמוכה ואינה דורשת כלים ייעודיים.
- היא מייצרת מוליכי גל יעילים עבור דימות של מולקולה בודדת.
- חוקרים יכולים להשיג דימות בריכוזים של nano- עד micromolar.
- הפרוטוקול הוא פשוט וניתן לשחזור.
מסקנות
- שיטת ליתוגרפיית הננו-ספירות הזו הופכת את הגישה לטכניקות של דימוי מולקולה בודדת לנגישה יותר.
- היא פותחת נתיבים חדשים למחקר בביופיזיקה של מולקולה בודדת.
- מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש בשיטה זו עבור יישומים שונים בביולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת דימוי של מולקולה בודדת בריכוזי פלואורופור של מיקרו-מולר, ובכך היא פותרת מגבלה מרכזית במבחנים ביוכימיים שבהם פלואורסצנציית רקע מגבילה את הריכוזים השמישים לטווחים של פיקו- עד ננו-מולר. על ידי הבליטה של חקר תהליכים מולקולריים בריכוזים ובקצבים הרלוונטיים לתא, היא תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים באופן הרלוונטי יותר פיזיולוגית בשלבי הגילוי המוקדמים. הנגישות של גישת ייצור נמוכה-עלות זו מרחיבה את התועלת של zero mode waveguides מעבר למתקני ליבה מתמחים למעבדות מו"פ רחבות יותר בתחום הביופארמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות והבהרה של מסלולים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לתצפית על מולקולה בודדת בריכוזים המשקפים רמות פיזיולוגיות של ליגנדים.
- ערך תפעולי: מפחית את ההסתמכות על ציוד ננו-פבריקציה יקר, ובכך הופך את האנזימולוגיה של מולקולה בודדת לנגישה עבור צוותי מחקר רבים יותר.
- ביטחון תחזיתי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של אינטראקציות של מולקולה בודדת בתנאים קרובים למצב הטבעי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק פלטפורמה להכנת מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף, המאפשרות הערכה מהימנה של תרכובות בריכוזי פלואורופור גבוהים ורלוונטיים יותר.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות של הבדיקה באמצעות ייצור מקבילי של אלפי מולי גלים במצב אפס (zero mode waveguides) תוך שימוש בציוד מעבדה נפוץ.
- יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה ובניתבתיות עבור תהליכי סינון המשכיים על ידי יצירת מערכי מולי גלים אחידים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקלה על חקר תהליכים ביוכימיים דינמיים כגון שעתוק או תרגום בריכוזים ובקצבים הקרובים יותר לאלו הקיימים בתא, ובכך משפרת את הרלוונטיות למודלים של מחלות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשרת תצפית על אותות FRET של מולקולה בודדת בריכוזים מיקרו-מולריים, שאינם ניתנים להשגה באמצעות הארה מסורתית של השתקפות פנימית כוללת (TERF).
- קידום מותאם סיכון: תומכת בקבלת החלטות מבוססות נתונים על ידי אספקת קריאות כמותיות של מולקולה בודדת המבהירות את המכניזם ומפחיתות עמימות באופטימיזציה של מובילים (leads).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית ועד לזיהוי מובילים (leads), ומאפשרת אפיון ביופיזיקלי המנחה את בחירת התרכובות ואת אופטימיזצייתן לפני הערכה פרה-קלינית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על התנהגות של מולקולה בודדת בסביבות מורכבות.
- סריקה: מספקת ננו-מבנים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה, עם פלטים כמותיים המאפשרים השוואה של קישור ליגנדים או פעילות אנזימטית בין תנאים שונים.
- אנליטיקה: מספקת קריאות פלואורסצנציה של מולקולה בודדת ו-FRET המציעות תובנות קינטיות ומכניסטיות ברזולוציה גבוהה, מעבר לממוצעים של אוכלוסייה (ensemble).
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי הגילוי לרלוונטיות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לביצוע מחקרים בריכוזים קרובים לפיזיולוגיים ובתנאי דחיסות מולקולרית (molecular crowding).
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת ייצור בר-שימוש שניתן לחלוק בין מחלקות, ובכך מפחיתה את התלות בשירותי ננו-פבריקציה חיצוניים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות ויזואליזציה ישירה של מולקולה בודדת.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והתפוקה באמצעות ייצור מקבילי תוך שימוש בציוד נגיש כמו מאיידים תרמיים ופלטות חימום.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון ומאפשר קבלת החלטות נכונה יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי הפקת נתונים ביופיזיקליים מהימנים בשלב מוקדם יותר של תהליך הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון על ידי מתן בהירות מכניסטית המפחיתה נשירה בשלבים מאוחרים עקב התנהגות ביולוגית בלתי צפויה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהרכבה עצמית קולואידית, אידוי תרמי ופרוטוקולים לניקוי משטחים.
- תלוי בגישה למאדה תרמי, פלטה מחממת, סוניקטור וציוד מעבדה בסיסי לכימיה לצורך שיקוע מתכות ותעייה (etching).
- מחייב סטנדרטיזציה של שיקוע חרוזים תחת בקרה של לחות כדי להבטיח יצירה עקבית של תבנית מוליך גלים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על חומרי מצע שונים או מתכות שונות למוליכי גלים (למשל, אלומיניום לעומת זהב).
- כולל מגבלות מעשיות כגון רגישות ללחות יחסית במהלך ההרכבה העצמית של החרוזים והצורך בטיפול זהיר כדי למנוע פגמים בתבנית.
