בדיקת אלקטרוכמילומינסנציה בתפוקה גבוהה של 7 פלקס לבדיקה בו-זמנית של סוכרת מסוג 1 ומחלות אוטואימוניות מרובות
29 במאי 2020
אנו מדגמים בדיקת ECL כפולה פשוטה המשלבת 7 מבחני נוגדנים עצמיים יחד. הבדיקה מסוגלת לבצע סינון ל-T1D ולמחלות אוטואימוניות רבות אחרות, בו זמנית, כולל צליאק, מחלת בלוטת התריס אוטואימונית ותסמונת פוליגלנדולרית אוטואימונית 1.
בדיקת אלקטרוכימילומינסנציה יכולה לסנן בו זמנית סוכרת מסוג 1 ומחלות אוטואימוניות רלוונטיות אחרות, כולל מחלת קריו אוטואימונית, מחלת צליאק ותסמונת פוליגלנדולרית אוטואימונית-1. בדיקת ה-ECR המורכבת בהרבה משלבת עד 10 בדיקות נוגדנים מרובות בבאר אחת, וכתוצאה מכך תפוקה גבוהה, פחות ספריות ובדיקה פחות יקרה הדורשת נפח פחות רחב. מי שמדגים את ההליך יהיה שיאופאן ג'יה, פוסט מהמעבדה שלי.
כדי להכין תמיסת אנטיגן מעורבת בשילוב מקשר, בחר תחילה את הריכוז האופטימלי עבור כל אנטיגן, על סמך בדיקת לוח השחמט, ודלל את האנטיגן המסומן בביוטין ורותניום לריכוז העבודה הרציונלי. כדי לקשור קישורים שונים לכל אחד מהאנטיגנים הביוטיניים הייחודיים, עבור בדיקה אחת של 96 משחקים, ערבב 240 מיקרוליטר של מקשר מצומד STREPTAVIDIN מתאים עם 4 מיקרוליטר של חלבונים ביוטיניליים מעניינים. לאחר מכן מוסיפים 156 מיקרוליטר של 1% BSA לצינור ומדגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
בתום הדגירה מוסיפים 160 מיקרוליטר תמיסת עצירה לכל צינור ודוגרים את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות נוספות. בתום הדגירה, הסר 400 מיקרוליטר של אנטיגן מצומד מקשר מכל צינור ומשוך את כל שבעת מתלי האנטיגן לצינור יחיד. לאחר מכן, הוסף לתערובת 1.2 מיליליטר של תמיסת עצירה ו-4 מיקרוליטר של אנטיגן GAD65, TPO, tTg, ThG, פרואינסולין אינטרפרון-אלפא ו-IA-2.
לפני הדגירה של דגימות סרום עם תערובת האנטיגן המסומנת יש להוסיף 15 מיקרוליטר סרום לבאר של צלחת PCR של 96 בארות, ולערבב 18 מיקרוליטר של 0.5 חומצה חומצית מולרית עם כל באר סרום למשך 45 דקות דגירה בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, הוסף 35 מיקרוליטר אנטיגן ו-13 מיקרוליטר של מאגר טריס טוחנת אחת לכל באר של צלחת PCR חדשה של 96 בארות. בתום הדגירה, העבירו מיד 25 מיקרוליטר מהסרום שטופל בחומצה לכל באר של צלחת האנטיגן.
מכסים את הצלחת בנייר כסף תקרה PCR, ומניחים את הצלחת על שייקר במהירות נמוכה בטמפרטורת החדר למשך שעה. בתום הדגירה מניחים את הצלחת על 4 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 24 שעות. הוציאו את הצלחת מהמקרר והניחו לה להגיע לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר של חוסם A-buffer 3% לכל באר. לאחר שכל הבארות טופלו, מכסים את הצלחת בנייר כסף ומניחים את הצלחת במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, הפוך את הצלחת הפוכה ושטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 150 מיקרוליטר PBS-T לבאר, לכל שטיפה.
טפחו על הצלחת עד שלא יישאר חיץ באף אחת מהבארות. הוסף 30 מיקרוליטר של דגירה של אנטיגן בסרום לכל באר. לאחר הוספת כל הדגירות, מכסים את הצלחת בנייר כסף ומניחים את הצלחת על שייקר במהירות נמוכה למשך שעה, בטמפרטורת החדר.
בתום הדגירה, הסר את הדגירות על ידי החלקה ושטוף את הבארות שלוש פעמים עם 150 מיקרוליטר PBS-T לבאר, כפי שהודגם. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר קריאה לכל באר וקרא את הצלחת על קורא צלחות, בספירה לשנייה. בניתוח זה של קבוצה גדולה של דגימות מ-1026 חולי סוכרת מסוג 1 שאובחנו לאחרונה, הושוו רמות הנוגדנים העצמיים מבדיקת שבע פלוס אלקטרו לומינסנציה עם הרמות מכל בדיקת אלקטרו לומינסנציה בודדת מקבילה ומכל בדיקת קשירת רדיו סטנדרטית מקבילה ו-ELISA.
ספציפיות הבדיקה הייתה זהה באחוזון ה-99 עבור כל בדיקות הנוגדנים העצמיים, למעט נוגדנים עצמיים של בלוטת התריס, שעבורם נעשה שימוש באחוזון ה-95. מספר קטן של דגימות לא תואמות עבור כל אחד משבעת הנוגדנים לרכב נמצאו סביב גבול החתכים עבור כל בדיקה. כאן, ניתן לצפות בנתונים המתאימים עבור 1022 בקרות בריאות עבור כל בדיקה.
הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא למצוא מקשר שונה לכל אחד מהאנטיגנים הביוטיניים הייחודיים, ולערבב כל אנטיגן עם התכונות ליצירת קישור מצומד. טכניקת בדיקה זו תאפשר לחוקרים לתכנן בדיקות סקר למספר מחלות אוטואימוניות בו זמנית באוכלוסיות בקנה מידה גדול ותאפשר למרפאות לסנן בקלות מספר מחלות רלוונטיות עם סוכרת מסוג 1.
סקירה כללית
מחקר זה מציג בדיקת אלקטרוכימילומינצנציה (ECL) רב-ערוצית המאפשרת סריקה סימולטנית לסוכרת מסוג 1 ומחלות אוטואימוניות שונות. הבדיקה משלבת מספר בדיקות לנוגדנים עצמיים בתוך באר אחת, ובכך משפרת את היעילות ומפחיתה עלויות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- autoimmunity (חסינות עצמית)
- דיאגנוסטיקה
- בדיקות אלקטרוכימילומינצנציה (Electrochemiluminescence assays)
רקע
- סוכרת מסוג 1 (T1D) מקושרת לעיתים קרובות למחלות אוטואימוניות אחרות.
- בדיקות מסורתיות עשויות לדרוש מספר מבחנים, מה שמעלה את הזמן והעלויות.
- בדיקות Multiplex יכולות לייעל את תהליך האבחון.
- אלקטרולומינסנציה כימית (Electrochemiluminescence) מספקת רגישות וסגוליות גבוהות.
מטרת המחקר
- פיתוח בדיקת ECL מרובת-נבדקים (multiplexed) לסריקת T1D ומחלות אוטואימוניות קשורות.
- השוואת ביצועי הבדיקה המרובת-נבדקים לבדיקות בודדות מבוססות.
- סיוע בביצוע סריקות רחבות-היקף במסגרות קליניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של תמיסות אנטיגנים המשוייכות למקשר מעורבב.
- אינקובציה של דגימות סרום עם אנטיגנים מסומנים.
- שימוש בפורמט של פלטה בעלת 96 בארות לסריקה בעלת תפוקה גבוהה.
- השוואה של רמות נוגדנים עצמיים בחולי T1D ובביקורות בריאות.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה הרב-מרכיבית (multiplexed assay) הדגימה סגוליות דומה לבדיקות בודדות.
- זוהה מספר קטן של דגימות סותרות בקרבת ספי סף (cutoff thresholds).
- סופקו נתונים עבור קהל מטופלים גדול של חולי T1D שאובחנו לאחרונה.
- אפשרה סריקה יעילה של מספר מחלות אוטואימוניות.
מסקנות
- בדיקת ECL מרובת רכיבים (multiplexed) היא כלי יעיל לסריקה בו-זמנית.
- שיטה זו יכולה לשפר את היעילות האבחנתית בפרקטיקה קלינית.
- מומלץ לבצע תיקוף נוסף באוכלוסיות גדולות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
גילוי סימולטני של מספר נוגדנים עצמיים בבאר אחת פותר צוואר בקבוק קריטי בסריקה רחבת היקף של מחלות אוטואימוניות, ומפחית את מורכבות הבדיקה ואת צריכת המשאבים. גישה זו של כימילומינצנציה אלקטרוכימית מרובת יעדים (multiplexed electrochemiluminescence) מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מוקדם של המחלה, על ידי אספקת קריאות של סממנים ביולוגיים מתואמים עבור סוכרת מסוג 1 ומצבים אוטואימוניים נלווים. הבדיקה תומכת במיון תיקי פיתוח ובצמצום סיכונים מכניסטיים בפיתוח אימונותרפיה, על ידי התסמיכות יעילה של חולים בהתבסס על פרופילים של נוגדנים עצמיים מרובים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קורלציה בין מקבצי נוגדנים עצמיים לבין אנדוטיפים של המחלה במודלים פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תיקוף תפקודי של תגובות חיסוניות ספציפיות לאנטיגן במערכות רלוונטיות למחלה.
- ערך ניבוי: משפר את הביטחון בבחירת המטרה על ידי זיהוי תתי-אוכלוסיות של חולים בעלות חתימות נוגדנים עצמיים קונברגנטיות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: הכנה של פאנלים כמותיים וסטנדרטיים של סממנים ביולוגיים עבור קמפיינים של סריקה המשך הדורשים הדירות גבוהה.
- ערך תפעולי: אספקת מוכנות לבדיקה באמצעות קומפלקסים של אנטיגן-מקשר (antigen-linker) שסומסמו, המבטיחים קישור עקבי בשלב הנוזלי בין הבארים השונות.
- יכולת הרחבה (Scalability): מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה לסריקה של עד 10 נוגדנים עצמיים (autoantibodies) לכל באר, ובכך מגביר את התפוקה ללא צורך בעיצוב מחדש.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תואם מערכות הרלוונטיות למחלה על ידי זיהוי נוגדנים עצמיים הקשורים להתקדמות קלינית בסוכרת מסוג 1 ובמחלות אוטואימוניות נלוות.
- קידום מותאם סיכון: תומך בהחלטות go/no-go על ידי זיהוי מטופלים עם פרופילי נוגדנים עצמיים בעלי חדירות גבוהה המנבאים אוטואימוניות רב-איברית.
- הפחתת סיכון מכניסטית: מפחיתה עמימות בפירוש המנגנון החסוני באמצעות מדידה בו-זמנית של נוגדנים עצמיים לאייילחים, לבלוטה המגן, למעי ולנתיב האינטרפרון.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
הבדיקה משמשת כגשר בין שלב הגילוי לשלב התרגומי, ומאפשרת פנוטיפ עימוני מוקדם המכוון את שלבי זיהוי המועמדים והתיקוף הפרה-קליני באמצעות פרופיל רב-מרכיבי של נוגדנים עצמיים.
- ביולוגיה גילויית: תומכת בבדיקת השערות על ידי קישור דפוסי ביטוי משותף של נוגדנים עצמיים לנתיבים פתוגניים בפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים וניתנים לשחזור המאפשרים השוואה של תגובות חיסוניות בין תנאי טיפול או רקעים גנטיים שונים.
- אנליזה: מספקת קריאות של ספירות מנורמלות לשנייה המאפשרות השוואה סטטיסטית של רמות נוגדנים עצמיים בין קהל חולים לקבוצת ביקורת.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי תיקוף פאנלים של סמנים ביולוגיים בדגימות אנושיות המשקפות הפרעה בבקרה חיסונית הקשורה למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לבדיקה אימונולוגית, הניתנת להתאמה לפאנלים של מחלות אוטואימוניות או דלקתיות אחרות מעבר לתצורה הראשונית של 7-plex.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרה על ידי הפחתת תוצאות שגויות שליליות באמצעות מדידה בו-זמנית של נוגדנים עצמיים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות על ידי ביטול שונות בין בארי באמצעות הצגת אנטיגן מקובע.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי איחוד של שבעה בדיקות אבחון לשלב אחד בזרימת העבודה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים טיפוליים מותאם סיכון, בהתבסס על אוכלוסיות חולים המוגדרות על ידי סמנים ביולוגיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון עיקרון בדיקות אימונו-ספציפיות (immunoassay) ובכימיה של מקשרים (linkers) לצורך קיבוע אנטיגנים.
- תלוי בקורא לוחיות המסוגל לבצע גילוי באמצעות אלקטרו-כימילומינצנציה בפורמט של 96 בארות.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי חסימה ושטיפה בין אתרים שונים במחקרים רב-מרכזיים.
- דורש התאמה של ריכוזי האנטיגנים בעת הרחבת הבדיקה למטרות של נוגדנים עצמיים חדשים מעבר לשבעה המקוריים.
- מוגבל על ידי הצורך בזוגות מקשר-אנטיגן אופטימליים למניעת תגובת-בת (cross-reactivity) בפורמט מולטיפלקס.
