Name: הבהרה ראשונית של נוזל תרבית תאים שנקטפו על ידי CHO באמצעות מפריד אקוסטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: למדו להשתמש במפריד אקוסטי להבהרה ראשונית של תרביות תאי CHO. שיטה זו מציעה יתרונות על פני שיטות מסורתיות כמו צנטריפוגה וסינון, כולל זיהום נמוך וזרימה רציפה לתהליכי ביופרוססינג מתמשכים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לנילו שרה ארדן וז'ונג זאו על הביקורת הבונה שלהם על כתב היד הזה. המחברים גם רוצים להודות ללינדסי בראון על קלט חיוני במהלך הפרויקט הזה. מימון פנימי חלקי ותמיכה בעבודה זו סופקו על ידי תוכנית הנתיב הקריטי CDER (CA #1-13) ותוכנית מדע הייצור של CDER, מרכז החדשנות למצוינות (ברילה-CoE-19-49). פרויקט זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית ההתמחות /מחקר השתתפות במשרד למוצרי ביוטכנולוגיה, מינהל המזון והתרופות האמריקאי, המנוהל על ידי מכון Oak Ridge למדע וחינוך באמצעות הסכם בין סוכנויות בין משרד האנרגיה האמריקאי ל- FDA.
פרסום זה משקף את דעותיו של המחבר ואין לפרש אותו כדי לייצג את השקפות ה-FDA או את המדיניות שלו.

1. הכנת AWS
הערה: פרוטוקול זה פותח באמצעות תא אצוטופורטי אחד. עם זאת, AWS בקנה מידה ספסל יש חמש בדיקות עכוז שיכול להפעיל 4 תאים acoustophoretic בסדרה במידת הצורך.
<ol><li>חברו את כבלי הturbidity ליציאות המתאימות שלהם המסומנות כ- F, 1, 2, 3, 4 (למשל, גשושית עכירות 1 באיור 1c ויציאת 1 באיור 2a) וכבלי BNC של ההספק התאי לחלק האחורי של מערכת AWS המסומנים כ- 1, 2, 3, 4 (איור 2b). הערה: אין לחבר את הקצה השני של כבל ה- BNC של החשמל התאי (איור 3c) לחלק האחורי של התא האצוטופורטי (איור 3d) עד לשלב 2.6 כאשר התא מלא בנוזל. אם הכוח התאי מופעל ללא נוזל בתא, זה יפגע במתמר הפיזו בתא ולא יתפקד עוד.</li>
	<li>הכנס את בדיקות החופרת למד החופר ולמדחום והידוק את הברגים (איור 1c ואיור 3).</li>
	<li>חברו את צינורות ההזנה לקלט של יציאת העכירות של ההזנה(איור 4a)באמצעות משאבת ההזנה(איור 1b עד 1c).</li>
	<li>חברו את צינורות ה-y מהפלט של יציאת עכירות ההזנה(איור 4b)לנמלי הכניסה של התא האצוטופורטי(איור 4c).</li>
	<li>חברו את הצינורות שלב 1 מנמל הפסולת של התא האצוטופורטי(איור 4d)דרך משאבת שלב 1 לספינת איסוף תאים(איור 1d דרך 1e עד 1f).</li>
	<li>חברו את הצינורות מהנמל החלחל של התא האצוטופורטי(איור 4e)לכניסת יציאת עכירות probe1(איור 4f).</li>
	<li>חברו את צינורות הקציר מיציאת העכירות probe1(איור 4g)לספינת איסוף מוצרים(איור 1עד 1 גרם).</li>
</ol>2. ראש המערכת עם HCCF
הערה: פרוטוקול זה פותח באמצעות תאי CHO-K1 בתרבית בינונית מוגדרת כימית (ActiCHO P עם 6 mM L-גלוטמין) המייצרים את הנוגדן המונוקלונלי IgG1 VRC0113 וייתכן שיהיה צורך להתאים אותו עבור קווי תאים ומוצרים אחרים. HCCF בשימוש בפרוטוקול זה הושג בסוף 7-8 ימים של תרבויות CHO-K1 מבקבוק רועד או תהליך bioreactor.
<ol><li>הפעל את AWS על-ידי הפעלת מתגי ההפעלה בחלק האחורי והחזית של AWS.</li>
	<li>הפעל את המחשב ולחץ פעמיים על סמל השולחן עבור התוכנה המשויכת(ראה טבלת חומרים ). מהחלונית "קריאות", לחץ על לחצן "התחל מבחן" כדי ליזום הקלטת נתונים (איור 5). לאחר הפעלת הקלטת הנתונים, כל הנתונים הנאספים יצונו בגיליון אלקטרוני הניתן לייצוא עד להפסקת הבדיקה.</li>
	<li>חבר את קצה צינורות ההזנה לספינת HCCF המתעוררת.</li>
	<li>התחל את משאבת ההזנה על ידי הזנת קצב המשאבה במסך "פקדים" בתוך "תמונת משאבת ההזנה" ולחץ על "Enter" במקלדת. ודא כי "סמל חץ כיוון המשאבה" (בכיוון השעון או נגד כיוון השעון) נבחר כראוי בתיבה האפורה שמימין לתמונת משאבת ההזנה כדי לשאוב HCCF מהכלי לתא האצוטופורטי. לחץ על "סמל המשולש" לצד המילים "הפעל" בתוך התיבה האפורה תחת תמונת משאבת ההזנה כדי "התחל" המשאבה (איור 6a). הערה: קצב המשאבה המרבי הוא 10 ליטר / שעה (167 מ"ל / דקה), אך מומלץ כי קצב הזרימה הנומינלי, 60 מ"ל / דקה, ישמש לשלב זה כדי למלא במהירות את הצינורות והתא מבלי להסתכן במילוי יתר של התא לפני תחילת ההפרדה.</li>
	<li>נטר את מדידות עכירות ההזנה על ־ ידי התבוננות ב "לוח הפחתה באחוזים" (איור 5c) במהלך מילוי התא האצוטופורטי. ערכי העיקול יישארו עקביים במהלך טעינת התא אם HCCF מעורבב מספיק בכלי HCCF.</li>
	<li>לאחר שהנוזל נמצא מעל מתמר הפיזו בחלק האחורי של התא האצוסטופורטי, לחץ על "כיבוי" בתוך הקופסה האפורה מתחת לתמונת משאבת ההזנה כדי לעצור את המשאבה. חברו את כבל החשמל של BNC(איור 3c)לתא האצוטופורטי(איור 3d). הערה: נפח העיכוב של כל תא אצוטופורטי הוא סביב 190 מ"ל.</li>
</ol>3. הפעלת AWS
<ol><li>לאחר מילוי התא האצוטופורטי וכבל החשמל BNC מחובר לחלק האחורי של התא האצוטופורטי, שנה את קצב משאבת ההזנה לקצב ההפעלה הרצוי(איור 6a וטבלה 1). יש לבדוק מספר שיעורי משאבת הזנה כדי לזהות את הפרמטרים ההפעלה האידיאליים עבור תהליך נתון.</li>
	<li>הפעל את עוצמת הפיזו Stage1 על-ידי הזזת הסרגל במודול צריכת החשמל ל- 10 W (איור 6d) ולחיצה על סמל "הפעל" בצד ימין של התיבה שלב 1 (איור 6c). כפי שהוצע על ידי היצרן, השתמש 10 W, הגדרת צריכת החשמל המומלצת עבור תאי CHO. פעולה זו תיצור תדר קבוע של 2 מגה-הרץ לפעולה. לאחר מספר שניות, התאים יתחילו להתקבץ באופן ניכר בצמתי הגלים בתא האצוטופורטי(איור 7a).</li>
	<li>לאחר התאים מתחילים להתיישב לתחתית התא האצוטופורטי (איור 7b), התחל את משאבת השלב הראשון בקצב מתאים המבוסס על צפיפות התאים וקצב משאבת ההזנה (איור 6b). בהתבסס על האופטימיזציה של היצרן וגיליון העבודה של מצב יציב, ניתן לחשב את קצב המשאבה שלב 1 בהתבסס על מסת התא הארוז וקצב זרימת ההזנה באמצעות המשוואה הבאה <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ01.jpg"><ol>
<li>כדי לחשב מסת תא ארוזה, tare בקנה מידה עם צינור 15 מ"ל ריק (או צינור אחר תואם צנטריפוגה). מלא את הצינור בחומר הזנה ורשום את המשקל הכולל של הצינור עם הזנה. צנטריפוגה הצינור במשך 10 דקות ב 3,700 x גרם. בדל את הסופר-נט למיכל נפרד. למדוד את המשקל של הצינור עם גלולה התא. אחוז מסת התא הארוז של חומר ההזנה = (משקל צינור decanted / משקל צינור מלא) x 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נטר את פרופיל העקידות של עכירות שלב 1 כאשר הגלישה מהתא האצוטופורטי נכנסת לגשושית העופרת1 (איור 8).</li>
	<li>ככל שהפרדת התאים תימשך, יעילות הסרת <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg"> התאים תגדל.</li>
	<li>בנוסף, נטר את הפרש הטמפרטורה בין הזנה לשלב1 מכיוון שהוא יגדל ככל שהפרדת התאים תימשך (איור 9). הטמפרטורה עשויה לעלות כאשר נעשה שימוש בהזנת צפיפות תאים גבוהה יותר, אך בדרך כלל ניתן להפחיתה על-ידי שינוי קצב זרימת ההזנה. הערה: בעת שימוש בתאים אצוטופורטיים מרובים, ניתן לחבר ברצף את הצינורות מהתא האצוטופורטי הקודם באמצעות בדיקות עכוז לקלט של התא האצוטופורטי הנוכחי. בנוסף, ניתן לחבר צינורות במה מתחתית התאים האצוטופורטיים באמצעות משאבות במה לכלי איסוף תאים. ניתן לחבר בסדרה ארבעה תאים אצוטופורטיים בסדרה ליעילות אופטימלית להסרת תאים במידת הצורך.</li>
</ol>4. סיום AWS
<ol><li>כאשר הריצה נגמרת, הפסק את ההזנה ואת משאבת שלב 1 על-ידי לחיצה על כבה בתוך הקופסה האפורה מתחת למשאבת ההזנה ותמונות משאבה שלב 1, בהתאמה, כדי לעצור את המשאבות.</li>
	<li>כבה את החשמל לתא על-ידי לחיצה על כבה בצד ימין של התיבה שלב 1 וניתק את כבל החשמל BNC.</li>
	<li>קח את חומר קציר המוצר שנאסף להליכי הבהרה וטיהור נוספים, כגון סינון עומק ושיטות כרומטוגרפיה. השלך את חומר קציר התא.</li>
	<li>מסננים את הנוזל הנותר בתא האצוטופורטי על ידי הנחת צינורות הפסולת לתוך כלי ריק, ניתוק הצינורות מכניסת החדר האקוסטופורטי ויציאות מחלחלות ושחרור צינורות הפסולת מראש המשאבה.</li>
	<li>חברו מחדש את הצינורות, הניחו את צינורות הפסולת בחזרה לראש המשאבה, וזרמו דרך מי DI מסוף צינורות ההזנה באמצעות קצב משאבת הזנה של 60 מ"ל לדקה וקצב משאבה שלב 1 של 60 מ"ל / דקה. ממשיכים 15-20 דקות. זרוק את הזרימה דרכה.</li>
	<li>יש לשאוב 70% אלכוהול איזופרופיל (IPA) דרך הצינורות והתא באמצעות משאבת ההזנה למשך 15-20 דקות. זרוק את הזרימה דרכה.</li>
	<li>חזור על הליך ניקוי עם מי DI כדי לנקות את הצינורות ואת התא באמצעות משאבת ההזנה במשך 15-20 דקות. זרוק את הזרימה דרכה.</li>
	<li>לפרק את הצינורות מן בדיקות עכוז ותאים acoustophoretic ולנקות את האזור עם 70% IPA.</li>
	<li>לפרק את בדיקות ערדות ולנקות בתוך בדיקות ערד עם 70% IPA. תן לכל החלקים להתייבש באוויר ולאחר מכן להרכיב מחדש לשימוש הבא. הערה: התאים האצוטופורית מיוצרים לשימוש יחיד אך ניתן לעשות בהם שימוש חוזר אם מטפלים בהם ומנקים אותם כראוי כמתואר בפרוטוקול זה.</li>
</ol>

<ol><li>Roush, D. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+primary+recovery%3A+centrifugation+and+membrane+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology.</a> Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).</li>
<li>Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+analysis+of+mammalian+cell+suspensions+for+prediction+of+industrial+centrifugation+and+its+verification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).</li>
<li>Shukla, A. A., Suda, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShukla%2C+AA+%22Harvest+and+recovery+of+monoclonal+antibodies%3A+cell+removal+and+clarification.+Second+ed%22">Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed</a>. 2, Wiley. 55-79 (2017).</li>
<li>Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+cost+and+facility+considerations+in+the+selection+of+primary+cell+culture+clarification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology.</a> Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).</li>
<li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarification+of+recombinant+proteins+from+high+cell+density+mammalian+cell+culture+systems+using+new+improved+depth+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 1964-1972 (2013).</li>
<li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2 (5), 480-499 (2010).</li>
<li>Ryll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+small-scale+CHO+perfusion+cultures+using+an+acoustic+cell+filtration+device+for+cell+retention%3A+characterization+of+separation+efficiency+and+impact+of+perfusion+on+product+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality.</a> Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).</li>
<li>Gorenflo, V. M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-up+and+optimization+of+an+acoustic+filter+for+200+L%2Fday+perfusion+of+a+CHO+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Scale-up and optimization of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of a CHO cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (4), 438-444 (2002).</li>
<li>Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+fluid+dynamics+associated+with+macro+scale+ultrasonic+separtors%5BTitle%5D)+AND+%22169th+Meeting+of+the+Acoustical+Society+in+America%22%5BJournal%5D)">Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors.</a> 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).</li>
<li>Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+flow+rate+acoustophoretic+phase+separator+for+oil+water+emulsion+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237(2013).</li>
<li>Dutra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Macroscale+Acoustic+Device+for+Blood+Filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Device%22%5BJournal%5D)">A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration.</a> Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).</li>
<li>Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. Acoustic perfusion devices. US patent. , 9738866 (2017).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+envelope+identifies+broadly+neutralizing+human+monoclonal+antibodies+to+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1.</a> Science. 329 (5993), 856-861 (2010).</li>
<li>Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+cell+filter%3A+a+proven+cell+retention+technology+for+perfusion+of+animal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures.</a> Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).</li>
<li>Wolf, M. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Performance+in+Mammalian+Cell+Perfusion+Cultures+by+Growth+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition.</a> Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722(2019).</li>
<li>Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+approach+to+developing+mammalian+cell+culture+media+for+high+cell+density+perfusion+process+leveraging+established+fed-batch+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media.</a> Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).</li>
<li>Emily, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+clarification+of+very+high+cell+density+cell+culture+harvest+by+enhanced+cell+settling%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling.</a> BioProcess International. 8, 32-39 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כספיים במוצרים המתוארים בכתב יד זה ואין להם שום דבר אחר לחשוף.

מתואר הוא פרוטוקול שלב אחר שלב ליישום AWS בקנה מידה ספסל בהבהרה ראשונית של נוגדן חד שבטי מודל מ HCCF של קו תא CHO. כפי שניתן לראות בתוצאות הייצוגיות, השימוש ב- AWS בהבהרה ראשונית הביא להבהרה יעילה של התאים ולשחזור המוצר. יתר על כן, הרמה הנמוכה של דרישות תחזוקה ותפעול ויכולת הרחבה מאפשרים פוטנציאל יישום רחב יותר בהבהרה ראשונית.
חשוב לציין, התוצאות הייצוגיות מצביעות על כך שקצב משאבת ההזנה הוא קריטי להפרדת התאים. בנוסף, בשל מגבלות בזיהוי צפיפות תאים גבוהה במדידת עכוז, צפיפות תאי עבודה היא גורם נוסף שיש לקחת בחשבון בעת שימוש במערכת AWS. מכיוון שמבחן הערוץ יהיה רווי בעת הפעלת חומר הזנה בצפיפות תאים גבוהה, ייתכן שעדיף לחשב את יעילות הפרדת התאים על ידי מדידת צפיפות התאים של חומר ההזנה ונוזל תרבית התאים המובהר במצב לא מקוון. עם מדידה לא מקוונת מדויקת של הבהרה, אסטרטגיית תהליך אחת שניתן לשקול בפתרון בעיות אלה היא להשתמש בתאים מרובים בסדרות. למרות פרוטוקול זה מתמקד בעיקר באמצעות תא אחד, מערכת זו יכולה להפעיל שלושה תאים נוספים להבהרה רציפה של התאים שיכולים להשפיע באופן מינימלי על מצב התאים ולהביא להתאוששות מוצר גבוהה. בנוסף, פרמטרים אחרים, כגון צריכת חשמל עבור AWS וקצבי זרימת הסרת תאים, ניתן למטב עוד יותר עבור סוגי תאים ספציפיים או מצב פעולה. בסך הכל, מומלץ אופטימיזציה של הפרמטרים והאסטרטגיה של הפעולה באמצעות שיקולים אלה לפני יישום AWS.
בין פוטנציאל יישום רבים, השימוש AWS תהליך ביולוגי מתמשך הוא מבטיח. מכיוון ש- AWS יכול להחליף צנטריפוגה ולהפחית באופן דרסטי את שטח פני השטח של המסנן14, השימוש ב- AWS יאפשר זרימה מתמדת של חומר ללא תאים לתהליכי סינון וכרומטוגרפיה הבאים התואמים לתהליכי ביו-אופן מתמשכים. בשל תאימות זו וזמינות טכנולוגיית זלוף לצפיפות תאים גבוהה (למשל, >50 x 106 תאים/מ"ל) ומשך תרבות ארוך יותר (לדוגמה, >14 ימים), ל- AWS יש פוטנציאל לפתח אסטרטגיית דימום תאים רציפה חדשנית בנוסף להבהרה הראשונית.
במקרים מסוימים, עד 30% של חלבון טיפולי המיוצר מוסר במהלך פעולה במצב יציב בחומר לדמם התא15,16. בנוסף, כדי שהנוגדנים החד שבטיים שהוסרו יתאחדו עם החומר שנקטף הסטנדרטי יש לעמוד בתכונות איכות מסוימות. כאשר מפרטים אלה אינם מתקיימים, התוצאה עשויה להיות דחייה של חומר שיכול להשפיע על תפוקת המוצר. כדי לפצות על אובדן מוצר כזה, הבהרה מתמשכת של חומר דימום התא באמצעות AWS יכול להיות מיושם במצב יציב במהלך תהליך זלוף לטווח ארוך17. אסטרטגיה זו עשויה להפחית את אובדן המוצר בחומר הדימום ולנצל יותר מהחלבון המיוצר. בנוסף, תאים לאחר ההבהרה המתמשכת באמצעות AWS עלולים להתווסף בחזרה לתוך bioreactor אם תרצה צפיפות תאים גבוהה יותר ופרודוקטיביות. לפיכך, בירור מתמשך של חומר בלימת תאים עם AWS עשוי להציע הזדמנות להגדיל את התשואה ו /או להקטין שטח פנים סינון משני בתהליך נתון.
לסיכום, השירות של AWS אינו מוגבל להבהרה ראשונית פשוטה, אך עשוי להיות כלי עזר עבור יישומים תהליך ביולוגי מתמשך שעשוי לשפר את קצב הייצור ואת הגמישות התפעולית.

צעד קריטי בתהליך ביו-מנופרקט הכולל חלבונים טיפוליים מופרשים הוא הסרת ביומסה מנוזל תרבית תאים שנקטפו (HCCF). באופן מסורתי, biomanufacturers אימצו צנטריפוגה ואחריו סינון עומק כשיטות ההבהרה העיקריות שלהם בייצור נוגדנים חד שבטיים1. עם זאת, צנטריפוגה עלולה להוביל ללחץ גיסת גבוה על התאים, וכתוצאה מכך פסולת תאית מוגברת ב- HCCF. זה יכול להוביל סינון עכירה במהלך סינון וכתוצאה מכך מזהמים נוספים לאחר סינון שיכול לאחר מכן להפחית את יעילות הכרומטוגרפיה במורד הזרם1,2,3. יתר על כן, ההתאמה האישית של הצנטריפוגות עבור תהליך מסוים יכולה להיות יקרה ועשויה לדרוש חיבורים נוספים למערכות נקיות במקום ועיקור במקום שעשויות להיות גם גורם מגביל למדרגיות. השימוש במסנני עומק יכול לפצות על מגבלות צנטריפוגה וגם לנצל את הטכנולוגיה החד פעמית4. עם זאת, מסנני עומק משמשים בעיקר כהבהרה משנית מכיוון שהם אינם יכולים לעמוד בצפיפות תרבית תאים גבוהה5. לחלופין, סינון זרימה משיק (TFF) התקני שימור תאים שימשו כדי להקל על מתח הגיאה, אך עשוי להיתקל באתגרים כגון קיטוב ממברנה ותפוקות קציר גרועות6. הסוגיות הנ"ל הנובעות משימוש ב-centrifugation בתוספת סינון עומק או TFF יוצרות הזדמנות לשיפור תהליך ההבהרה העיקרי של HCCF.
הפרדה אקוסטית הוצגה כטכנולוגיה שניתן להשתמש בה לקציר חלבונים מופרשים מתרביות תאים עם מוצרי חלבון באיכות גבוהה7,8. הפרדה אקוסטית מושגת באמצעות התפשטות והשתקפות של גלים עומדים רב ממדיים אינטראקציה עם נוזלים מושעים וחלקיקים שמורים9,10. חלקיקים אלה חווים שלושה כוחות: גרירת נוזלים, כוח המשיכה וקרינה אקוסטית. כאשר כל אחד מהכוחות מתנגדים זה לזה באותה מידה, להגיע שיווי משקל, החלקיקים מושעים ונלכדים בתוך גל עומד קולי10. בהשעיית תרבית תאים, תאים מוחזקים בתוך מישור צומת הלחץ הזה של גלים עומדים, הצומת גדל ככל שהתאים מתמזגים, ובסופו של דבר אשכולות אלה של צמתים תאיים נופלים מכוח הכבידה9. תאים מחושעים אלה מוסרים מהתקשורת, מה שמאפשר לשאיבה של אמצעי התקשורת המובהרים לעיבוד במורד הזרם. ניצול של גלים קוליים כשיטת הפרדה החל לתרגם ליישומים ביולוגיים החל הפרדה של חלקיקי שומנים ותאי דם אדומים11 לתרבות תאי זלוף יונקים12. עם היכולות היחסיות שלה כדי להפחית עלויות, עבודה, ומתח תאי על ידי הימנעות צנטריפוגה, סינון עומק, או TFF, biomanufacturers בוחנים את היישומים הפוטנציאליים של שימוש בהפרדה אקוסטית.
מחקר זה מספק פרוטוקול כללי להפעלת מפריד גלים אקוסטי ספסל (AWS) להבהרה של תרבות התא CHO, מציג נתונים מייצגים, ומדגים כיצד להשיג הבהרה תא יעיל ושחזור המוצר.

<table><tbody><tr><td>תא אקוסטופורקטי</td><td>Pall</td><td>CAS-AC-K1 ערכת</td><td></td>תא אקוסטי Cadence</tr><tr><td>ActiCHO P</td><td>GE</td><td>SH31025.01</td><td>אבקה בינונית</td></tr><tr><td>AWS</td><td>Pall</td><td>CAS-SYS (60500101-SP)</td><td></td></tr> <tr><td>תוכנת מפריד אקוסטי Cadence</td><td>ממשק מפריד אקוסטי Pall Cadence גרסה 1.0.4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי CHO-K1</td><td>VRC</td><td>VRC01</td><td></td></tr><tr><td>מחשב</td><td>Dell</td><td>Latitude 3470</td><td>Windows 7, 64 סיביות מערכת הפעלה</td></tr><tr><td>איזופרופנול (70%)</td><td>LabChem</td><td>LC157605</td><td>20L מוכן 70% IPA</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>קורנינג</td><td>25-005-CV</td><td>200 מ"מ פתרון מלאי</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 14 צינורות</td><td>Cole-Parmer</td><td>96400-14</td><td>צינורות סיליקון מרפא חמצן, 25ft</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 16 צינורות</td><td>Cole-Parmer</td><td>96400-16</td><td>צינורות סיליקון מרפאים במי חמצן, סט צינורות 25 רגל</td></tr><tr><td></td><td>סט</td> צינורות <td></td><td>Pall CAS-FP-K1</td></tr><tr><td>בדיקת עכירות</td><td>Pall</td><td>CAS-TS-S1 (60500106)</td><td></td></tr></tbody></table>

הבהרה ראשונית של נוזל תרבית תאים שנקטפו על ידי cho באמצעות מפריד אקוסטי

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

הבהרה ראשונית היא צעד חיוני בתהליך biomanufacturing להסרה הראשונית של תאים ממוצרים טיפוליים בתוך נוזל תרבית התא שנקטף. בעוד שיטות מסורתיות כמו צנטריפוגה או סינון מיושמות באופן נרחב להסרת תאים, הציוד עבור תהליכים אלה יש עקבות גדולות ותפעול יכול לכלול סיכוני זיהום ועבירות מסנן. בנוסף, שיטות מסורתיות לא יכול להיות אידיאלי עבור תוכניות עיבוד ביולוגי מתמשך להבהרה ראשונית. לכן, יישום חלופי באמצעות גלים אקוסטיים (קול) נחקר להפריד תאים ללא הרף מנוזל תרבית התא. במחקר זה מוצג פרוטוקול מפורט לשימוש במפריד גלים אקוסטי בקנה מידה ספסל (AWS) להפרדה העיקרית של נוזל תרבות המכיל נוגדן IgG1 חד שבטי מקציר ביו-קטור של תאי CHO. נתונים מייצגים מוצגים מ- AWS ומדגימים כיצד להשיג הבהרה יעילה של תאים ושחזור מוצרים. לבסוף, יישומים פוטנציאליים עבור AWS 20000000000000000000000000000000000000000000000000 בסך הכל, מחקר זה מספק פרוטוקול מעשי וכללי ליישום AWS בהבהרה ראשונית עבור תרביות תאים CHO ומתאר עוד יותר את פוטנציאל היישום שלה תהליך ביולוגי מתמשך.

כפי שמתואר בפרוטוקול, AWS שימש לבירור HCCF בצפיפות של 12.4 x 106 תאים / מ"ל, כפי שמוצג באיור 1. משאבת ההזנה הוגדרה ל-3.5 מ"ל/דקה (5 ליטר ליום), המייצגת קצב דימום בתא בטווח המתאים המשוער לתרבות של 10-20 ליטר. כאשר ה-HCCF נכנס לתא ה-AWS, מדידות העוכירות מבדיקת עכירות ההזנה נותרו עקביות, בסביבות 1,000-1,100 NTU, והמדידות מבדיקת העכירות של הגשושית 1 נותרו סביב 40-50 NTU (איור 8). באמצעות שתי המדידות, יעילות הסרת תאים
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg">
חושב וממוצע 95%. נמצא כי מדידת עכוז של 40-50 NTU הייתה רמת עכוז מינימלית ברת השגה ולכן לא הייתה הפרדה נוספת מתא AWS נוסף בסדרה.
בעוד AWS יכול להיפרד עם יעילות גבוהה בשיעורי זרימה נמוכים יותר, שמירה על HCCF במשך זמן רב יותר בתוך התא גרם עליית טמפרטורה, אשר צריך להיות שיקול בעת בחירת שיעורי זרימה נמוכים יותר. איור 9 הוא דוגמה להפרש הטמפרטורה של ה-HCCF לפני הכניסה לתא האצוסטופוראטי ולאחר הפרדה אקוסטית בקצב זרימת הזנה של 3.5 מ"ל לדקה, שהראה עלייה של &gt;6 מעלות צלזיוס בטמפרטורה עקב זמן ממושך בתוך התא האקוסטי.
שיקול חשוב נוסף בעת הפעלת יבול צפיפות תאים גבוהה (כלומר, &gt;20 x 106 תאים / מ"ל) הוא הרוויה של בדיקות ערפול. מדידות העשב עבור גשושית עכירות ההזנה הפכו רוויות מעל 4,400 NTU (איור 10), מה שעלול לגרום להמעיט בחישוב יעילות הסרת התאים.
כדי לבדוק את ההשפעה של שיעורי הזנה שונים על הבהרת התא, יעילות הסרת התא נמדדה בקצבי הזנה שונים. כפי שניתן לראות באיור 11, יעילות הסרת התאים ירדה משמעותית מ-100% ל-57% ככל שקצב משאבת ההזנה גדל. באופן כללי, קצב משאבת ההזנה איטי יותר, כך הבהרת התא טובה יותר. עם זאת, מומלץ אופטימיזציה של קצב ההזנה עבור כל יישום.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig01.jpg"> איור 1: הגדרת AWS. לאחר המשאבות הופעלו עם התוכנה (א),HCCF היה מתועל באמצעות משאבת הזנה (b) דרך גשושית ערד ההזנה (c) ואז לתא AWS (d). בתוך התא, כוחות אקוסטיים לכדו תאים מהזרימה בצמתים של גלים וגרמו להתגושמות. ירידה בציפה גרמה לתאים לרדת דרך כוח הכבידה, ותאים הוסרו מנמל הפסולת של התא האצוסטופורטי באמצעות משאבת שלב 1 (e) לבקבוק קציר תאים (f) בעוד החומר המובהק יצא לגשושית העכורה probe1 (c) דרך היציאה החלחלה של התא לבקבוק קציר מוצר (ז). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig02.jpg"> איור 2: גב מערכת AWS. בדיקות החופרת והתאים מחוברים לנמלים המתאימים שלהם בחלק האחורי של מערכת AWS באמצעות אתרנט גשושית עכוז (a) וכבלי BNC (b) כוח תא. כמו כן, המחשב מחובר באמצעות כבל אתרנט PC (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig03.jpg"> איור 3: בדיקות עכירות ודיור. כל בדיקה עכוזת (א) חייבת להיות מוכנסת כראוי למד עכוז בהתאמה ודיור מדחום (b) ומהודקת עם הברגים. כבל ה- BNC של הכוח התאי (c) צריך להיות מחובר לחלק האחורי של התא האצוטופורטי (d)רק לאחר מתמר פיזו בתא מלא בנוזל. הבדיקות מסומנות כדלקמן: F = ערדנות הזנה, 1 = ערדנות בדיקה1, ו 2, 3 ו 4 הם בדיקות שאינן בשימוש (או שניתן להשתמש בהן כדי לערוך את ההליך בסידרה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig04.jpg"> איור 4: חיבור בין דיור עכירות לבין התא האצוטופורטי. צינורות ההזנה מחוברים לקלט של יציאת עקשנות הזנה (א)באמצעות משאבת ההזנה. הפלט של יציאת עכוז ההזנה (b) מחובר ליציאות הכניסה של התא האצוטופורטי (c) באמצעות צינורות y. הצינורות שלב 1 מחוברים מנמל הפסולת של התא האצוטופורטי (d)דרך משאבת שלב 1 לכלי איסוף תאים. היציאה החדורה של התא האצוטופורטי (e) מחוברת לקלט של יציאת עכורות probe1 (f). צינורות הקציר מחוברים מנמל עכוז הגשושית 1 (g) לכלי איסוף מוצרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig05.jpg"> איור 5: לוח קריאות בתוכנת המפריד האקוסטי. התוכנית כוללת שני פאנלים, "קריאות" ו "פקדים". בתוך הפאנל "קריאות", עכוזות (a), טמפרטורה (b) והפחתת אחוזים (c) מנוטרים. כדי לאתחל את הקלטת הנתונים, יש ללחוץ על לחצן "התחל מבחן" (d), אשר ישנה את צבע הלחצן לירוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig06.jpg"> איור 6: לוח הבקרה בתוכנית. בתוך החלונית "Controls", ניתן להפעיל או לכבות את המשאבות, וניתן לשנות את קצב השאיבה להזנה (a) ושלבים אחרים (ב). כמו כן, ניתן להפעיל או לכבות את הכוח התאי במתמר הפיזו(c)ולהחליף אותו באמצעות סרגל שקופיות(ד). הניסויים השתמשו 10 W, כי זה הגדרת צריכת החשמל המומלצת עבור תאי CHO כפי שהומלץ על ידי היצרן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig07.jpg"> איור 7: אווס צ'יימברס. ברגע שהתאים היו בתוך התא, הכוחות האקוסטיים לכדו תאים בצמתים של גלים וגרמו לתאים להתקבץ (א). אשכולות תאים אלה גדלו עד שאיבדו את ציפהם ובסופו של דבר התיישבו בכוח הכבידה (ב). לאחר מכן, התאים המיושבים הוסרו מנמל הפסולת של התא האצוסטופורטי באמצעות משאבה שלב 1 לבקבוק קציר תאים (ג). המוצר יצא מהתא דרך יציאת חפשטות (ד) בעוד HCCF מילא את התא ברציפות באמצעות יציאות הכניסה (ה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig08.jpg"> איור 8: מדידות עכירות עבור תרבית תאים של 12 x 106 תאים/מ"ל CHO עם קצב משאבת הזנה של 3.5 מ"ל/דקה. עגמת ההזנה (כחול) הייתה כ-1,000 NTU, ויציאה משלב 1 עכוז (כתום) הייתה 40-60 NTU. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig09.jpg"> איור 9: מדידות טמפרטורה עבור תרבית תאים של 12 x 106 תאים/מ"ל CHO עם קצב משאבת הזנה של 3.5 מ"ל/דקה. טמפרטורת ההזנה (כחול) הייתה כ 21 °C (55 °F) וחלחלה לשלב 1 מד עכירות (כתום) היה כ 27 °C (7 °F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig09large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig10.jpg"> איור 10: דוגמה למדידת עכירות עבור מדגם צפיפות תאים גבוהה. כאשר צפיפות התא הייתה &gt;20 x 106 תאים/מ"ל, מדידת עכוז ההזנה הייתה רוויה בערך המרבי של 4,400 NTU, וכתוצאה מכך זלזלו ביעילות הסרת התאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig11.jpg"> איור 11: השוואת יעילות להסרת תאים. ככל שקצב ההזנה גדל, הפרדת התאים פחתה. לפיכך, ככל שקצב ההזנה גדל, יעילות הבהרת התאים ירדה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig11large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פרמטר</td>
			<td>מפרט</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב זרימה</td>
			<td>0 – 10 ליטר / שעה</td>
		</tr>
<tr>
<td>טווח לחץ</td>
			<td>0 – 2 בר (0 – 30 פסאיי)</td>
		</tr>
<tr>
<td>טמפרטורת נוזל הזנה</td>
			<td>0 – 40 °C (32 ° F)</td>
		</tr>
<tr>
<td>טמפרטורת הפעלה</td>
			<td>0 – 40 °C (32 ° F)</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: תנאי הפעלה. תנאי ההפעלה המומלצים של יצרן AWS עבור קצב זרימה, טווח לחץ, נוזל הזנה וטמפרטורת הפעלה.

מוצג כאן פרוטוקול להבהרה הראשונית של תרבית התא CHO באמצעות מפריד אקוסטי. פרוטוקול זה יכול לשמש להבהרה העיקרית של תרביות בקבוקון שייק או קציר ביו-ריאקטור ויש לו את היישום הפוטנציאלי להבהרה מתמשכת של חומר הדימום התאי במהלך פעולות bioreactor זלוף.

הבהרה ראשונית של נוזל תרבית תאים שנקטפו על ידי CHO באמצעות מפריד אקוסטי

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

הפרוטוקול שלנו מדגים כיצד להשתמש במפריד גלים אקוסטי בקנה מידה ספסל להפרדה ראשונית של תאי CHO מנוזל תרבית שנקטף המכיל נוגדן חד שבטי מודל. הפרדת גלים אקוסטיים מספקת כמה יתרונות בהשוואה לשיטות הבהרה ראשוניות מסורתיות, כמו צנטריפוגה וסינון, כגון טביעת רגל קטנה, סיכון זיהום נמוך והפחתת הסיכון לעכירות מסנן. מכיוון שהפרדת גלים אקוסטיים מספקת זרימה רציפה של חומר נטול תאים לתהליכי סינון וכרומטוגרפיה עוקבים, קיים פוטנציאל ליישומו בעיבוד ביולוגי מתמשך.כדי להכין את מפריד הגלים האקוסטיים, חבר את כבלי העכירות ליציאות שלהם וחבר את כבלי ה-BNC של החשמל בתא לחלק האחורי של מערכת מפריד הגלים האקוסטיים. הכנס את בדיקות העכירות למד העכירות ולבית המדחום והדק את הברגים. חבר את צינור ההזנה לכניסה של יציאת עכירות ההזנה באמצעות משאבת ההזנה.וחבר את צינור ה-y מהפלט של יציאת עכירות ההזנה ליציאת הכניסה של החדר האקוסטופורטי. חבר את צינור שלב 1 מיציאת הפסולת של התא האקוסטופורטי לכלי איסוף תאים באמצעות משאבת שלב 1, וחבר את הצינור מיציאת החלחול של החדר האקוסטופורטי לכניסה של יציאת העכירות של בדיקה 1. לאחר מכן, חבר את צינור הקציר מחוץ ליציאת העכירות של בדיקה 1 לכלי איסוף מוצרים.כדי למלא את המערכת בנוזל תרבית תאים שנקטף, הפעל את מפריד הגלים האקוסטי ופתח את התוכנה המשויכת. בחלונית Readings, לחץ על Start Test כדי להתחיל את הקלטת הנתונים. וחבר את קצה צינור ההזנה לכלי הנוזל של תרבית התאים שנקטף שמערבבים.כדי להפעיל את משאבת ההזנה, הזן את קצב המשאבה ולחץ על Enter. ודא שחץ כיוון המשאבה מכוון כהלכה כדי להבטיח שנוזל התא נשאב מהכלי לתוך התא האקוסטופורטי, ולחץ על סמל המשולש כדי להתחיל. עקוב אחר מדידות עכירות ההזנה בלוח הפחתת האחוזים במהלך מילוי התא הקוסטופורטי.אם נוזל תרבית התאים שנקטף מעורבב מספיק בתוך כלי נוזל התא, ערכי העכירות יהיו עקביים במהלך העמסת החדר. ברגע שהנוזל נמצא מעל מתמר הפיזו בחלק האחורי של התא האקוסטופורטי, לחץ על כבה כדי לעצור את המשאבה. וחבר את הקצה השני של כבל החשמל BNC לתא האקוסטופורטי.לאחר מילוי והפעלת התא האקוסטופורטי, שנה את קצב משאבת ההזנה לקצב הפעולה הרצוי. כדי להפעיל את שלב 1 כוח פייזו, החלק את הסרגל במודול הכוח ל-10 וואט ולחץ על הפעל.ברגע שהתאים מתחילים להתיישב בתחתית התא האקוסטופורטי, הפעל את משאבת שלב 1 עם קצב מתאים המבוסס על צפיפות התא וקצב משאבת ההזנה, תוך צפייה מקרוב בתאי מפריד הגלים האקוסטיים והתאמת קצבי המשאבה לפי הצורך. כדי לחשב את מסת התא הארוז, יש למשוך משקל עם צינור ריק של 15 מיליליטר ומלא את הצינור בחומר הזנה.לאחר רישום המשקל הכולל של הצינור עם הזנה, צנטריפוגה את הצינור ושפכו את הסופרנטנט למיכל חדש. מדוד את משקל הצינור עם גלולת התא. לאחר מכן, עקוב אחר פרופיל העכירות של עכירות שלב 1 כאשר ההצפה מהתא האקוסטופורטי נכנסת לבדיקת העכירות 1.בסיום הריצה, הפסק את ההזנה ואת משאבות ה-stage 1, וכבה את החשמל לתא. נתק את כבל החשמל BNC ואסוף את חומר קציר המוצר לניתוח במורד הזרם. כדי לנקז את הנוזל שנותר מהתא האקוסטופורטי, הנח את צינורות הפסולת לכלי ריק.נתק את הצינור מכניסת התא האקוסטופורטי וחלחל ליציאות, ושחרר את צינור הפסולת מראש המשאבה. כאשר התא ריק, חבר מחדש את הצינור, הכנס את צינור הפסולת בחזרה לראש המשאבה, והשתמש בהזנה ושלב 1 קצב משאבה של 60 מיליליטר לדקה כדי לשטוף מים נטולי יונים מקצה צינורות ההזנה למשך 15 עד 20 דקות. בתום שטיפת המים, יש לשאוב 70% אלכוהול איזופרופיל דרך הצינור והתא למשך 15 עד 20 דקות, ולאחר מכן שטיפת מים נטולת יונים נוספת של 15 עד 20 דקות.בניתוח מייצג זה, כאשר נוזל התא שנקטף נכנס לתא מפריד הגלים האקוסטיים, מדידות העכירות מבדיקת עכירות ההזנה נותרו עקביות, בסביבות 1000 עד 1100 NTU. והמדידות מבדיקת העכירות של בדיקה 1 נותרו בסביבות 40 עד 50 NTU. שמירת נוזל התא שנקטף בתוך החדר לפרקי זמן ארוכים יותר גורמת לעליית טמפרטורה, כמו בדוגמה זו של הפרש טמפרטורה גדול משש מעלות צלזיוס של נוזל התא שנקטף לפני הכניסה לתא האקוסטופורטי ולאחר הפרדה אקוסטית.שיקול חשוב נוסף בעת הפעלת קציר צפיפות תאים גבוהה הוא הרוויה של בדיקות העכירות, שכן מדידות העכירות עבור בדיקת עכירות ההזנה הופכות רוויות מעל 4600 NTU, מה שככל הנראה גורם להערכת חסר בחישוב יעילות הסרת התאים. בנוסף, יעילות הסרת התאים יורדת משמעותית מכ-100% ל-57% ככל שקצב משאבת ההזנה גדל, כאשר קצב משאבת הזנה איטי יותר בדרך כלל נמצא בקורלציה ישירה עם הבהרת תאים טובה יותר. ככל שיצרני מוצרי ביוטכנולוגיה נעים לעבר ייצור מתמשך, לשימוש בטכנולוגיית גלים אקוסטיים עשויים להיות יישומים נוספים לעיבוד ביולוגי רציף ופעולות ביו-ריאקטור שפע.

primary-clarification-cho-harvested-cell-culture-fluid-using-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

סרטון זה מתאר שיטה להפרדה מרחבית של שלוש תת-אוכלוסיות של תאים לוקמיים: תאי לוקמיה מרחפים המרחפים בחופשיות במדיה, תאי לוקמיה בהירי פאזה שנצמדו לפני השטח של חד-שכבה של תאי סטרומה מזנכימליים, ותאי לוקמיה עמומים בפאזה שנדדו מתחת לחד-שכבה של תאי סטרומה מזנכימליים מתרבית דו-ממדית.

קציר תת-אוכלוסיות לוקמי: שיטה להפרדה מרחבית של תת-אוכלוסיות תאים לוקמיים מתרבית משותפת דו-ממדית

מקור: Choi, H. J., et al. אקוסטופורזיס מיקרופלואידית להפרדת זרימה של חיידקים גראם-שליליים באמצעות חרוזי זיקה של אפטמר. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את השיטה של הפרדה סלקטיבית של חיידקים גראם-שליליים מדגימת חיידקים מעורבת באמצעות מיקרו-חרוזים מצופים אפטמר וכוחות אקוסטיים בתוך שבב מיקרופלואידי.

אקוסטופורזה בסיוע אפטמר להפרדה מיקרופלואידית של חיידקים גראם-שליליים

פרוטוקול זה מתאר ארכיטקטורת מערכת לביצוע הפרדות חלקיקים אוטומטיות בנפח קטן (0.15-1.5 מ"ל) באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, ודן בשיטות לייעול הביצועים והתפעול של מכשיר אקוסטופלואידי.

פלטפורמת microfluidic לעיבוד מדגם Precision הקטן-נפח ושימוש בו לגודל חלקיקים הביולוגיים נפרדים עם Microdevice אקוסטי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות תאים בודדים עם פלטפורמה מיקרופלואידית, המשתמשת בתפיסת עיצוב מיקרו-באר חדשה כדי לאפשר בידוד תא בודד ביעילות גבוהה ותרבית משובטת לטווח ארוך.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של אסטרטגיית מיקרופלואידיקה מבוסס אינרציאלית חיץ החליפין לטהר תאים מהונדסים מיקרו / ננו-חלקיקים עם דלדול יעיל של חלקיקים מאוגד.

Microfluidic מאגר Exchange להנדסת תאים ללא התערבות מיקרו / Nanoparticle

פציעות כבדות מלוות הרחבת תא ובתאים מייצגים אוכלוסייה הטרוגנית תא. סיווג רומן של תא הסלולר זה מאפשר הבחנה של תת מרובים. השיטה המתוארת כאן ממחישה את הזרימה cytometry ניתוח ובידוד טוהר גבוה של תת שונים שיכול לשמש מבחנים נוספים.

בידוד והעשרה של קבוצות משנה כבדים ובתאים המזוהים על ידי שילוב מרקר Surface Novel

פרוטוקול זה מתאר את השימוש elutriation צנטריפוגלי כדי להפריד בין תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרי לשלבים שונים של מחזור התא.

הכנה של תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרית בשלבים שונים של מחזור התא על ידי צנטריפוגלי Elutriation

מאמר זה מתאר את הייצור וההפעלה של שבבי אקוסטופורטי מיקרופלואידיים באמצעות טכניקת האקוסטופורזיס המיקרופלואידית ומיקרובים שעברו שינוי אפטאמר שיכולים לשמש לבידוד מהיר ויעיל של חיידקים גראם-שליליים ממדיום.

אקוסטופורזיס מיקרופלואידי להפרדת זרימה של חיידקים גראם-שליליים באמצעות חרוזי זיקה של אפטמר

הפרוטוקול כאן מדגים כי ניתן להפריד כראוי שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיה מותנית של תרביות תאים באמצעות כרומטוגרפיה של הרחקת גודל.

כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל להפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית תאים מותנית

למדו להשתמש במפריד אקוסטי להבהרה ראשונית של תרביות תאי CHO. שיטה זו מציעה יתרונות על פני שיטות מסורתיות כמו צנטריפוגה וסינון, כולל זיהום נמוך וזרימה רציפה לתהליכי ביופרוססינג מתמשכים.

הבהרה ראשונית של נוזל תרבית תאים שנקטפו על ידי CHO באמצעות מפריד אקוסטי

גלה סרטונים נוספים