Name: מחקר השפעות של עשן סיגריות על זיהום פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: חקור את השפעת עשן סיגריות על זיהום חיידקי Pseudomonas בתאי אפיתל ריאות באמצעות חילוץ עשן, הדבקה חיידקית ומדידת עומס חיידקי. שיטה זו מספקת גישה ברורה לחקר אינטראקציות בין עשן לחיידקים בביולוגיה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R01 מענקים HL125435 ו HL142997 (ל CZ).

1. הכנת CSE 100%
<ol><li>צייר 10 מ"ל של מדיה של תרבות תאים ללא סרום (DMEM/F12 עבור תאי BEAS-2B; אוויר אפיתל תא בסיס בינוני עבור תאי HSAEC) לתוך מזרק 60 מ"ל.</li>
	<li>חבר הפוך קצה פיפטה 1 מ"ל גזוז כראוי לתרסיס המזרק כמתאם להחזיק את הסיגריה (3R4F).</li>
	<li>הסר את המסנן של הסיגריה. חבר סיגריה לפטיפטי מתאם ובעצר את הסיגריה.</li>
	<li>משוך 40 מ"ל של אוויר המכיל עשן לתוך 10 מ"ל של מדיה ללא סרום. מערבבים את העשן עם המדיום על ידי רעד נמרצות (30 שניות לכל תיקו).</li>
	<li>חזור על שלב 1.4 על 11x ב ~ 7 דקות עד הסיגריה נשרף לחלוטין.</li>
	<li>לסנן את 10 מ"ל של מדיה מעושנת עם מסנן 0.22 μm כדי לא לכלול כל מיקרואורגניזמים וחלקיקים מסיסים. העברה לצינור סטרילי סגור. הכן את 100% CSE לא יותר מ- 30 דקות לפני ההסכם הבא.</li>
</ol>2. תרבות פסאודומונס
<ol><li>לחסן קפוא P. aeruginosa (זן PAO1) או P. פלואורסצן מיגולה (זן PAO143) לתוך מרק סטיטי (TSB) צלחת אגר לתרבות לילה ב 37 °C. הערה: כדי להשיג מספיק חיידקים לקולטה, להפיץ חיידקים רבים ככל האפשר על צלחת אגר TSB ככל האפשר.</li>
	<li>לאסוף מריחה חיידקית דגירה ב 20 מ"ל של TSB עם 5% של גליצטרול כמקור הפחמן.</li>
	<li>לנער את המתלים חיידקים ב אינקובטור 37 °C ב 200 סל"ד עבור 1 שעה עד OD600 ערך = 0.6. התראה: אין לתת למהירות הרעידות לעלות על 200 סל"ד. מהירויות רועדות גבוהות יותר עלולות לפגוע מורפולוגיה של פלאגלה חיידקים ולהשפיע על הפלישה חיידקים לתוך אפיטליה ריאות. כמו כן, להגביל את זמן הרעידות 1 שעות כדי להשיג חיידקים פולשניים מאוד. למדוד את ערך OD600 כדי להעריך את מספר החיידקים. OD600 = 1 מתאים ~ 109 מושבה יצירת יחידות (CFU)/mL.</li>
</ol>3. תרבות תאי אפיתל ריאות אנושיים וטיפול CSE
<ol><li>תרבות תאי BEAS-2B אנושיים במדיום HITES (500 מ"ל של DMEM/F12, 2.5 אינסולין מ"ג, 2.5 מ"ג transferrin, 2.5 מ"ג נתרן סלניט, 2.5 מ"ג transferrin, 10 μM הידרוקורטיזון, 10 μM β-estradiol, 10 mM HEPES, ו 2 mM L-גלוטמין) בתוספת עם 10% סרום מבקרים עובריים (FBS) כפי שתוארקודם לכן 24.</li>
	<li>תרבות תאי אפיתל דרכי הנשימה העיקריים של דרכי הנשימה (HSAEC) במדיום תרבות תאי האפיתל בדרכי הנשימה (500 מ"ל של תאי אוויר בינוני בסיס, 500 μg/mL HSA, 0.6 μM חומצה לינולאית, 0.6 μg/mL לציטין, 6 mM L-גלוטמין, 0.4% לחלץ P, 1.0 μM אפינפרין, 5 μg /mL transferrin, 10 nM T3, 1 μg/mL הידרוקורטיזון, rh EGF 5 ng/mL, ו 5 μg/mL rh אינסולין). דגירה התאים ב 37 °C ב 5% CO2.</li>
	<li>ניתוק התאים עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין במשך 5 דקות עד התאים להתנתק לחלוטין מתחתית הצלחת.</li>
	<li>להוסיף 10 מ"ל של HITES שלם מדיום כדי לנטרל טריפסין ולאסוף את התאים בצינור 15 מ"ל. צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס ב-300 x גרם למשך 5 דקות. התראה: בזהירות לפקח על הזמן לעיכול נסהפסין על ידי מיקרוסקופיה, כי עיכול יתר עלול לגרום למוות של תאים.</li>
	<li>בטל את supernatant וssuspend התאים ב 2 מ"ל של HITES בינוני עם 10% FBS.</li>
	<li>Pipette 10 μL של מתלה התא לעיל על הלוח ולהכניס אותו לתוך מונה תא אוטומטי כדי להשיג את הריכוז בתאים / מ"ל.</li>
	<li>צלחת BEAS-2B תאים בריכוז של 3 × 105 תאים / מ"ל לתוך 6 צלחות גם בנפח כולל של 2 מ"ל ב HITES בינוני בתוספת עם 10% של FBS לתרבות לילה.</li>
	<li>לטפל בתאים בכ 80% confluency, או 5 x 105 תאים / מ"ל, עם 4% CSE עבור 3 שעות. לפני טיפול CSE, לשנות את המדיום עם HITES בינוני עם 1% של FBS.</li>
</ol>4. זיהום חיידקי
<ol><li>הוסף P. aeruginosa או P. פלואורסצנים מיגולה (~ 1 ×10 7 CFU / מ"ל) לכל באר של תאים שטופלו CSE דגירה עבור 1 שעה ב 37 ° C ב 5% CO2.</li>
	<li>שאף את supernatants ולהחליף עם 2 מ"ל של HITES טרי בינוני לטיפול עם 4% CSE ו 100 μg / מ"ל gentamicin. הערה: Gentamicin משמש כי הוא אינו מסוגל לחדור קרום תאי אפיתל ריאות אנושיות. לכן, זה יכול להרוג את כל החיידקים במדיום אבל לא את אלה שפלשו לתאי אפיתל הריאה.</li>
	<li>לאחר 1 שעה של CSE / gentamicin טיפול ב 37 °C ב 5% CO2, לשאוף את supernatants ולשטוף את התאים 3x עם PBS לקביעת ריכוז חיידקים הבאים. הערה: כדי לאשר את החיידקים הפנימיים, תאים נגועים GFP תווית P. פלואורסצנים מיגולה נצפו תחת מיקרוסקופ פלורסנט.</li>
</ol>5. קביעת ריכוז חיידקים בשיטת צלחת הטיפה
<ol><li>כדי לקבוע עומס חיידקים בתאים נגועים בשיטת צלחת טיפה, לשטוף את התאים שטופלו gentamycin 2x עם 2 מ"ל של PBS קר.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של מאגר סיס תא (0.5% triton X-100 ב PBS) לכל באר.</li>
	<li>לדלל את התא המכיל את החיידקים הפנימיים בהדרגתי (1:10, 1:100, 1:1,000 ו- 1:10,000) עבור החיסונים הבאים לצלחת אגר TSB.</li>
	<li>לאחר 16 שעות של דגירה, להשיג את התוצאות של CFU על ידי ספירת המושבות חיידקים.</li>
</ol>6. RT-qPCR זיהוי של חיידקים 16S rRNA
<ol><li>לטפל בתאי אפיתל ריאות נגועיםפסאודומונס (~ 1 x 106 תאים / מ"ל) עם gentamycin כמתואר לעיל. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים 2x עם 2 מ"ל של PBS קר.</li>
	<li>מוסיפים 0.35 מ"ל של מאגר הליזה של גאנידיום תיוציאניאט לבאר של צלחת באר 6. לאסוף את התאים עם מגרד תא. פיפט lysate לתוך צינור microcentrifuge ולערבב בעדינות עם פיפטה.</li>
	<li>מוסיפים את אותו נפח (0.35 מ"ל) של אתנול טרי 70% לתוך lysate ומערבבים היטב. העבר את כל הדגימות לעמודת ספין הממוקמת בצינור אוסף של 2 מ"ל. צנטריפוגה ב- 10,000 x g עבור 30 s ב 20-25 ° C. לאחר מכן, מחק את המאגר בצינור האוסף.</li>
	<li>שטוף את העמודה עם 0.7 מ"ל של מאגר כביסה 1. צנטריפוגה בעמודה ב- 10,000 x g עבור 30 s. יש לשטוף את העמודה 2x עם 0.5 מ"ל של חוצץ כדי לשטוף את RNA מאוגד קרום. חזור על הצנטריפוגה ב- 10,000 x g למשך 2 דקות.</li>
	<li>מקם את העמודה בצינור קולקציה חדש של 1.5 מ"ל. מוסיפים 30-50 μL מים ללא תסה. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה אחת. לאסוף את הזרימה דרך למדוד את ריכוז RNA.</li>
	<li>בצע תגובת שעתוק הפוכה בהתאם לפרוטוקול היצרן. לערבב 1 μg של RNA הכולל עם 10 מ"ל של מאגר תגובה, 1 μL של תעתיק הפוך, ומים ללא RNase לתגובה 20 μL. לבצע את תגובת שעתוק הפוכה ב 37 ° C עבור 1 שעות ולאחר מכן 95 ° C במשך 5 דקות.</li>
	<li>לערבב יחד את תבניות cDNA (1 μL של כל תגובה שעתוק הפוך לעיל), 5 μL של תערובת מאסטר המכיל צבע SYBR, μL 1 של כל פריימרים ספציפיים 200 nM, ומים בתערובת 20 μL לניתוח PCR הבא, על פי המלצות היצרן. הערה: להלן פריימרים מיקוד 16S rRNA של P. aeruginosa: קדימה 5′-CAAAACTACTGAGCTAGAGAGAGCG-3′; הפוך 5′-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH שימש כפקד טעינה עם פריימרים הבאים: קדימה: 5′-GGCATGGACTGGTCATGA-3′; הפוך: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′.</li>
	<li>השתמש בשיטת CT השוואתית כדי לקבוע את הביטוי.</li>
</ol>7. זיהוי פסאודומונס פלורסנט עם ציתום זרימה
<ol><li>לטפל פלואורסצנט פסאודומונס -נגוע תאיאפיתל ריאות (~ 1 x 106 תאים / מ"ל) עם gentamycin כפי שתואר קודם לכן. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים 2x עם 2 מ"ל של PBS קר.</li>
	<li>נתח את הדגימות עם ציטומטר זרימה באורך גל של 509 ננומטר לזיהוי GFP. סיים כל קריאה ב-100,000 אישומים. נתח את הנתונים שנרכשו באמצעות תוכנה קשורה.</li>
</ol>

<ol><li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Strategy+for+the+Diagnosis%2C+Management%2C+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li>
<li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Care+Journal%22%5BJournal%5D)">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li>
<li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li>
<li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation%2C+Allergy%2C+Asthma+and+Other+Lung+Diseases%3A+A+Mechanistic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li>
<li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelated+role+of+cigarette+smoking%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li>
<li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li>
<li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+tobacco+use%3A+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li>
<li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Review%22%5BJournal%5D)">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li>
<li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li>
<li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li>
<li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li>
<li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPD+exacerbations%3A+defining+their+cause+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li>
<li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbations+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease%22%5BJournal%5D)">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).</li>
<li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).</li>
<li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li>
<li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li>
<li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells%3A+fortifying+the+barrier+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infection%22%5BJournal%5D)">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li>
<li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li>
<li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+p21%28CIP1%2FWAF1%29+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x%28L%29+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li>
<li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784(2013).</li>
<li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li>
<li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL%28R%29+VC10%28R%29+smoke+exposure+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li>
<li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li>
<li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF%28Fbxl17%29-recognized+acetyldegron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li>
<li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26(2009).</li>
<li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells%3A+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li>
<li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%3A+An+essential+issue+for+in+vitro+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiologyopen%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588(2018).</li>
<li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25%2FHDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li>
<li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Agitation%2C+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125(2018).</li>
<li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycosides%3A+activity+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li>
<li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li>
<li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).</li>
<li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li>
<li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

פלישה חיידקית לתאי אפיתל ריאות היא צעד מכריע בפתוגנזה של זיהומים חיידקיים. התהליך של פלישה חיידקית לתאים יכול להיות מחולק לתוך שלושת השלבים הבאים: הראשון, מגע החיידקים ולדבוק על פני השטח של תא האפיתל באמצעות flagella שלהם. שנית, החיידקים עוברים הפניה או חודרים את קרום התא. לבסוף, החיידקים לשכפל ליישב את התאים אם הם בהצלחה לברוח מנגנוניהגנה סלולרית 25,26. גישות לתצפית על זיהומים חיידקיים במיקרופגים ריאות פותחו זמן רב אבל עם ידע מוגבל של תאי אפיתל...

עישון סיגריות משפיע על בריאות הציבור של מיליוני אנשים ברחבי העולם. מחלות מזיקות רבות, כולל סרטן ריאות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), מדווחים להיות קשורים עישון סיגריות1,,2. עישון סיגריות מגביר את הרגישות לזיהומים מיקרוביאליים חריפים במערכתהנשימה 3,4,5. יתר על כן, הצטברות ראיות מוכיחה כי עישון סיגריות משפר את הפתוגנזה של הפרעותכרוניות רבות 6,7,8. לדוגמה, עישון סיגריות עלול להגביר זיהומים ויראליים או חיידקיים הגורמים להחרפה COPD9. בין הפתוגנים החיידקיים התורמים באופן אטיאולוגי להחמרה חריפה של COPD, פתוגן באקלוס אופורטוניסטי-שלילי, פסאודומונס ארוגינוזה, גורם לזיהומים המתאם עם פרוגנוזה עניים ותמותהגבוהה יותר 10,11. החמרת COPD מחמירה את המחלה על ידי האצת ההתקדמות הפתולוגית. אין טיפולים יעילים נגד החמרה COPD למעט ניהול אנטי-סמפטומטי12. החמרת COPD מקדמת תמותת חולים, מפחיתה את איכות החיים ומגבירה את הנטל הכלכלי עלהחברה 13.
דרכי הנשימה היא מערכת פתוחה, נתון ברציפות פתוגנים מיקרוביאליים שונים נוכחים מבחוץ. פתוגנים חיידקיים אופורטוניסטיים מזוהים בדרך כלל בדרכי הנשימה העליונות, אך לעתים נצפו בדרכי הנשימההתחתיות 14,15. במודלים של בעלי חיים P. aeruginosa ניתן לזהות בבקבי alveolar ברגע 1 שעה לאחר זיהום16. כמנגנון הגנה מרכזי, תאים חיסוניים כגון מקרופאגים או נויטרופילים לחסל את החיידקים בדרכי הנשימה. תאי אפיתל ריאות, כמו המחסום הפיזיולוגי הראשון, לבצע תפקיד ייחודי בהגנה המארח מפני זיהומים מיקרוביאליים. תאי אפיתל ריאות עשויים לווסת פלישה מיקרוביאלית, קולוניזציה, או שכפול ללא תלות בתאים חיסוניים17. מולקולות מסוימות שנמצאו בתאי אפיתל, כולל PPARg, להפעיל פונקציות אנטיבקטריאליות, ובכך ויסות קולוניזציה חיידקים שכפול בתאי אפיתלריאות 18. עישון סיגריות עשוי לשנות את המולקולות ולפגוע בתפקוד ההגנה הנורמלי בתאיאפיתל ריאות 19,20. מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על חשיפה ישירה של עשן סיגריות לתאי אפיתלריאות באמצעות 21,22. חשיפה לעשן יכולה להתבצע בדרכים אחרות, עם זאת, כולל יישום של CSE. הכנת CSE היא גישה לשחזור עם יישומים פוטנציאליים בסוגי תאים אחרים, כולל תאי אנדותל כלי דם החשופים בעקיפין לעשן סיגריות.
דו"ח זה מתאר פרוטוקול כדי ליצור תמצית עשן סיגריה כדי לשנות את העומס חיידקים בתאי אפיתל ריאות. CSE מגביר העומס החיידקי של P. aeruginosa, וזה עשוי לתרום הישנות של זיהומים חיידקיים בדרך כלל לראות בהחמרה COPD. שיטה קונבנציונלית משמשת להכנת CSE. תאי אפיתל ריאות, בשלב הצמיחה המעריכי שלהם, מטופלים עם 4% CSE עבור 3 שעות. לחלופין, תאי אפיתל ריאות חד שכבתיים יכולים להיחשף ישירות לעשן סיגריות בממשק נוזלי אוויר. תאים שטופלו CSE לאחר מכן מאותגרים עם פסאודומונס בריבוי של זיהום (MOI) של 10. החיידקים מופצים במהירות רועדת מסוימת כדי להבטיח את המורפולוגיה של הטלגלה שלהם נשאר שלם כדי לשמור על הקיבולת הפולשנית המלאה שלהם. Gentamycin מועסק להרוג את החיידקים שנותרו במדיום התרבות, ובכך להפחית את הזיהום הפוטנציאלי במהלך הקביעה הבאה של העומס החיידקי. הפרוטוקול משתמש גם בפסאודומונס עם תוויתGFP , אשר נוצל ככלי רב עוצמה בחקר זיהום פסאודומונס במודלים שונים. זן מייצג הוא P. פלואורסן של מיגולה23. מידת הזיהום או העומס החיידקי לאחר טיפול CSE נקבעת בשלוש דרכים: שיטת צלחת הטיפה עם ספירת מושבה, PCR כמותי באמצעות פריימרים ספציפיים Pseudomonas 16S rRNA, או ציתומיה זרימה בתאים נגועים פסאודומונס פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גישה פשוטה לשחזור כדי לחקור את ההשפעה של עשן סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות.

<table><tbody><tr><td>מזרק 50 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr> תא <tr><td>אפיתל בדרכי הנשימה מדיום בסיסי</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>שייקר חיידקים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת צמיחת תאי אפיתל סימפונות</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-040</td><td></td></tr><tr><td>מונה תאים</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 מערכת</td> <td>PCR בזמן אמתBio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קיבולת גבוהה RNA-to-DNA KIT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4387406</td><td></td></tr><tr><td>HITES בינוני</td><td>ATCC ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>תאי BEAS-2B אנושיים</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>תאי אפיתל של דרכי הנשימה הקטנות הראשוניות האנושיות</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>LSRII זרימה ציטומטר</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי Nikkon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קורא OD</td><td>ארה"ב</td> פריימרים מדעיים <td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>ITD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>ATCC 47085</td><td>PAO1-LAC</td></tr><tr><td>Pseudomonas fluorescens Migula</td><td>ATCC ATCC</td><td>27853</td><td>P.aeruginosa GFP</td></tr><tr><td>סיגריות בדרגת מחקר (3R4F)</td><td>אוניברסיטת קנטקי</td><td>TP-7-VA</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy מיני קיט</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Transprent PET Transwell הכנס</td><td>קורנינג קוסטאר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מרק סויה טריפטי</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מחקר השפעות של עשן סיגריות על זיהום פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

עישון סיגריות הוא הגורם האטיולוגי העיקרי לנפחת ריאות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD). עישון סיגריות גם מקדם רגישות לזיהומים חיידקיים במערכת הנשימה. עם זאת, ההשפעות של עישון סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות אנושיים עדיין לא נחקרו ביסודיות. מתואר כאן הוא פרוטוקול מפורט להכנת תמציות עישון סיגריות (CSE), טיפול בתאי אפיתל ריאות אנושיים עם CSE, זיהום חיידקי וקביעת זיהום. CSE הוכן בשיטה קונבנציונלית. תאי אפיתל ריאות טופלו עם 4% CSE עבור 3 שעות. תאים שטופלו CSE היו, אז, נגועים פסאודומונס בריבוי של זיהום (MOI) של 10. עומסים חיידקיים של התאים נקבעו על ידי שלוש שיטות שונות. התוצאות הראו כי CSE גדל עומס פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות. פרוטוקול זה, לכן, מספק גישה פשוטה ושחזור כדי ללמוד את ההשפעה של עשן סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות.

דיאגרמה משמשת להמחשת הפרוטוקול באות 1. תאי BEAS-2B אפיתל ריאות טופלו CSE ואתגרו עם פסאודומונס. פסאודומונס במדיום התרבות נהרגו על ידי gentamycin הוסיף ואת התאים היו נתונים לצלחת טיפה, RT-qPCR זיהוי של פסאודומונס ריבוזום 16S RNA, וציטומטריית זרימה. בהשוואה לבקרה, טיפול CSE גדל באופן משמעותי זיהום חיידקי בשיטות צלחת טיפה(איור 2). בהתאמה, CSE מושפע עומס חיידקי ב HSAEC (איור 3). הכדאיות בתא לא השתנה באופן משמעו...

מתואר כאן הוא פרוטוקול כדי ללמוד כיצד תמצית עשן סיגריות משפיעה על קולוניזציה חיידקים בתאי אפיתל ריאות.

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

פרוטוקול זה משתמש בשלוש גישות כדי לקבוע אם עשן סיגריות משפיע על עומס חיידקי pseudomonas בתאי אפיתל ריאות. ניתן להרחיב שיטה זו לתאי אנדותל או להקשות תאים אחרות. הכנת מיצוי עשן הסיגריות, זיהום חיידקי ונחישות עם עומס חיידקי מתוארים היטב בפירוט בסרטון זה.הליך זה קל מאוד לעקוב אחר המשתמשים החדשים. צייר 10 מיליליטר של מדיום תרבות תאים ללא סרום למזרק 60 מיליליטר. חבר את הקצה הצר של חיתוך לקצה פיפיאט מיליליטר אחד אל הזרבובית של המזרק, כמתאם להחזיק את הסיגריה.מוציאים את המסנן מהסיגריה ומצמידים את הסיגריה למתאם. לא יותר מ-30 דקות לפני ביצוע ההתלקחות, הבעירו את הסיגריה וציירו 40 מיליליטר של עשן המכיל אוויר לתוך המזרק. מערבבים את העשן עם המדיום על ידי טלטול המזרק במרץ.חזור על תהליך הציור עד הסיגריה נשרפת לחלוטין, אשר ידרוש כ 11 שואבת בערך שבע דקות. כדי להסיר מיקרואורגניזמים וחלקיקים בלתי מסיסים מהמדיום, סנן אותו באמצעות מסנן 0.22 מיקרון. לאחר מכן, מעבירים את המדיום לצינור סטרילי סגור.לחסן מרק סויה טריפטי או צלחת auger TSB עם זן pseudomonas נבחר. דגירה הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס. הכינו צינור המכיל 20 מיליליטר של TSB עם 5%גליצרול כמקור הפחמן.לאסוף כתם מצלחת auger ולחסן את TSB. דגירה ההשעיה pseudomonas ב שייקר 37 מעלות צלזיוס ב 200 סל"ד, במשך כשעה, עד הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר הוא 0.6. לאחר culturing תאי אפיתל ריאות כמתואר בכתב היד, להוסיף מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין לתאים.לאחר כחמש דקות, כאשר התאים התנתקו לחלוטין מתחתית הצלחת, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום גבהים שלם כדי לנטרל את טריפסין. העבר את התאים לצינור 15 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ו 300 פעמים G. הסר והשליך את העל-טבעי.לאחר מכן, השהה מחדש את התאים למיליליטרים של מדיום הייטס עם 10%FBS. פיפטה 10 מיקרוליטרים של ההשעיה תא אפיתל על צלחת חדשה. השתמש מונה תאים אוטומטי כדי להשיג את ריכוז התא.צלחת תאי אפיתל הריאות בריכוז של שלוש פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר, בנפח כולל של שני מיליליטר של בינוני לגם. דגירה הצלחות לילה. כאשר התאים מגיעים ל- 80%confluency בקירוב, החלף את המדיה בגודל בינוני, בתוספת 1%FBS.לאחר מכן, מוסיפים 4% CSE ל בארות לה הדגירה את הצלחות במשך שלוש שעות. הוסף pseudomonas לכל באר של תאי אפיתל ריאות שטופלו ב- CSE. לאחר מכן, הדגירה את הצלחות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.לאחר מכן, החלף את המדיום בשש צלחות באר עם שני מיליליטר של מדיום גבהים טריים, המכיל 4% CSE ו 100 מיקרוגרם למיליליטר של ג'נטמיצין. לאחר הדגירה של הצלחות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, שאפו את המדיום מה בארות. לשטוף את התאים שטופלו ג'נטמיצין, פעמיים, עם שני מיליליטר של PBS קר.חיידקים לטעון בתאי אפיתל הריאה לאחר מכן ניתן לזהות על ידי שיטת צלחת טיפה, qRT-PCR, או cytometry זרימה. הוסף מיליליטר אחד של מאגר תמיסת תאים לכל באר של תאי אפיתל ריאות. תקן דילולים טוריים של ליט התא, החל מאחד עד 10 לאחד עד 10, 000.ואז לחסן את צלחת auger TSB. לאחר 16 שעות של דגירה, לקבוע כמה מושבה להרכיב יחידות היו נוכחים בתאי אפיתל הריאה, על ידי ספירת מספר המושבות החיידקיות. הוסף 0.35 מיליליטר של חיץ תמיסת תיוציאנט guanidinium לכל באר של תאי אפיתל ריאות.לאסוף את התאים עם מגרד תאים. פיפטה ליסט לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה ומערבבים בעדינות עם פיפטה. מוסיפים 0.35 מיליליטר של טרי מוכן 70% אתנול לlysate ומערבבים היטב.העבר את כל הדגימות לעמודת ספין הממוקמת בצינור איסוף של שני מיליליטר. צנטריפוגה צינור האיסוף במשך 30 שניות ב 10, 000 פעמים G ו 20 עד 25 מעלות צלזיוס. השלך את המאגר בצינור האיסוף ושטף את העמודה עם 0.7 מיליליטר של חיץ שטיפה.צנטריפוגה הטור ב 10, 000 פעמים G במשך 30 שניות. לשטוף את העמודה פעמיים עם 0.5 מיליליטר של חיץ. חזור על הצנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך שתי דקות.מניחים את העמוד לתוך צינור איסוף חדש 1.5 מיליליטר ולהוסיף 30 עד 50 microliters של מים ללא RNase. לאחר צנטריפוגה הצינור ב 10, 000 פעמים G במשך דקה אחת, לאסוף את הזרימה דרך ולמדוד את ריכוז RNA. כדי להתכונן לתגובת שעתוק הפוכה של 20 מיקרוליטר עושה מיקרוגרם אחד של רנ"א כולל עם 10 מיקרוליטרים של מאגר תגובה, מיקרוליטר אחד של תעתיק הפוך ומים נטולי RNase.בצע את תגובת שעתוק הפוכה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, על פי פרוטוקול היצרן. לאחר מכן מערבבים מיקרוליטר אחד של כל דגימת cDNA עם חמישה מיקרוליטרים של התערובת הראשית המכילה צבע סייבר ומיקרוליטר אחד של כל 200 פריימר ספציפי ננו-מולאר. מוסיפים מים לנפח כולל של 20 מיקרוליטר.בצע ניתוח PCR, על פי המלצות היצרן. ולאחר מכן השתמש בשיטת CT ההשוואתית כדי לקבוע את הביטוי. בתאי BEAS-2B, הכדאיות לא השתנה במידה ניכרת כאשר התאים טופלו עם 4%CSE במשך שלוש שעות.שעה אחת כמו זיהום pseudomonas גם לא השפיע באופן משמעותי על הכדאיות. לבסוף, הם משתמשים בג'נטאמיצין כדי להרוג פסאודומונות במדיום התרבותי לא הייתה השפעה מובהקת סטטיסטית על הכדאיות התאית. כפי שנמדד על ידי שיטת צלחת טיפה, זיהום חיידקי בתאי BEAS-2B הוגדל באופן משמעותי על ידי טיפול עם CSE.כך היה גם לגבי טיפול CSE של HSAEC. זיהום חיידקי של תאי BEAS-2B שטופלו ב- CSE הוערך גם באמצעות RT-PCR לכמת את כמות 16S rRNA הנוכחי, אשר הצביע על עלייה Pseudomonas aeruginosa. תאי BEAS-2B שטופלו ב- CSE ונדבקו ב- Pseudomonas fluorescens Migula נותחו על ידי ציטומטריית זרימה ב 509 ננומטר.התוצאה גם הצביעה על כך שטיפול CSE מגביר את הזיהום החיידקי. תוצאות ממיקרוסקופיה פלואורסצנטיות הראו כי חיידקים בעלי תווית GFP היו במשותף עם תאי BEAS-2B בניסוי זיהום פלואורסצנטי פסאודומונס מיגולה. תאים עלולים להיחשף לעשן סיגריות עם רובוטים מעשנים, אשר עשויים לחקות התנהגות אנושית לאפשר לחקור ישירות את ההשפעות של עשן סיגריות על תאי אפיתל ריאות.טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור עשן סיגריות על ברזים תא אחרים בהקשר של זיהום ריאתי. הגישה המתוארת להיות הבסיס להתפתחות של טיפולים יעילים נגד סיגריה עישון פגיעה ריאות הגב C0PD נוסף

studying-effects-cigarette-smoke-on-pseudomonas-infection-lung

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

תאים אפיתל ריאתי יכול להיות מבודד דרכי הנשימה של עכברים תרבותי בממשק אוויר נוזלי כמודל של אפיתל הנשימה מובחן. פרוטוקול מתואר לבידוד, culturing וחשיפת תאים אלה לעשן סיגריות המיינסטרים, כדי ללמוד התגובות מולקולרית רעלן זה סביבתיים.

בידוד של תאים אפיתל עכבר הנשימה וחשיפה לעשן סיגריות בבית ניסויית ממשק האוויר נוזלי

Source: Li, T., et al. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates how cigarette smoke extract weakens antimicrobial defense in lung epithelial cells by reducing AMP production, leading to increased bacterial invasion. The procedure measures intracellular bacterial load to assess the impact of smoke exposure on host-pathogen interactions.

Analyzing the Effects of Cigarette Smoke on Antimicrobial Defense in Lung Epithelial Cells

אנו מתארים את השיטה אגר חרוזים להקים זיהום מתמשך לטווח ארוך כרוני Pseudomonas aeruginosa בדרכי אוויר במודל העכבר.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטות אוטומטיות לכימות פתולוגיות ריאה כרוניות במודל עכברי של COPD. הפרוטוקול כולל חשיפת עכברים לעשן סיגריות (CS), מדידת תפקוד ריאתי, ניפוח הריאות ושימוש בשיטות מורפומטריה למדידת אמפיזמה ושיפוץ דרכי נשימה קטנות בעכברים.

מדידה אוטומטית של הריאות נפחתו וקטן Airway Remodeling בעכברים שנחשפו לעשן סיגריות

מטרת פרוטוקול זה היא לחשוף מודלים תלת-ממדיים של רקמות הסימפונות והאף האורגנוטיפיים האנושיים לעשן סיגריות מיינסטרים (CS) בממשק אוויר-נוזל. לאחר מכן נחקרת ההשפעה של CS על הרקמות באמצעות בדיקת פעילות ציטוכרום P450, מדידת פעימות ריסים וגישה של ביולוגיה מערכתית.

הערכת השפעה של חשיפה חוזרת ונשנית של דוגמניות תרבות רקמות Organotypic 3D הסימפונות ובאף לעשן סיגריות שלמות

באמצעות מבחני תאים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי (PBMC) ex vivo, הראינו כי תכשיר מוצר טבק דליק מדכא באופן ניכר ציטוקינים המופרשים תוך תאיים בתיווך קולטנים ויכולת ציטוליטית של PBMCs אפקטיביים. בדיקות מהירות אלה עשויות להיות שימושיות בהערכת המוצר והבנת ההשפעות הפוטנציאליות ארוכות הטווח של חשיפה לטבק.

שיטות להערכת Cytotoxicity ודיכוי חיסוני של תכשירי מוצרים דליקים טבק

בעוד שמחקר במבחנה של אינטראקציות מארח-פתוגן מאפשר אפיון של תגובות חיסוניות ספציפיות, מודלים in vivo נדרשים כדי להתבונן בהשפעות של תגובות מורכבות. באמצעות חשיפה לקנדידה אלביקנס ואחריה זיהום ריאות בתיווך Pseudomonas aeruginosa, הקמנו מודל עכברי של אינטראקציות מיקרוביאליות המעורבות בפתוגניות של דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

מוצג כאן הוא פרוטוקול שימושי עבור קיבעון ריאה שיוצר מצב יציב עבור הערכה היסטולוגית של דגימות ריאה ממודל העכבר של אמפיזמה. היתרון העיקרי של מודל זה הוא שהוא יכול לתקן את הריאות הרבה עם הלחץ התמידי אותו ללא התמוטטות ריאה או בדלציה.

קיבעון ריאה תחת לחץ מתמיד על הערכה של אמפיזמה בעכברים

פרוטוקול זה מדגים את המחקר של ההשפעות הפתופיסיולוגיות של עשן סיגריות (CS) עם מערכת חשיפה לכל הגוף (WBIS) (WBIS) מובנית בתוך הבית. מערכת זו יכולה לחשוף בעלי חיים CS בתנאים חוזרים מבוקרים למחקר של השפעות בתיווך CS על אמפיזמה ריאות hematopoiesis.

חשיפה לעשן סיגריות בעכברים באמצעות מערכת שאיפה לכל הגוף

מוצגת כאן שיטה ניתנת לשחזור, משתלמת וחזקה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל סימפונות ראשוניים עבור ביו-בנקאות לטווח ארוך ויצירת תאי אפיתל ממוינים על ידי תרבית בממשק אוויר-נוזל.

בידוד תאי אפיתל של הסימפונות מרקמת ריאה שנכרתה לצורך ביו-בנקאות והקמת תרביות ממשק אוויר-נוזל ממוינות היטב

במאמר זה אנו מתארים מודל במבחנה לבידוד והתמיינות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה, תוך התמקדות בהתאקלמותם לתמצית עשן סיגריות כרונית (CSE). ניתן להשתמש במודל כדי לאפיין באופן מקיף את ההשפעה הרב-אומית של CSE, מה שעשוי לספק תובנות לגבי התגובות התאיות תחת חשיפה כרונית לעשן.

מודל In Vitro לחקר התמיינות ושינויים של מולטי-אומיקה בתאי אפיתל של דרכי הנשימה של מורין המגורות באמצעות תמצית עשן סיגריות

חקור את השפעת עשן סיגריות על זיהום חיידקי Pseudomonas בתאי אפיתל ריאות באמצעות חילוץ עשן, הדבקה חיידקית ומדידת עומס חיידקי. שיטה זו מספקת גישה ברורה לחקר אינטראקציות בין עשן לחיידקים בביולוגיה תאית.

מחקר השפעות של עשן סיגריות על זיהום פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות

גלה סרטונים נוספים