Name: הדמיה בזמן אמת של הגירה הנגרמת על ידי CCL5 של תאי גזע שלד Periosteal בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: למדו מעקב בזמן אמת אחרי הגירת תאי גזע שלד פריאוסטאליים בתגובה ל-CCL5 בעכברים באמצעות מיקרוסקופיה אינטרוויטלית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור התנהגות תאים בודדים בגוף החי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מחלות העצמות של פרס טקסס, פרס קרן החוק קרוליין וויז, ואת NIAMS של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרס R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 ל- D.P.  אנו מודים ל- M.E. Dickinson ות.ג'יי וודאקאן בהדמיה אופטית BCM וליבת מיקרוסקופיה חיונית וליבות הטכנולוגיה המתקדמת BCM במימון NIH (AI036211, CA125123 ו- DK056338).
.

כל העכברים נשמרו בתנאים נטולי פתוגנים, וכל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מכללת ביילור לרפואה (IACUC).
1. הכנת עכבר
<ol><li>קרוס Mx1-Cre17 ו-Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (טום)18 עכברים (שנרכשו ממעבדת ג'קסון) עם עכברי αSMA-GFP (מסופקים כאן על ידי ד"ר איבו קלג'זיץ' והנרי קרוננברג) כדי ליצור עכברי Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) עכברים (איור 2A).</li>
	<li>עבור אינדוקציה Mx1-Cre, להזריק עכברים עם 25 מ"ג/ק"ג pIpC כל יומיים במשך 10 ימים.</li>
	<li>עכברים הקרנה עם 9.5 Gy יום אחד לפני השתלה תוך ורידי של 1 x 106 תאים מונונוקלאריים של מח עצם שלם מעכברי C57BL/6 מסוג בר (WT-BMT)19.</li>
	<li>לאחר 6 עד 8 שבועות של התאוששות, עכברי נושא להדמיית in vivo של פרוטוקול העברת תאים periosteal המתואר להלן. הערה: הקרנה ו- WT-BMT של עכברי Mx1-Cre נחוצים כדי לחסל תאים hematopoietic בשם Mx1 אנדוגני שעלולים להגיב לפציעה. שישה עד שמונה שבועות לאחר ההקרנה, ספירת התאים ההמטו-מואטיאטיים של המארח עומדת על <5% ולכן מוכנה להדמיה19.</li>
</ol>2. ריסון עכבר והרכבה הדמיה
<ol><li>צור ריסון עכבר באמצעות צינור חרוט 50 מ"ל (איור 1A).<ol>
<li>באמצעות מספריים מחודדים, לתקוע חור דרך החלק התחתון של החרוט. חותכים מהחור התחתון לחלק העליון של החרוט (הצד החתוך יהיה החלק העליון של האיפוק).</li>
		<li>בצעו חתך באורך של כ-4-5 ס"מ במקביל לחתך הקודם ובחצי הדרך למטה (כ-2 ס"מ) מראש האיפוק. הסר קטע זה של החרוט וחלק את הקצוות היו נחוצים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בנה הרכב הדמיה של צינור חרוט באמצעות צלחת זווית מתכווננת, עמוד אופטי בגודל 0.5 אינץ' ומהדק בזווית ישרה עבור עמוד בגודל 0.5 אינץ', "0.1875 Hex (איור 1B וטבלת חומרים).<ol>
<li>התאם את לוח הזווית לזווית של 35°. בצד שמאל של צלחת הזווית, בורג את ההודעה האופטית לתוך החור השני מהחלק האחורי של הצלחת.</li>
		<li>בצד ימין של הלוח המתכוונן, הכנס חורים 0.1875 אינץ' משושלים 0.25 אינץ' לחור השני מהחזית וחורים אחרונים על הצלחת. המהדק בזווית ישרה ישמש עם העמוד האופטי כדי לאבטח את ריסון העכבר החרוט במקום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הליך כירורגי טרום ניתוחי
<ol><li>הרדמה של עכבר<ol>
<li>לטיפול בכאב, הזריקו לעכבר באופן תת עורי בופרנורפין שחרור מתמשך (1 מ"ג/ק"ג ב"ג) 30-60 דקות לפני הניתוח.</li>
		<li>עכברי מורדמים באמצעות שילוב CCM מכרסם III (משולב III) הרדמה המכילה 37.5 מ"ג / מ"ל קטמין, 1.9 מ"ג / מ"ל קסילאסין, ו 0.37 מ"ג / מ"ל acepromazine. המינון המתאים לעכברים הוא 0.75-1.50 מ"ל לכל 1 ק"ג של משקל גוף. המינון יימשך 30-45 דקות.</li>
		<li>לאחר העכבר הוא מרדים, להחיל משחה עיניים על העיניים עם צמר גפן סטרילי כדי למנוע התייבשות העין.</li>
		<li>להדמיה ארוכת טווח (>45 דקות), יש לבצע הרדמה שוב כדי לשמור על עומק הרדמה תקין כדלקמן.<ol>
<li>הכן מזרק 1 מ"ל עם כמות מספקת של משולב III כדי לשמור על הרדמה למשך ההדמיה המתוכננת (0.75 מ"ל / קילוגרם BW לכל 30 דקות של סם נוסף). חברו 25 גרם עירוי מחט פרפר עם צינורות בגודל 12 אינץ' למזרק ודחוף חומר הרדמה דרך הצינורות והמחט.</li>
			<li>הכנס את מחט הפרפר תוך-איטרא-איטרהוני, ואז תדביק את המחט במקומה. הערה: כך ינוהל המשולבת הנוספת III במהלך ההדמיה כך שאין צורך להזיז את החיה או לשבש את מישור הראייה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ספק תמיכה תרמית עם כרית חימום שנשמרה ב 37°C לאורך כל ההליך. להדמיה ממושכת (>1 שעות) יהיה צורך בתמיכה נוספת בנוזלים.  נוזלים משלימים ניתן לספק I.P. עם Combo III נוסף במהלך הדמיה או 33 מ"ל / קילוגרם מלוחים (0.9 NaCl) תת עורית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ריסון העכבר והכנת האתר הכירורגי<ol>
<li>השתמש קוצץ כדי להסיר שיער רב ככל האפשר מהחלק העליון של הראש. יש למרוח קרם דפילטורי על האזור המגולח כדי להסיר את כל השיער שנותר באתר הניתוח.</li>
		<li>ודא שהעכבר הוא מרדים לחלוטין על ידי חוסר תגובה צביטות בוהן. לאחר 15 דקות, אם העכבר אינו מרדים לחלוטין, לנהל מנה קטנה שנייה של משולב III (<0.75 מ"ל / קילוגרם BW).</li>
		<li>מניחים את העכבר בזנב האיפוק תחילה, מחליקים אותו מספיק אחורה כך שהאף תלוי מעט על קצה החרוט.</li>
		<li>הדביק את כפות הרגליים הקדמיות לתחתית הצינור החרוט באמצעות סרט רפואי.</li>
		<li>הניחו צינור חרוט עם עכבר על הרכב הדמיה המוגדר בזווית של 35° ומאובטח באמצעות המהדק בזווית ישרה (איור 1C).</li>
		<li>ברגע שהעכבר מאובטח בהר ההדמיה, נקה את האתר הכירורגי 3x עם סקראבס לסירוגין של קרצוף בטדין ו-70% אלכוהול איזופרופיל. שוב, בדוק שהחיה מסוממת לחלוטין.</li>
		<li>הזז את העכבר למשטח סופג נקי והצב וילון מעל העכבר כדי ליצור שדה סטרילי גדול.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הליך כירורגי
<ol><li>פתיחה של חתכים<ol>
<li>בעזרת מלקחיים עדינים, יש לאסוף את העור מיד לאוזן ימין. עם מספריים מיקרו-חיתול, לחתוך את העור מוחזק על ידי המלקחיים. הערה: ייזום ההסתעפות בשיטה המתוארת לעיל יוצר עיגול מעוגל המתאים יותר לתפירה לאחר ההליך.</li>
		<li>בצע חתך רוחבי החל מהחתירה הראשונית לכיוון האוזן השמאלית (<1 ס"מ).  לעשות חתך נוסף, החל מהחתירה הראשונית, לכיוון האף של החיה (~ 2-3 מ"מ מעבר לעין ימין).</li>
		<li>להפריד את העור מן periosteum באמצעות מלקחיים ומספריים לחתוך בעדינות דרך רקמת החיבור המפרידה את העור מן calvaria periosteum.</li>
		<li>באמצעות ספוגית כותנה סטרילית, להחיל משחה עיניים על החלק העליון של דש העור.  הרימו בעדינות את דש העור וקיפלו אותו מעל העין השמאלית. ההצטלבות של התפרים הקשתים והקורונה צריכה להיחשף בבירור (איור 1E). הערה: משחת עיניים משמשת כדי לשמור על דש העור במקום.</li>
		<li>לשטוף את המשטח הפתוח עם PBS סטרילי כדי לנקות את האזור של כל דם ושיער שיורית. הערה: במידת הצורך, יש להשתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר שערות שנותרו לאחר שטיפה, אך היזהרו שלא לפגוע בפריוסטיום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שבירה זעירה<ol>
<li>כדי ליצור שברים זעירים על calvaria, להסיר את הבוכנה של מזרק אינסולין 29 גרם לחתוך את הקצה האחורי של המזרק, סביב 300-400 סימני uL. הערה: שלב זה מקל על התמרון תחת טווח ניתוח בעת הפקת הפציעה.</li>
		<li>הניחו את קצה שיפוע (רוחב מחט אחד עד שניים) לכיוון האף מתפר הקורונה ורוחב מחט אחד עד שניים מימין לתפר הקשת (איור 1E).</li>
		<li>סובבו בעדינות את המזרק בכיוון השעון, ואז נגד כיוון השעון מספר פעמים. הערה: בעכברים צעירים, יש צורך בכמות קטנה מאוד של לחץ כלפי מטה כדי ליצור שבר מיקרו מעגלי. היזהר לא לתת המחט לחדור למוח, כמו זה יגרום לדימום ולהפריע הדמיה.</li>
		<li>השתמש במחט 27 G כדי להרחיב את המיקרו-שבר לכ-0.4 מ"מ. אם שברי העצם נשארים בשבר הזעיר, שטפו את האזור עם PBS. אם שברי העצם עדיין נשארים בשבר הזעיר, השתמשו במחט 29 גרם כדי לגרוף אותם בעדינות.</li>
		<li>חזור על שלבים 4.2.1–4.2.4 כדי ליצור פציעה בצד שמאל של התפר הסגיטלי. הערה: בשלב זה, ישנן שתי אפשרויות: 1) המשך מיד לטיפול CCL5 (סעיף 4.3) והדמיה (סעיף 5); או 2) לסגור את האתר הכירורגי בעקבות הניתוחים שלאחר הניתוח בסעיף 6. בשעה 24 שעות מאוחר יותר, להרדים את העכבר שוב, לפתוח מחדש את המראה הכירורגי, לטפל בפציעה עם CCL5 (סעיף 4.3), ולבצע הדמיה תוך-וינטלית (סעיף 5) וטיפול לאחר הניתוח (סעיף 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>טיפול CCL5<ol>
<li>מתוך מלאי של RANTES (100 ננוגרם / מ"ל), להפוך פתרון של 10 ננוגרם / מ"ל באמצעות מטריצת קרום המרתף (טבלת חומרים). שמור את הפתרון הזה על קרח כדי לשמור על המטריצה בצורה נוזלית.</li>
		<li>לטפל בכל פציעה עם 2 μL של CCL5 (10 ng/ μL) באמצעות 2-20 μL pipette (קצה פיפטה זה יש קוטר גדול יותר, וזה יעיל יותר בעת שימוש בנוזל צמיג). אפשר למטריצה להתגבש.</li>
		<li>לאחר המטריצה התגבשה, לכסות בעדינות את הקלבריה עם דש העור כדי להבטיח את הרקמה לא להתייבש. דגירה במשך שעה אחת לפני ההדמיה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. הדמיה תוך-ויאלית
<ol><li>הגדרות מיקרוסקופ<ol>
<li>הפעל את הלייזר המולטי-פוטוני (לייזר טיטניום-ספיר פמטו-שניות). הגדר את אורך הגל ל- 880 ננומטר והתאם את העוצמה להדמיית הדור ההרמוני השני (SHG) (440 ננומטר) של העצם.</li>
		<li>הפעל את לייזרי מצב מוצק 488 ננומטר ו 561 ננומטר עבור עירור של תאים GFP- ו tdTomato מבטאים, בהתאמה.</li>
		<li>הפעל גלאי PMT (פוטומוליפלייר) עבור הדור ההרמוני השני (זיהוי 405-455 ננומטר) ו- GFP (זיהוי 505-550 ננומטר). הפעל את גלאי HyD 3 לעגבניות (זיהוי 590-620 ננומטר).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הרכבה<ol>
<li>לפני העברת העכבר לטווח, בדוק את המישור החזותי של הקלבריה על-ידי לחיצה עדינה על החלק האחורי של ראש העכבר. אם המישור אינו מאוזן, התאם את המיקום על-ידי סיבוב עדין של ריסון העכבר שמאלה או ימינה. הערה: זהו צעד קריטי כדי להבטיח איכות תמונה מספקת.</li>
		<li>יש למרוח סטרילי 2% מתיל צלולוז במים (w/v) כדי לכסות את כל הקלבריה ואת דש העור ולמנוע ייבוש של הרקמה.</li>
		<li>מקם את העכבר על שלב המיקרוסקופ הממונע בציר XYZ (איור 1G). באמצעות האור האפיפלואורסצנטי, יישר את העכבר כך 1) הוא פונה למיקרוסקופ ו -2) הצומת של התפרים קורונליים וזרעיים היא נקודת ההתייחסות המרכזית של הבמה.</li>
		<li>הניחו את כיסוי הזכוכית באזור ההדמיה ובדקו שוב את היישור (איור 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הדמיה לשגות זמן<ol>
<li>השתמש בעדשת הגדלה נמוכה (יעד טבילת מים 25x עם NA = 0.95) כדי לסרוק את הקלבריה. רכשו תמונת התייחסות של צומת התפר הקשת והקורונל.</li>
		<li>בעזרת אותות SHG ופלואורסצנטיים מהתאים, אתר כל מראה פציעה ותיעד את קואורדינטות XYZ, כמו גם את המרחקים מהתפרים הקשים והקורונליים (איור 2B).</li>
		<li>בחר מיקום על התפרים קורונליים או קשתיים להדמיה ארוכת טווח. קח תמונת Z-stack מפורטת של אזור זה מההפניה במהלך ההדמיה. הערה: מכיוון התפרים מייצגים נישה ידועה P-SSC, זה המקום שבו התאים יהיו נודדים בתגובה לפציעת calvaria.</li>
		<li>השתמש בהגדרות התוכנה של זמן לשגות כדי להקליט תמונה כל דקה אחת לפחות שעה. בזמן שבין תמונות, השווה את שדה התצוגה הנוכחי לשדה התצוגה ההתחלתי. אם הם שונים, השתמש בתמונת מחסנית Z כדי לקבוע לאיזה כיוון יש להתאים את שדה הראייה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. טיפול בבעלי חיים לאחר הניתוח
<ol><li>לאחר הדמיה, לשטוף את calvaria חשוף עם PBS סטרילי כדי להסיר את methylcellulose.</li>
	<li>כדי לסגור את ההסתעפות, מניחים בעדינות את דש העור מעל הקלבריה. השתמש דגימות כותנה סטריליות כדי להסיר משחה עיניים שיורית ולייבש את אתר ההסתה.</li>
	<li>באמצעות ניילון monofilament 5-0 גודל תפרים שאינם ניתנים לעריבה עם מחט חיתוך הפוך C-1 מחובר, לסגור את האתר הכירורגי. השתמש ספוגית כותנה סטרילית כדי להחיל משחה אנטיביוטית משולשת על הסגירה. הערה: הצלקות מופחתות עם טכניקות תפירה באיכות גבוהה ודימום מינימלי.</li>
	<li>מניחים את העכבר בכלוב נקי על משטח חם ולבדוק כל 15 דקות עד recumbency החזה מושגת.</li>
	<li>לתת מנה שנייה של בופרנורפין שחרור מתמשך 72 שעות לאחר הניתוח.</li>
	<li>יש לנטר מדי יום התנהגות מצטופפת, פרווה וולאנים ו/או חוסר אמביציה עד להסרת תפרים (כשבוע אחד).</li>
</ol>

<ol><li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+healing%3A+mechanisms+and+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periosteal+cells+are+a+major+source+of+soft+callus+in+bone+fracture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture.</a> Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).</li>
<li>Colnot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+cell+fate+decisions+within+periosteum+and+bone+marrow+during+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).</li>
<li>Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+periosteum+for+skeletal+regeneration%3A+the+stem+cell+that+lies+beneath%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath.</a> Bone. 70, 10-18 (2015).</li>
<li>Duchamp de Lageneste, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periosteum+contains+skeletal+stem+cells+with+high+bone+regenerative+potential+controlled+by+Periostin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin.</a> Nature Communications. 9 (1), 773(2018).</li>
<li>Olivos-Meza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+periosteum+with+TGF-beta1+in+situ+enhances+the+quality+of+osteochondral+tissue+regenerated+from+transplanted+periosteal+grafts+in+adult+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).</li>
<li>Debnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+periosteal+stem+cell+mediating+intramembranous+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation.</a> Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).</li>
<li>Ransom, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axin2-expressing+cells+execute+regeneration+after+skeletal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury.</a> Scientific Reports. 6, 36524(2016).</li>
<li>Ouyang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prx1+and+3.2kb+Col1a1+promoters+target+distinct+bone+cell+populations+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice.</a> Bone. 58, 136-145 (2013).</li>
<li>Wilk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+Calvarial+Skeletal+Stem+Cells+Expressing+PRX1+Reside+Exclusively+in+the+Calvarial+Sutures+and+Are+Required+for+Bone+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).</li>
<li>Ortinau, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Functionally+Distinct+Mx1%2BalphaSMA%2B+Periosteal+Skeletal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).</li>
<li>Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+gene+expression+identifies+distinct+molecular+signatures+of+bone+marrow-+and+periosteal-skeletal+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 13 (1), 0190909(2018).</li>
<li>Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+remodeling+during+fracture+repair%3A+The+cellular+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+identifies+osteogenic+progenitors+for+bone+formation+and+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).</li>
<li>Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin-receptor-expressing+mesenchymal+stromal+cells+represent+the+main+source+of+bone+formed+by+adult+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li>
<li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).</li>
<li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+bone+marrow+MSCs+are+dynamic%2C+fate-restricted+participants+in+bone+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).</li>
<li>Nitzsche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+MSC+Adhesion+Cascade-Insights+into+Homing+and+Transendothelial+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration.</a> Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).</li>
<li>Adler, J., Pagakis, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+image+distortions+due+to+temperature-related+microscope+stage+drift%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift.</a> Journal of Microscopy. 210, Pt 2 131-137 (2003).</li>
<li>Roberts, S. J., Ke, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anabolic+Strategies+to+Augment+Bone+Fracture+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing.</a> Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).</li>
</ol>

L.C.O. ו- D.P. לחשוף פטנט תלוי ועומד שכותרתו "תאי גזע שלד Periosteal בתיקון עצם" (BAYM. P0264US. פ1). המחברים הנותרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

במהלך ריפוי העצם, תאי periosteal הם המקור העיקרי של כונדרוציטים מובחנים חדשים אוסטאובלסטים בתוך יבלת פציעה3. בדומה מוח עצם, SSCs osteogenic / chondrogenic זוהו גם periosteum4,5,6. הערכת מאפיינים פונקציונליים P-SSC אנדוגני הוא מאתגר מבחינה טכנית. לעתים קרובות, דינמיקה נודדת של SSCs מוערכים במבחנה, מה שהופך את הפרשנות של מערכות vivo המקבילות שלהם מאתגר. בשל ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופיה תוך-וינטלית של בעלי ...

תיקון שבר הוא תהליך דינמי, רב תאי, השונה מהתפתחות השלד העוברי ושיפוץ. במהלך תהליך זה, אינדוקציה של אותות פגיעה מרקמה פגומה מלווה גיוס מהיר, התפשטות, ובידול לאחר מכן של תאי גזע שלד / אבות, אשר כולם קריטיים ליציבות הכוללת קיבוע של שברים1. בפרט, שלבים מוקדמים של ריפוי שבר דורשים היווצרות קדנציה רכה, המיוחסת בעיקר לתאים תושב periosteal2. כאשר העצמות נפגעות, תת-קבוצה של תאי פריוסטאלי מגיבים במהירות ותורמים לסחוסים מובחנים חדשים ומתווכים אוסטאובלסטים בתוך היבלת3, מה שמסבך את נוכחותה של אוכלוסיית תאי גזע שלד/אבות מובהקת בתוך periosteum. לכן, הזיהוי והאפיון התפקודי של תאי גזע השלד (SSCs) המקומיים פריוסטאום מהווים גישה טיפולית מבטיחה למחלות עצם ניווניות ופגמים בעצמות4.
SSCs נחשבים להתגורר במקומות רקמות מרובים, כולל מח העצם. בדומה מוח עצם, SSCs osteogenic / chondrogenic זוהו גם periosteum4,5,6.  אלה pc periosteal (P-SSCs) ניתן לתייג עם סמני שושלת מזנכימלית מוקדמת (כלומר, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7, ו Axin2-CreER8) במהלך התפתחות עצם עובר4,7,8,9,10. מגבלה משמעותית של מודלים אלה של מעקב אחר שושלת גנטית אחת היא שיש הטרוגניות משמעותית באוכלוסיות תאים מסומנות. יתר על כן, הם לא יכולים להבחין SSCs מתויגים מן צאצאיהם ב vivo. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פיתחנו לאחרונה עכבר כתב כפול (Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) כדי לדמיין באופן ברור P-SSCs מ- SSCs מח עצם (BM-SSCs)11. עם דגם זה, נקבע כי P-SSCs מסומנים על ידי Mx1 + αSMA + תיוג כפול, בעוד תאים Mx1 + מובחנים יותר שוכנים במח העצם, משטחים אנדוסטאליים ופריוסטיליים, ועצמות קליפת המוח והטראבולר11,12.
ציטוקינים מרובים וגורמי גדילה ידועים לווסת שיפוץ ותיקון עצם נבדקו עבור שיפור של תיקון שלד פגמים מגזר קריטי1,13. עם זאת, בשל המורכבות התאית של מודלים פגיעה שנוצר באמצעות שיבוש המחסום הפיזי של תא העצם, ההשפעות הישירות של מולקולות אלה על נדידת P-SSC אנדוגני והפעלה במהלך הריפוי אינם ברורים. המאפיינים התפקודיים ודינמיקת הנדידה של SSCs מוערכים לעתים קרובות במבחנה על ידי ביצוע בדיקות טרנסוול או שריטה, בשילוב עם ציטוקינים או גורמי גדילה הידועים כמזינים הגירה באוכלוסיות תאים אחרות. לכן, פרשנות של תוצאות אלה ניסויים במבחנה ליישום במערכות vivo המקבילות שלהם הוא מאתגר. נכון לעכשיו, בהערכת vivo של נדידת גזע שלד / אבות לא נצפתה בדרך כלל בזמן אמת; במקום זאת, הוא נמדד בנקודות זמן קבועות לאחר שבר5,7,14,15,16.
מגבלה של שיטה זו היא שההעברה אינה מוערכת ברמה של תא בודד; במקום זאת, הוא נמדד באמצעות שינויים באוכלוסיות התאים. בשל ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופיה תוך-וינטלית של בעלי חיים חיים ויצירת עכברי כתבים נוספים, מעקב ויוו אחר תאים בודדים אפשרי כעת. באמצעות מיקרוסקופיה תוך-ויאלית חיה של בעלי חיים, ראינו את הנדידה המובהקת של P-SSCs מנישת התפר קלבריה לפגיעה בעצמות בתוך 24-48 שעות לאחר פגיעה בעכברים Mx1/Tomato/αSMA-GFP.
CCL5/CCR5 זוהה לאחרונה כמנגנון רגולטורי המשפיע על גיוס והפעלה P-SSCs במהלך התגובה לפציעה מוקדמת. מעניין, לא היה זיהוי של הגירה P-SSC משמעותית בתגובה לפציעה בזמן אמת. עם זאת, טיפול בפציעה עם CCL5 מייצר הגירה חזקה ומובהקת לכיוון של P-SSCs, אשר ניתן ללכוד בזמן אמת. לכן, מטרת פרוטוקול זה היא לספק מתודולוגיה מפורטת להקלטת נדידת in vivo של P-SSCs בזמן אמת לאחר הטיפול עם CCL5.

<table><tbody><tr><td>&frac12; &rdquo; פוסט אופטי</td><td>ThorLabs</td><td>TR2</td><td>להדמיה הר</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27G מחט</td><td>BD PercisionGlide</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>29G מזרק אינסולין</td><td>McKesson</td><td>102-SN05C905P</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור קוניקול</td><td>פלקון</td><td>352098</td><td>לריסון עכבר</td></tr><tr><td>צלחת זווית מתכווננת</td><td>Renishaw</td><td>R-PCA-5023-50-20</td><td>לתושבת הדמיה</td></tr><tr><td>מגבוני אלכוהול</td><td>Coviden</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>betadine פילינג כירורגי</td><td>הנרי שן</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>בופרנורפין SR-LAB</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>1 מ"ג/מ"ל משולבת שחרור מושהה</td></tr><tr><td>III</td><td>מתקבל מהווטרינר הצוות</td><td>N/A</td><td>37.6 מ"ג/מ"ל קטמין; 1.9 מ"ג/מ"ל קסילזין; 0.37 מ"ג/מ"ל אצפרונאזין</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-545-87</td><td>24 x 40 פרימיום superslip</td></tr> קצה <tr><td>עדין forcepts</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>קטמין</td><td>KetaVed</td><td>50989-161-06</td><td>100 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8MP עם DM6000CFS</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>R & D Systems</td><td>344500101</td><td></td></tr><tr><td>סרט רפואי</td><td>McKesson</td><td>100199</td><td>3 אינץ' x 10 יארד (7.6 ס"מ x 9.1 מ')</td></tr> <tr><td>מתוצלולוזה</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי</td><td>19560</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרודיסקציה</td><td>FST</td><td>1456-12</td><td></td></tr><tr><td>שלב ממונע</td><td>אוטומציה אנהיים</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>תפרים בלתי נספגים</td><td>McKesson</td><td>S913BX</td><td>מונופילמנט ניילון 5-0 תפרים בלתי נספגים עם מחט חיתוך הפוכה C-1 מחוברת</td></tr><tr><td>משחה אופטלמית</td><td>רוגבי</td><td>0536-1086-91</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>Biolegend</td><td>594202</td><td>10 ומיקרו; גרם/50 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>מהדק זווית ישרה עבור &frac12; &rdquo; עמוד, 3/16 אינץ' Hex</td><td>ThorLabs</td><td>RA90</td><td>עבור תושבת הדמיה</td></tr><tr><td>קפיצית 3/16 אינץ' נעילת משושה ו-frac14; &rdquo; בורג אגודל</td><td>ThorLabs</td><td>TS25H</td><td>לתושבת הדמיה</td></tr><tr><td>צמר גפן סטרילי</td><td>הנרי שן</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>DPBS סטרילי (1x)</td> <td>קורנינג</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>וילונות סטריליים</td><td>McKessen</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>כפפות כירורגיות</td><td>McKessen</td><td>3158VA</td> משחה אנטיביוטית משולשת <td></td></tr><tr><td></td><td>Taro Pharmaceuticals ארה"ב, בע"מ </td><td>51672-2120-2</td><td></td></tr><tr><td>סט איסוף דם ואקוטיינר</td><td>BD</td><td>REF 367298</td><td>25G סט עירוי מחט פרפר עם צינורות 12 אינץ'</td></tr></tbody></table>

הדמיה בזמן אמת של הגירה הנגרמת על ידי ccl5 של תאי גזע שלד periosteal בעכברים

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

תאי גזע שלד periosteal (P-SSCs) חיוניים לתחזוקה ותיקון עצם לכל החיים, מה שהופך אותם למוקד אידיאלי לפיתוח טיפולים כדי לשפר את ריפוי שבר.  תאי periosteal במהירות נודדים לפציעה כדי לספק כונדרוציטים חדשים osteoblasts לריפוי שבר. באופן מסורתי, היעילות של ציטוקינים כדי לגרום לנדידת תאים נערכה רק במבחנה על ידי ביצוע transwell או שריטה. עם התקדמות במיקרוסקופיה תוך-וינטלית באמצעות עירור מולטי-פוטונים, לאחרונה התגלה כי 1) P-SSCs מבטאים את הגן הנודד CCR5 ו-2) טיפול בליגנד CCR5 המכונה CCL5 משפר את ריפוי השברים ואת ההעברה של מחשבי P-SSCs בתגובה ל- CCL5. תוצאות אלה נלכדו בזמן אמת. מתואר כאן פרוטוקול כדי לדמיין נדידת P-SSC מן נישה שלד תפר עגל (SSC) נישה כלפי פציעה לאחר טיפול עם CCL5. הפרוטוקול מפרט את בנייתו של ריסון עכבר והר הדמיה, הכנה כירורגית של קלבריה העכבר, אינדוקציה של פגם קלבריה, ורכישת הדמיה לשגות זמן.

אבות השלד הוצעו להיות בעלי פוטנציאל נודד או במחזור הדם20. לאחרונה, Mx1-Cre +Rosa26-עגבניות +α SMA-GFP+ (Mx1/עגבניות/αSMA-GFP) נוצרו עכברים כתב, שבו P-SSCs מסומנים על ידי Mx1 + α SMA + תיוג כפול (איור 2A, B). העברה משמעותית של Mx1+α SMA+ P-SSCs התרחשה מתוך mesenchyme תפר בתוך 24-48 שעות לאחר <sup ...

פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של נדידת תאי גזע שלד periosteal בתיווך CCL5 בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה תוך-וינטלית חיה של בעלי חיים.

הדמיה בזמן אמת של הגירה הנגרמת על ידי CCL5 של תאי גזע שלד Periosteal בעכברים

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

ניתן להשתמש בפרוטוקול הסטנדרטי להערכת נדידת תאים אנדוגנית וניתן ליישם אותו על מספר סוגי תאים כמו גם פנוטיפים של השלד. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לעקוב אחר נדידת תאים in vivo עבור תאים בודדים ולא אוכלוסיית תאים בתגובה לפציעה ו/או טיפול בציטוקינים. לפני תחילת ההליך, יש לאשר חוסר תגובה לצביטה בבוהן בעכבר המורדם ולמרוח משחה על עיני החיה.לאחר מכן, בצע חתך רוחבי, פחות מסנטימטר אחד מיד לאוזן ימין לכיוון האוזן השמאלית ובצע חתך שני מהחתך הראשוני, כשניים עד שלושה מילימטרים מעבר לעין ימין לכיוון האף. השתמש במלקחיים כדי להפריד את העור מהפריוסטאום והשתמש במספריים כדי לחתוך בעדינות את רקמת החיבור כדי להפריד את העור מהקלווריה פריוסטאום. בעזרת צמר גפן סטרילי, מרחו משחה עיניים על החלק העליון של דש העור וקפלו בעדינות את הדש מעל העין השמאלית.יש לחשוף בבירור את הצומת של התפרים הסגיטלים והעטרה. שטפו את המשטח הפתוח עם PBS סטרילי כדי לנקות את האזור מכל דם ושאריות שיער והניחו את קצה השיפוע ברוחב מחט אחד עד שניים לכיוון האף מתפר העטרה ורוחב מחט אחד עד שניים מימין לתפר הסגיטלי. בעזרת כמות קטנה מאוד של לחץ כלפי מטה, סובב בזהירות את המזרק עם כיוון השעון פעם אחת ונגד כיוון השעון מספר פעמים.לאחר מכן השתמש במחט בגודל 27 כדי להרחיב את המיקרו-שבר לכ-40 מיקרומטר. אם נותרו שברי עצם, יש לשטוף את המיקרו-שבר עם PBS. אם עדיין נותרו שברי עצם, השתמש במחט בגודל 29 כדי לגרוף בעדינות את השברים.לטיפול ב-CCL5, השתמש בתמיסת CCL5 של 100 ננוגרם למיליליטר ובמטריצת ממברנת הבסיס כדי לקבל תמיסה כימית עובדת של 10 ננוגרם למיליליטר. כדי לטפל בפציעה, טען פיפטה של 220 מיקרוליטר עם חמישה מיקרוליטר מהתמיסה ומרח שני מיקרוליטר של הכימוקין על התפר. לאחר מכן אפשר למטריצה להתמצק וכסה בעדינות את הקלווריה עם דש העור כדי להבטיח שהרקמה לא תתייבש במהלך טיפול הכימוקין בן שעה.להדמיה תוך-חיונית של נדידת תאי גזע פריוסטאליים בזמן אמת, לפני העברת העכבר למיקרוסקופ, הפעל לחץ עדין על החלק האחורי של ראש העכבר כדי לבדוק את מישור הראייה של הקלבריה. אם המישור אינו מפולס, סובב בעדינות את ריסון העכבר שמאלה או ימינה כדי לכוונן את המיקום. לאחר מכן, כסו את כל הקלווריה בדש העור ב-2% מתיל צלולוז סטרילי במים והניחו את העכבר על שלב המיקרוסקופ הממונע של ציר XYZ.בעזרת האור האפיפלואורסצנטי, יישר את העכבר כך שהוא פונה למיקרוסקופ ושהצטלבות התפרים העטרתיים והסגיטליים היא נקודת הייחוס המרכזית של השלב. לאחר מכן הנח מכסה זכוכית על אזור ההדמיה ובדוק שוב את היישור. להדמיית זמן-lapse של הנדידה אל התפר והחוצה ממנו, בחר עדשת טבילה במים בהגדלה נמוכה כדי לסרוק את הקלבריה.רכוש תמונת ייחוס של צומת התפר הסגיטלי והעטרתי והשתמש באותות SHG ופלורסנט מהתאים, אתר כל אתר פגיעה ורשום את קואורדינטות ה-XYZ וכן את המרחקים מהתפרים הסגיטלים והעטרה. בחר מיקום על התפרים העטרתיים או הסגיטאליים להדמיה ארוכת טווח וקבל תמונת ZStack מפורטת של אזור זה מהתייחסות במהלך ההדמיה. השתמש בהגדרות תוכנת קיטועי הזמן כדי להקליט תמונה כל דקה למשך שעה אחת לפחות, תוך השוואה בין שדה הראייה הנוכחי לשדה הראייה ההתחלתי בזמן שבין התמונות.אם שדות הראייה שונים, השתמש בתמונת ZStack כדי לקבוע לאיזה כיוון יש לכוונן את שדה הראייה. לאחרונה נוצרו עכברים מדווחים Mx1 עגבניות אלפא-SMA GFP שבהם תאי גזע שלד פריוסטאליים מסומנים על ידי תיוג כפול חיובי Mx1 אלפא-SMA חיובי. נדידת תאי גזע פריוסטאלית חיובית ל-Mx1 נצפתה במהלך תקופה של שעה אחת של הדמיה, 24 שעות לאחר הנחת התפר.הטיפול בכימוקין CCL5 בפגם בקלווריה 24 שעות לאחר הפציעה גורם לנדידה מובחנת כיוונית הרחק מהתפר העטרתי לעבר אתר הפציעה. בניתוח מייצג זה, תוך שעה אחת מההדמיה, אחד מתאי גזע השלד החיוביים ל-Mx1 נדד כ-50 מיקרומטר לכיוון הפציעה. ההיבט החשוב ביותר של פרוטוקול זה שיש לזכור הוא להגביל את הטיפול ב-CCL5 לאתר הפגיעה על מנת לעורר נדידה ספציפית לתא.לאחר השלמת הליך זה, ניתן להמשיך בטיפול מקומי למשך שבוע אחד. ניתן להשתמש במיקרו CT כדי להעריך ריפוי פציעות קלווריה ושקיעת מינרלים.

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מאמר זה מתאר רצף של אירועים אופטימיזציה עבור דימות multimodal של שתלי הסלולר מכרסם במוח באמצעות: (i) ביולומינציה vivo ו הדמיה באמצעות תהודה מגנטית, ו (ב) הודעה מורטם ניתוח היסטולוגית. השילוב בין שיטות הדמיה על חיה אחת מאפשר הערכה שתל נייד עם רגישות גבוהה רזולוציה, וספציפיות.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

מיקרוסקופיה Intravital של זרימת דם Cremaster העכבר מ 'מציעה ייחודית וסטנדרטיזציה גם במודל vivo לניתוח נדידת תאי גזע של מח עצם היקפי.

מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

מדידת כמותית של פונקצית אב עצם בריפוי שבר דורשת טכנולוגיית הדמיה סידורי ברזולוציה גבוהה. הנה, פרוטוקולים ניתנים לשימוש במיקרוסקופיה intravital ומעקב osteo שושלת ברצף תמונה ולכמת את ההגירה, השגשוג והתמיינות של תאי גזע / אב osteogenic אנדוגני בתהליך של תיקון שברים בעצמות.

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

הטבע של האינטראקציות בין תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs) ונישות מח עצם הוא הבין היטב. שינויי חומרה מותאם אישית ופרוטוקול רכישה רב שלבים לאפשר את השימוש בשני הפוטונים ומיקרוסקופיה confocal לתמונת vivo לשעבר HSPCs שכותרתו התביית בתוך אזורי מוח עצם, אינטראקציות מעקב ותנועה.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

מונוציטים הם מווסתים מרכזיים של חסינות מולדת וממלאים תפקיד קריטי בחידוש המערכת הפגוציטית החד-גרעינית ההיקפית ובמקרה של דלקת. כתב יד זה מתאר את הליך ההדמיה בזמן אמת של מח העצם של קלווריה של העכבר כדי לחקור את מנגנון הגיוס של המונוציטים.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

השרשה של שתלי עצם אוטולוגית ואלוגנאית מהווה קיבלה גישות לטיפול באובדן עצם craniofacial גדול. עם זאת, ההשפעה של הרכב שתל על יחסי הגומלין בין neovascularization, התמיינות תאים והיווצרות עצם לא ברורה. אנו מציגים פרוטוקול הדמיה multimodal נועד על מנת להבהיר את התלות ההדדית אנגיוגנזה-Osteogenesis בקרבת השתל.

טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה אופטית של צימוד Osteogenesis-אנגיוגנזה להערכת שילוב של Autografts עצם הגולגולת וAllografts

פרוטוקול זה מתאר דרך יעילה כדי לנטר את התא התמדה ואת biodistribution של האדם נגזר שומן בתאי גזע mesenchymal (haMSCs) על-ידי קרינה פלואורסצנטית מרחיקת אדום תיוג במודל חולדה דלקת מפרקים ניוונית (קואה) הברך באמצעות הזרקה תוך-מפרקיות (IA).

אין ויוו מעקב של האדם נגזר שומן בתאי גזע Mesenchymal במודל דלקת מפרקים ניוונית של הברך עכברוש עם קרום Lipophilic פלורסנט לצבוע

במחקר זה, אנו מציגים שיטת הדמיה בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להתבונן בתאים הנעים לכיוון רקמה פגומה על ידי דגירה ex vivo עם אפיתל שבלול המכיל את האיבר של קורטי.

הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי

עבודה זו מציגה עיבוד חדש פרוטוקול הדמיה לניתוח עבה, תלת ממדי ניתוח חתך המאפשר ניצול מלא של modocalities הדמיה confocal. פרוטוקול זה משמר אנטיגניות ומייצג מערכת חזקה לנתח היסטולוגיה העור וסוגים אחרים של רקמות אחרות.

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

למדו מעקב בזמן אמת אחרי הגירת תאי גזע שלד פריאוסטאליים בתגובה ל-CCL5 בעכברים באמצעות מיקרוסקופיה אינטרוויטלית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור התנהגות תאים בודדים בגוף החי.

הדמיה בזמן אמת של הגירה הנגרמת על ידי CCL5 של תאי גזע שלד Periosteal בעכברים

גלה סרטונים נוספים