בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון

בידוד מהיר של רקמות מערכת העצבים המרכזית כולל קרומי המוח מאפשר ניתוח מקיף של פנוטיפ, תפקוד ולוקליזציה של תאי חיסון בתנאים הומאוסטטיים ופתוגניים. שתי השיטות המודגמות מאפשרות מיצוי מהיר של רקמות מערכת העצבים המרכזית עם קרומי המוח, אידיאלי לניתוח במורד הזרם באמצעות טכניקות תא בודד ושיטות היסטולוגיות. למרות שהתוצאות המייצגות מתמקדות בניתוח תאים חיסוניים, ניתן להשתמש בשתי שיטות אלה לניתוח תאים תושבי מערכת העצבים המרכזית, כולל מיקרוגליה, אסטרוציטים, פריציטים, תאי אנדותל, תאי סטרומה ונוירונים.

התחל בבידוד דגימות מוח וחוט שדרה מעכברים שהורדמו. לאחר הסרת הראש, בצע חתך בקו האמצע בעור והפוך אותו על העיניים כדי לשחרר את הגולגולת. חותכים בעצם האף כדי לשחרר את הלסת התחתונה מהגולגולת.

לאחר מכן הסר את הלסת התחתונה, הלשון והעיניים. חותכים לאורך ההיבטים הצדדיים של הגולגולת כדי לשחרר את הרקמה לאורך בשר השמיעה החיצוני ולקצץ אותה. כדי לאסוף את דגימת חוט השדרה, הפרד את כלוב הצלעות מעמוד השדרה על ידי חיתוך מקביל לעמוד השדרה במספריים חדים.

בצע חתך קטן באזור המותני התחתון כדי לבודד את עמוד השדרה, ואז חתוך והסר את כל השרירים שנותרו לאורך עמוד השדרה כדי לחשוף את החוליות. בעת ביצוע הסרת אבדן, בדוק את העצם מדי יום כדי לקבוע אם היא רכה וגמישה. הסר את הרקמה מתמיסת ה-EDTA בעזרת מלקחיים, הניח אותה על צלחת פטרי ובדוק בעדינות את רכות העצם בעזרת מחט בגודל 25.

אם המחט חודרת בקלות לעצם, תהליך הסרת האבדן הושלם. כדי לחלץ את כובע הגולגולת במוח, בצע חתך בקו האמצע בעור והפוך את העור מעל העיניים. הניחו את המספריים בתוך הנקב המגנה והתחילו לחתוך את הגולגולת לרוחב לאורך קליפת המוח לכיוון פקעת הריח, תוך שמירה על החתכים מעל בשר השמיעה החיצוני והלסת התחתונה.

בצע את אותם חתכים בצד הנגדי עם חתכים שנפגשים בפקעת הריח כדי לשחרר את כובע הגולגולת מהמוח. בעזרת מלקחיים, מקלפים את מכסה הגולגולת ומכניסים אותו לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של מדיום RPMI קר בתוספת HEPES של 25 מילי-מולרי. הניחו מלקחיים מעוקלים מתחת לבסיס המוח והרימו אותם כדי לשחרר את המוח מכיפה הגולגולת.

חלץ את עמוד השדרה ורקמת חוט השדרה על ידי חיתוך מקביל לעמוד השדרה כדי להפריד בין כלוב הצלעות לעמוד השדרה. לאחר מכן בצע חתך קטן באזור המותני התחתון כדי לבודד את עמוד החוליות. חתוך והסר את כל השרירים שנותרו לאורך עמוד השדרה כדי לחשוף את החוליות.

לאחר מכן, הניחו את המספריים הכירורגיים העדינים במיוחד בתוך עמוד החוליה וחתכו לאורך הקצה הצדדי של העמוד. חותכים את הקצה הרוחבי הנגדי לחלוטין כדי לחלק את עמוד החוליה לחלק קדמי ואחורי. השתמש במלקחיים כדי לקלף את חוט השדרה לאט ובזהירות מעמוד השדרה ולהניח אותו בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר RPMI קר עם HEPES של 25 מילי-מולרי.

לאחר מכן העבירו את החלקים הקדמיים והאחוריים של עמוד השדרה לצינור אחר. כדי להסיר את קרומי המוח מכובע הגולגולת, הוציאו את כובע הגולגולת מאמצעי ה-RPMI והשתמשו במלקחיים חדים כדי להבקיע סביב הקצה החיצוני. מקלפים את קרומי המוח הרחק מקצה כובע הגולגולת, מגרדים כדי להסיר את קרומי המוח הדוראליים והארכנואידים ומניחים את קרומי המוח על צלחת פטרי.

כדי להסיר את קרומי המוח מעמוד החוליות, הוצא את העמוד מהמדיה וקלע סביב שולי עמוד השדרה בעזרת מלקחיים חדים כדי לשחרר את קרומי המוח. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לקלף את קרומי המוח מקצה החוליות ולהניח את קרומי המוח על צלחת פטרי. מניחים מסננת רשת ניילון בצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

כדי ליצור תרחיף תאים, העבירו את קרומי המוח למסננת והוסיפו שלושה מיליליטר של RPMI בתוספת HEPES, ולאחר מכן השתמשו בבוכנה ממזרק של חמישה מיליליטר כדי לטחון את הרקמה והמדיה דרך המסננת. שפכו את רקמת המוח או חוט השדרה עם המדיה לתוך צלחת פטרי בגודל 100 מילימטר והשתמשו במלקחיים כדי להזיז את הרקמה לתחתית. טוחנים את רקמת המוח בעזרת סכין גילוח סטרילי ואוספים את הרקמה בתחתית הצלחת.

הוסף שלושה מיליליטר של RPMI בתוספת 10% FCS לצלחת הפטרי, ולאחר מכן השתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי להשעות מחדש את הרקמה במדיה ולהעביר אותה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הוסף קולגנאז מסוג 1 ו-DNase 1 לרקמה ודגר את הצינורות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות. הפוך את הצינורות כל 15 דקות כדי לערבב היטב את הרקמה עם האנזימים.

לאחר הדגירה, הוסף EDTA לכל שפופרת לריכוז סופי של 0.01 מולארי ודגר את הצינורות למשך חמש דקות נוספות כדי לנטרל את הקולגנאז. הוסף תשעה מיליליטר RPMI בתוספת 10% FCS לכל צינור, ואז צנטריפוגה את הצינורות ב-450 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השתמש בפיפטה של פסטר עם ואקום כדי לשאוב את הסופרנטנט, והקפד לא לגעת בכדור התא.

הוסף שלושה מיליליטר של תמיסת שיפוע צפיפות איזוטונית של 100% מלאי לגלולת התא, ולאחר מכן הוסף מדיית RPMI 10% FCS נוספת כדי להביא את הנפח הסופי ל-10 מיליליטר ולהשעות מחדש את גלולת התא. הפוך וערבב היטב את הצינור, ולאחר מכן הכנס פיפטה סרולוגית עם מיליליטר אחד של תמיסת שיפוע צפיפות איזוטונית של 70% מלאי לתחתית הצינור. לאט לאט תחתיו את הפתרון, והקפידו לא ליצור בועות.

הסר את הפיפטה הסרולוגית מהצינור, הקפד לא להפריע לשיפוע. צנטריפוגה של הצינור ב-800 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואז שאבו את הסופרנטנט, כולל שכבת פסולת המיאלין, עד שנשארים שניים עד שלושה מיליליטר בצינור. השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי לקצור את שכבת התא בין שיפוע הצפיפות של 30% ל-70% ולהעביר אותה לצינור חדש של 15 מיליליטר.

הוסף מדיית RPMI 10%FCS כדי להביא את הנפח הסופי ל-15 מיליליטר, ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב-450 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. פרוטוקול זה שימש להערכת תאי B ו-T בקרום המוח, במוח ובחוט השדרה במהלך טרשת נפוצה מתקדמת. השער נערך כדי להבחין בין תאי חיסון חודרים היקפיים גבוהים CD45 לבין תאי עצב בעלי מיקרוגליה נמוכה CD45 ו-CD45, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים.

מעט תאים גבוהים CD45 היו נוכחים בחוט השדרה וברקמת המוח של עכברים שטופלו בדמה. אותו חתך שער לביטוי גבוה של CD45 שימש בקרום המוח כדי לזהות תאים חיסוניים גבוהים CD45 ולהוציא תאים שאינם חיסוניים. בכל רקמות ה-CNS של TMEV-IDD, נצפו אחוזים מוגברים של תאי חיסון גבוהים CD45 בהשוואה לעכברים שטופלו בדמה.

במהלך TMEV-IDD כרוני, אחוז תאי B בקרב תאי חיסון גבוהים CD45 במוח ובחוט השדרה היה גבוה יותר בהשוואה לתא קרום המוח. מוחות וחוטי שדרה נטולי אבנית צולמו כדי לזהות את המיקום של תאי B ו-T בתוך תא ה-CNS. מיצוי קונבנציונלי של המוח מכובע הגולגולת הביא לשכבת פיה שלמה, אך שכבות קרום המוח הנותרות לא נכללו.

גם במוח נטול האבדן וגם בחוט השדרה, כל שכבות קרום המוח היו שלמות. תאי B ממותגים באיזוטיפ ותאי T היו ממוקמים עם ביטוי IgG ו-CD3, בהתאמה. צביעת IgG עם ER-TR7 גילתה שתאי B היו נוכחים בפרנכימה של מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח, בעוד שאגרגטים תאיים בתוך קרומי המוח החיוביים ל-ER-TR7 הכילו מספר תאי B חיוביים ל-IgG ותאי T חיוביים ל-CD3.

שלב קריטי בפרוטוקולים אלה הוא מיצוי קפדני של רקמות מערכת העצבים המרכזית, החיוני לשיפור הטוהר של תרחיפי תאים בודדים ולקבלת רקמה היסטולוגית בעלת מורפולוגיה באיכות גבוהה. הטכניקות המתוארות מאפשרות ניתוח מקיף של תאים המאכלסים את תא ה-CNS, אידיאלי לבחינת פנוטיפ תאים, תפקוד ולוקליזציה תחת הומאוסטזיס ובמהלך פתוגנזה של מחלה.