הדמיה בזמן אמת של הגירה הנגרמת על ידי CCL5 של תאי גזע שלד Periosteal בעכברים

פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של נדידת תאי גזע שלד periosteal בתיווך CCL5 בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה תוך-וינטלית חיה של בעלי חיים.

ניתן להשתמש בפרוטוקול הסטנדרטי להערכת נדידת תאים אנדוגנית וניתן ליישם אותו על מספר סוגי תאים כמו גם פנוטיפים של השלד. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לעקוב אחר נדידת תאים in vivo עבור תאים בודדים ולא אוכלוסיית תאים בתגובה לפציעה ו/או טיפול בציטוקינים. לפני תחילת ההליך, יש לאשר חוסר תגובה לצביטה בבוהן בעכבר המורדם ולמרוח משחה על עיני החיה.

לאחר מכן, בצע חתך רוחבי, פחות מסנטימטר אחד מיד לאוזן ימין לכיוון האוזן השמאלית ובצע חתך שני מהחתך הראשוני, כשניים עד שלושה מילימטרים מעבר לעין ימין לכיוון האף. השתמש במלקחיים כדי להפריד את העור מהפריוסטאום והשתמש במספריים כדי לחתוך בעדינות את רקמת החיבור כדי להפריד את העור מהקלווריה פריוסטאום. בעזרת צמר גפן סטרילי, מרחו משחה עיניים על החלק העליון של דש העור וקפלו בעדינות את הדש מעל העין השמאלית.

יש לחשוף בבירור את הצומת של התפרים הסגיטלים והעטרה. שטפו את המשטח הפתוח עם PBS סטרילי כדי לנקות את האזור מכל דם ושאריות שיער והניחו את קצה השיפוע ברוחב מחט אחד עד שניים לכיוון האף מתפר העטרה ורוחב מחט אחד עד שניים מימין לתפר הסגיטלי. בעזרת כמות קטנה מאוד של לחץ כלפי מטה, סובב בזהירות את המזרק עם כיוון השעון פעם אחת ונגד כיוון השעון מספר פעמים.

לאחר מכן השתמש במחט בגודל 27 כדי להרחיב את המיקרו-שבר לכ-40 מיקרומטר. אם נותרו שברי עצם, יש לשטוף את המיקרו-שבר עם PBS. אם עדיין נותרו שברי עצם, השתמש במחט בגודל 29 כדי לגרוף בעדינות את השברים.

לטיפול ב-CCL5, השתמש בתמיסת CCL5 של 100 ננוגרם למיליליטר ובמטריצת ממברנת הבסיס כדי לקבל תמיסה כימית עובדת של 10 ננוגרם למיליליטר. כדי לטפל בפציעה, טען פיפטה של 220 מיקרוליטר עם חמישה מיקרוליטר מהתמיסה ומרח שני מיקרוליטר של הכימוקין על התפר. לאחר מכן אפשר למטריצה להתמצק וכסה בעדינות את הקלווריה עם דש העור כדי להבטיח שהרקמה לא תתייבש במהלך טיפול הכימוקין בן שעה.

להדמיה תוך-חיונית של נדידת תאי גזע פריוסטאליים בזמן אמת, לפני העברת העכבר למיקרוסקופ, הפעל לחץ עדין על החלק האחורי של ראש העכבר כדי לבדוק את מישור הראייה של הקלבריה. אם המישור אינו מפולס, סובב בעדינות את ריסון העכבר שמאלה או ימינה כדי לכוונן את המיקום. לאחר מכן, כסו את כל הקלווריה בדש העור ב-2% מתיל צלולוז סטרילי במים והניחו את העכבר על שלב המיקרוסקופ הממונע של ציר XYZ.

בעזרת האור האפיפלואורסצנטי, יישר את העכבר כך שהוא פונה למיקרוסקופ ושהצטלבות התפרים העטרתיים והסגיטליים היא נקודת הייחוס המרכזית של השלב. לאחר מכן הנח מכסה זכוכית על אזור ההדמיה ובדוק שוב את היישור. להדמיית זמן-lapse של הנדידה אל התפר והחוצה ממנו, בחר עדשת טבילה במים בהגדלה נמוכה כדי לסרוק את הקלבריה.

רכוש תמונת ייחוס של צומת התפר הסגיטלי והעטרתי והשתמש באותות SHG ופלורסנט מהתאים, אתר כל אתר פגיעה ורשום את קואורדינטות ה-XYZ וכן את המרחקים מהתפרים הסגיטלים והעטרה. בחר מיקום על התפרים העטרתיים או הסגיטאליים להדמיה ארוכת טווח וקבל תמונת ZStack מפורטת של אזור זה מהתייחסות במהלך ההדמיה. השתמש בהגדרות תוכנת קיטועי הזמן כדי להקליט תמונה כל דקה למשך שעה אחת לפחות, תוך השוואה בין שדה הראייה הנוכחי לשדה הראייה ההתחלתי בזמן שבין התמונות.

אם שדות הראייה שונים, השתמש בתמונת ZStack כדי לקבוע לאיזה כיוון יש לכוונן את שדה הראייה. לאחרונה נוצרו עכברים מדווחים Mx1 עגבניות אלפא-SMA GFP שבהם תאי גזע שלד פריוסטאליים מסומנים על ידי תיוג כפול חיובי Mx1 אלפא-SMA חיובי. נדידת תאי גזע פריוסטאלית חיובית ל-Mx1 נצפתה במהלך תקופה של שעה אחת של הדמיה, 24 שעות לאחר הנחת התפר.

הטיפול בכימוקין CCL5 בפגם בקלווריה 24 שעות לאחר הפציעה גורם לנדידה מובחנת כיוונית הרחק מהתפר העטרתי לעבר אתר הפציעה. בניתוח מייצג זה, תוך שעה אחת מההדמיה, אחד מתאי גזע השלד החיוביים ל-Mx1 נדד כ-50 מיקרומטר לכיוון הפציעה. ההיבט החשוב ביותר של פרוטוקול זה שיש לזכור הוא להגביל את הטיפול ב-CCL5 לאתר הפגיעה על מנת לעורר נדידה ספציפית לתא.

לאחר השלמת הליך זה, ניתן להמשיך בטיפול מקומי למשך שבוע אחד. ניתן להשתמש במיקרו CT כדי להעריך ריפוי פציעות קלווריה ושקיעת מינרלים.