Name: ב Vivo מיקוד של תאי הצבי העצבי Neocortex חמוס על ידי באלקטרופורציה ברחם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: למדו שיטת אלקטרופורציה ברחם לשינוי גנטי בתאי גזע עצביים בחמוס עוברי. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות הנאוקורטקס והתרחבותו האבולוציונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לשירותים ומתקנים של מכון מקס פלאנק לביולוגיה וגנטיקה של תאים מולקולריים על התמיכה יוצאת הדופן הניתנת, במיוחד כל הצוות של השירותים הביו-רפואיים (BMS) על גידול מצוין של חמוסים וג'יי פיכל וצוותו של מתקן המיקרוסקופיה הקלה. אנו אסירי תודה במיוחד קטין Reppe ואנה Pfeffer מ BMS לתמיכה וטרינרית יוצאת דופן ליי Xing מהקבוצה Huttner לסיוע עם ניתוחים חמוס.

כל ההליכים הניסיוניים התנהלו בהסכמה עם החקיקה הגרמנית לרווחת בעלי חיים לאחר אישור ה-Landesdirektion Sachsen (רישיונות TVV 2/2015 ו-TVV 21/2017).
1. הכנה לאלקטרואידציה ברחם
<ol><li>הכן את תערובת הדי.אן.איי. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בריכוז סופי של 1 μg/μL של pGFP. להמיס DNA PBS ותוספת עם 0.1% ירוק מהיר כדי להקל על הדמיה. לאחר הכנתו, מערבבים את תערובת ה-DNA על ידי התפתלות למעלה ומטה מספר פעמים או על ידי הקשה על האצבע. יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד לשימוש. הערה: עבור coelectroporations, תערובת ה-DNA מוכן להכיל ריכוז סופי של 1 μg / μL של קידוד פלסמיד גן של עניין יחד עם 0.5 μg/ μL של pGFP מדולל PBS.</li>
	<li>הכן את שולחן הניתוח עם כל הכלים והמכשירים הנדרשים.</li>
	<li>משוך נימים מזכוכית באמצעות מושך המיקרופיפט. התאם את הקוטר של קצה נימות על-ידי חיתוך החלק הדיסטלי של נימות באמצעות מקציות כפי שתואר קודםלכן 41.</li>
</ol>2. הכנת חמוסים לניתוח
<ol><li>לשמור את jills בהריון עם עוברים ב E33 צום לפחות 3 שעות לפני הניתוח כדי להפחית את הסיכון להקאות.</li>
	<li>לפני הניתוח לחטא את כל הכלים על ידי autoclaving. לבצע את הניתוח בחדר שהוקצה במיוחד בתנאים aseptic כדי לחסל מקורות פוטנציאליים של זיהום.</li>
	<li>שים את ג'יל ההרה בתיבת נרקוזיס עם 4% איזולורן.</li>
	<li>כאשר הם ממברמים, מניחים את החמוס על שולחן הניתוח עם משטח חום וצרףו את מסכת הנרקוזיס עם זרימה קבועה של 2%-3% לאף. כדי להבטיח את רמת ההרדמה המתאימה, בדוק אם יש את המחסור בהרפלקסים הבאים:<ol>
<li>רפלקס פלורל על ידי נגיעה בעור פריקולרי</li>
		<li>רפלקס הגמיש על ידי צביטת העור בין 2ו 3 rd, או 3rd ו 4 בהון של שניהגפיים האחוריות</li>
		<li>אם רפלקס palpebral נעדר רפלקס כיפוף הוא מופחת בבירור, לבדוק את רפלקס הכאב על ידי צביטת בהון אחת של כל איבר אחורי. הערה: ודא שיש סטטוסקופ בהישג יד כדי לפקח על קצב הלב והקצב במידת הצורך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להזריק את החמוס תת עורי עם משכך כאבים (0.1 מ"ל של מטאמיצול, 50 מ"ג/ק"ג של משקל גוף), אנטיביוטיקה (0.1 מ"ל/ק"ג של משקל גוף של 20 מ"ג/ק"ג של אמוקסיצילין + חומצה קלוולנית), וגלוקוז (10 מ"ל של 5% פתרון גלוקוז).</li>
	<li>מניחים טיפה של תמיסת משחה לעיניים על העיניים כדי למנוע התייבשות עיניים במהלך הניתוח.</li>
	<li>לגלח את הבטן החמוס באמצעות גילוח.</li>
	<li>לנקות את העור עם מים וסבון, לחטא את הבטן עם 70% קרצוף אתנול, לחטא 2x עם יוד, ולתת לו להתייבש.</li>
</ol>3. באלקטרו אידוי הרחם של חמוסים
<ol><li>ודא כי האזור הכירורגי סטרילי: מניחים כלים כירורגיים סטריליים על רקמות סטריליות, ולהחליף מעיל וכפפות.</li>
	<li>מניחים וילונות כירורגיים סטריליים על החיה.</li>
	<li>באמצעות אזמל, לפתוח בניתוח את הבטן ב linea אלבה עם ~5 ס"מ ארוך לחתוך.</li>
	<li>חותכים את שכבת השריר באמצעות מספריים.</li>
	<li>מניחים דגימות גזה סביב אתר החתך ומרטיבים אותן ב-PBS. דגימות הגזה יספגו את ה-PBS הנוסף שיתווסף במהלך הניתוח. הערה: לשמור על חום ותמיכה PBS לאורך כל הניתוח.</li>
	<li>לחשוף את רחם החמוס ולמקם אותו על דגימות גזה.</li>
	<li>טען נמת זכוכית עם פתרון ההזרקה באמצעות פיפטה עם קצה טעינה ארוך. ודא כי נפח הטעינה הוא כ 5-20 μL בהתאם למספר העוברים ומספר תנאים ניסיוניים שונים. הנפח המוזרק הממוצע לכל עובר הוא 3-5 μL. חבר את נערך הזכוכית הטעון למחזיק וחבר את הצד השני של המחזיק לצינור ודובר.</li>
	<li>תבדוק את העובר הראשון ותמצא את הראש.</li>
	<li>מקם את מקור האור הסיב האופטי ליד ראשו של העובר כדי להקל על הדמיה. הערה: קירות הרחם החמוסים כהים מאוד, וקשה לראות דרכם אלא אם כן האור נוצץ ישירות עליהם.</li>
	<li>לבצע הזרקה תוך-ורטרלית אחת לתוך החדר של אחת מחצי הכדור המוח ולשמור על חצי הכדור השני ללא פגע כדי לשמש כשליטה פנימית. החדר עצמו אינו נבדל בקלות על ידי העין, כך מיקומו מוערך בהתבסס על המיקום של הקשתית פיגמנט, אשר נראה לעין. הזרקת תוך ורטרקולרית נעשית על ידי לקיחת המחזיק מחובר נימי הזכוכית ו חודר את העור, הגולגולת, ואת רקמת המוח עם קצה נימי הזכוכית. הערה: הקפד לא לפגוע שליה, אשר כהה יותר מאשר שליות murine.<ol>
<li>כאשר קצה נמת הזכוכית נמצא בחדר, להזריק כ 3-5 μL של פתרון ההזרקה על ידי פיות צינור באמצעות הפיה מחובר מחזיק נמת הזכוכית. מכיוון שהפתרון המוזרק מכיל 0.1% מהיר ירוק, החדר המוזרק יהפוך כעת לירוק כהה, ויהיה גלוי כמבנה בצורת כליה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מניחים את אלקטרודות הפינצטה על הרחם מעל ראשו של העובר, כך שהמוט החיובי ממוקם מעל האזור שיהיה ממוקד והמוט השלילי מתחת לאזור המוזרק.</li>
	<li>הגדר את תנאי האלקטרואידציה הבאים באלקטרופורטור: אורך פולס = 50 השנייה; מתח פולס = 100 V; מרווח דופק = 1 s; מספר פולסים = 5. לאחר מכן,לחץ עלכפתור "דופק" על האלקטרופורטור.</li>
	<li>שחרר במהירות מספר טיפות של PBS 1x חם על העובר האלקטרואיד.</li>
	<li>חזור על ההליך עבור כל העוברים. לשמור על הרחם רטוב כל הזמן עם PBS חם. הערה: אם העוברים הראשונים הפונים לנרתיק אינם נגישים בקלות, עדיף לא לחשמל אותם.</li>
	<li>כאשר כל העוברים מתחשמלים, מניחים את הרחם בחזרה לחלל צק.</li>
	<li>תפר את שכבת השריר עם צפר באמצעות תפר 4-0.</li>
	<li>תפר את העור באותו עובי ולרסס את הפצע עם ספריי אלומיניום.</li>
	<li>מניחים את החיה בכלוב ולשמור אותו חם עם מקור חום. עקבו בזהירות אחר החיה עד שהיא מתעוררת.</li>
</ol>4. טיפול לאחר הניתוח ודיור של בעלי חיים ממוקדים
<ol><li>במשך 3 ימים לאחר הניתוח להבטיח כי בעלי החיים עוברים את הטיפול שלאחר הניתוח הבא: 20 מ"ג/ק"ג אמוקסיצילין (אנטיביוטיקה) 1x מדי יום; 25 מ"ג/ק"ג מטאמזול (משכך כאבים) 3 ים ביום.</li>
	<li>ודא כי החמוסים נמצאים בנפרד.</li>
	<li>ודא כי החמוסים נבדקים על ידי וטרינר לפחות 1x ליום.</li>
	<li>ודא כי החמוסים מופרעים מעט ככל האפשר במהלך הלידה.</li>
	<li>לאחר שהגורים נ גנחו או הוקרבו, הכינו את ג'יל לכריתת רחם.</li>
</ol>5. כריתת רחם של חמוסים
הערה: כריתת רחם מתבצעת כדי להפחית את מספר בעלי החיים שהוקרבו כך בעלי החיים שעברו עיקור ניתן יהיה תרם לאימוץ כחיות מחמד. ההליך הקדם-כירורגי של כריתת רחם זהה לתהליך 2.
<ol><li>לגלח ולחטא את הבטן החמוס כמתואר בשלבים 3.1 ו 3.2.</li>
	<li>פתח בניתוח את הבטן בליינה אלבה. חותכים את שכבת השריר. הרם את שכבת השריר והגן על הבטן באצבע תוך כדי פתיחת שכבת השריר במלואה.</li>
	<li>מניחים דגימות גזה סביב אתר החתך ומרטיבים אותן ב-PBS סטרילי. לחשוף את הרחם החמוס ואת השחלות ולמקם אותם על דגימות גזה.</li>
	<li>התחל את כריתת הרחם בצד אחד על ידי רצועות ovarica arteria ו- vena ovarica גולגולת mesovar. לשים מלחציים על כל צד של הרצועה ולבצע גולגולת קשירה אחרת למלחציים. חבר את המלחציים השלישיים בקצות הרצועה כדי להציל אותם. חזור על זה בצד השני.</li>
	<li>חותכים בין המלחציים ומנתקים את הרחם של הקרנואה מההסנטריה משני הצדדים.</li>
	<li>לתות את הרחם ארטריה משני צידי הרחם סיבתי לרחם ostium. ואז לתפור את הנרתיק ולתקן את הקשירה. חבר את המלחציים בקצות הליגות כדי להציל אותם. שים שני מלחציים גולגולתיים על הקשירה. חותכים בין המלחציים ותנתקו את הרחם מהנרתיק. מוציאים את הרחם והחלחלות ונפטרים מהם. לגרד את קרום הררית שיורית מהתחת הרחם.</li>
	<li>נתק את כל המלחציים הנותרים וקצר את קצוות הקשירה. הקפד לשלוט לדימום לאחר הסרת המלחציים.</li>
	<li>תפר את שכבת השריר ואת העור כמתואר בשלבים 3.16 ו 3.17. בצע את הפרוטוקול לאחר הניתוח כמו בשלבים 3.18 ו- 4.1-4.3. יש להשאיר את בעלי החיים במתקן בעלי החיים למשך שבועיים לפחות עם ביקורים וטרינריים קבועים. לאחר שהחיות יחלימו לחלוטין, ניתן יהיה להיתרמו לאימוץ.</li>
</ol>

<ol><li>Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKalebic%2C+N+%22Evolution+of+Nervous+Systems+2e%22">Evolution of Nervous Systems 2e</a>. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neocortex%3A+a+perspective+from+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology.</a> Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).</li>
<li>Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outer+subventricular+zone+and+primate-specific+cortical+complexification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification.</a> Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).</li>
<li>Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cortex+expansion+and+folding%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned.</a> EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).</li>
<li>Molnar, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+development+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">New insights into the development of the human cerebral cortex.</a> Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).</li>
<li>Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral-based+gene+transfer+to+the+mammalian+CNS+for+functional+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies.</a> Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e239(2007).</li>
<li>Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+knock-down+in+post-mitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons.</a> PLoS One. 9 (8), 105584(2014).</li>
<li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+knockout+in+the+mouse+brain+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation.</a> Science Reports. 6, 20611(2016).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-induced+disruption+of+gene+expression+in+mouse+embryonic+brain+and+single+neural+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo.</a> EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).</li>
<li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+In+Vivo+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing.</a> Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).</li>
<li>Albert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome+profiling+and+editing+of+neocortical+progenitor+cells+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development.</a> EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e236(2007).</li>
<li>Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+genetic+manipulation+of+gyrencephalic+carnivores+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation.</a> Molecular Brain. 5, 24(2012).</li>
<li>Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genetic+manipulation+of+cortical+progenitors+in+gyrencephalic+carnivores+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation.</a> Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+expansion+due+to+increased+proliferation+of+basal+progenitors+is+linked+to+changes+in+their+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology.</a> Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).</li>
<li>Martinez-Martinez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restricted+period+for+formation+of+outer+subventricular+zone+defined+by+Cdh1+and+Trnp1+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels.</a> Nature Communication. 7, 11812(2016).</li>
<li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Inner+and+Outer+Fiber+Layers+in+the+Developing+Cerebral+Cortex+of+Gyrencephalic+Ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets.</a> Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).</li>
<li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+Cerebral+Cortex+Requires+Cdk5+in+Upper-Layer+Neurons+in+Gyrencephalic+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals.</a> Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).</li>
<li>Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gyrification+of+the+cerebral+cortex+requires+FGF+signaling+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain.</a> Elife. 6, 29285(2017).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-specific+ARHGAP11B+induces+hallmarks+of+neocortical+expansion+in+developing+ferret+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex.</a> Elife. 7, 41241(2018).</li>
<li>Masuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+analyses+of+cortical+malformation+using+gyrencephalic+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals.</a> Science Reports. 5, 15370(2015).</li>
<li>Matsumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+analyses+of+periventricular+nodular+heterotopia+using+gyrencephalic+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals.</a> Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).</li>
<li>Barnette, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+brain+development+in+the+ferret+via+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of brain development in the ferret via MRI.</a> Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).</li>
<li>Smart, I. H., McSherry, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gyrus+formation+in+the+cerebral+cortex+in+the+ferret.+I.+Description+of+the+external+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes.</a> Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).</li>
<li>Sawada, K., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cerebral+sulci+and+gyri+in+ferrets+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Anomalies+%28Kyoto%29%22%5BJournal%5D)">Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius).</a> Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).</li>
<li>Reillo, I., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+zones+in+the+developing+cerebral+cortex+of+ferret%3A+ontogeny%2C+cell+cycle+kinetics%2C+and+diversity+of+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors.</a> Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).</li>
<li>Smart, I. H., McSherry, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gyrus+formation+in+the+cerebral+cortex+of+the+ferret.+II.+Description+of+the+internal+histological+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes.</a> Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).</li>
<li>Borrell, V., Reillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+neural+stem+cells+in+cerebral+cortex+development+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution.</a> Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).</li>
<li>Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+intermediate+radial+glia+in+the+tangential+expansion+of+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).</li>
<li>Fietz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSVZ+progenitors+of+human+and+ferret+neocortex+are+epithelial-like+and+expand+by+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling.</a> Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).</li>
<li>Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the human neocortex.</a> Cell. 146 (1), 18-36 (2011).</li>
<li>Fietz, S. A., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+progenitor+expansion%2C+self-renewal+and+neurogenesis-a+polarized+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).</li>
<li>De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+domains+of+gene+expression+in+germinal+layers+distinguish+the+development+of+gyrencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly.</a> EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).</li>
<li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+investigations+of+the+brain+of+higher+mammals+using+gyrencephalic+carnivore+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosciences+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets.</a> Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).</li>
<li>Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+to+the+postnatal+ferret+cerebral+cortex+by+DNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).</li>
<li>Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+radial+migration+of+neurons+by+long-distance+somal+translocation+in+the+developing+ferret+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex.</a> Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).</li>
<li>Johnson, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspm+knockout+ferret+reveals+an+evolutionary+mechanism+governing+cerebral+cortical+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size.</a> Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).</li>
<li>Vaid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+population+of+Hopx-dependent+basal+radial+glial+cells+in+the+developing+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex.</a> Development. 145 (20), 169276(2018).</li>
<li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+progenitors+in+the+mammalian+telencephalon+includes+a+new+radial+glial+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type.</a> Nature Communications. 4, 2125(2013).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

באלקטרו אידוי הרחם חמוס היא טכניקה חשובה, עם יתרונות וחסרונות ביחס לשיטות אחרות. ישנם שלבים ומגבלות קריטיים לשיטה זו, כמו גם שינויים פוטנציאליים ויישומים עתידיים שיש לזכור.
מאז עבודתו החלוצית של ויקטור בורל ועמיתיו על מניפולציה גנטית של neocortex חמוס שלאחר הלידהבאמצעות אלקטרופורציה או הזרקהויראלית 35,42,43, החמוס הפך אורגניזם מודל נגיש גנטית. הקמת מניפולציה גנטית במהלך התפתחות עוברית באמצעות<sup clas...

neocortex הוא הסדין החלקי של המוח היונקים ואת המושב של תפקודים קוגניטיביים גבוהיםיותר 1,,2,,3,,4,,5. על מנת להשיג מניפולציה גנטית חריפה neocortex היונקים ב vivo במהלך ההתפתחות העוברית, נחקרו שתי שיטות שונות: זיהוםנגיפי 6 ובאלקטרופורציהברחם 7. שתי השיטות מאפשרות פילוח יעיל של תאים ניאו-קליפטיים, אך סובלות ממגבלות מסוימות. היתרון העיקרי של אלקטרופורציה ברחם בהשוואה לזיהום נגיפי הוא היכולת להשיג ספציפיות מרחבית בתוך neocortex, אשר מושגת על ידי ויסות הכיוון של השדה החשמלי.
מאז אלקטרופורציה הוצגה לראשונה כדי להקל על הכניסה של DNA לתוך התאיםבמבחנה 8, זה הוחל כדי לספק DNA לתוך בעלי חוליות שונים ב vivo. במדעי המוח ההתפתחותיים, באלקטרו אידוי הרחם של neocortex העכבר דווח לראשונה ב 20019,10. שיטה זו מורכבת הזרקה של תערובת ה-DNA בחדר החוץ של המוח העוברי ויישום הבא של השדה החשמלי באמצעות אלקטרודות פינצטה, המאפשר דיוקמרחבי 7,11. באלקטרופורציה ברחם הוחל מאז כדי לספק חומצות גרעין על מנת לתמרן את הביטוי של גנים אנדוגניים או חוץ רחמים הוסיף neocortex העכבר. התקדמות חשובה נעשתה לאחרונה על ידי יישום המתודולוגיה של CRISPR / Cas9 בתיווך עריכת הגנום באמצעות אלקטרופורציה ברחם neocortex העכבר לבצע (1) הפרעה גנטית בנוירונים postmitotic12,,13 ותאי אבקדום עצבי 14,ו (2)גנום 15 ו אפיגנום16 עריכה.
זמן קצר לאחר הדיווח הראשון בעכבר, באלקטרופורציה של הרחם הוחל על neocortex חולדהעוברית 17,18. לא מכרסמים נותרו אתגר עד הראשון באלקטרו אידוי הרחם של חמוסים, טורף קטן, דווח ב 201219,20. מאז, באלקטרו אידוי הרחם של חמוסים הוחל כדי ללמוד את המנגנונים של התפתחות neocortex על ידי תיוג של פרוטוורים עצבייםונוירונים 20,21,2222,23, מניפולציה הביטוי של גנים אנדוגניים, כולל השימוש בטכנולוגיית CRISPR/Cas924, ועל ידי אספקת גנים חוץ רחמיים21 , 22,2522,כוללגנים ספציפיים לאדם 26. יתר על כן, באלקטרואידציה של רחם של חמוסים שימש כדי לטפל בתכונות של התפתחות neocortex אנושי בתנאיםפתולוגיים 27,28.
בהקשר של התפתחות neocortex, היתרונות של שימוש חמוסים כמו אורגניזם מודל לעומת עכברים הם בשל העובדה כי חמוסים טוב יותר לסכם סדרה של תכונות דמויי אדם. ברמה האנטומית, חמוסים מציגים תבנית אופיינית של קיפול קליפתי, אשרקיים גםבפרימטים אנושיים ורוב האחרים, אבל נעדר לחלוטין בעכברים אוחולדות 4,29,30,31. ברמה ההיסטולוגית יש שני אזורי נבט תת-ורטרליים נפרדים, המכונים האזורים התת-ורטרליים הפנימיים והפנימיים (ISVZ ו-OSVZ, בהתאמה)32,33,המופרדים על ידי שכבת הסיביםהפנימית 23. תכונות אלה משותפות גם עם פרימטים, כולל בני אדם, אך לא עם עכברים34. ISVZ ו OSVZ ב חמוסים ובני אדם מאוכלסים בשפע תאים עצביים אב אדם, בעוד האזור subventricular (SVZ) של עכברים מכיל רק אבות עצבייםדליל 21,32,35,36. ברמה התאית, חמוסים להפגין שיעור גבוה של תת סוג של אבות עצביים המכונה גליה בסיס או רדיאלית החוצה (bRG או oRG, בהתאמה), אשר נחשבים אינסטרומנטליים עבור ההתרחבות האבולוציונית של neocortexיונקים 34,37,38. bRG הם מכאן מאוד בשפע neocortex חמוס העוברי העוברי, אבל הם נדירים מאוד neocortex העכברהעוברי 35,36. יתר על כן, חמוס bRG מראה הטרוגניות מורפולוגית דומה לזה של bRG אנושי, הרבה יותר טוב עכבר bRG21. לבסוף, ברמה המולקולרית, פיתוח neocortex חמוס מראה דפוסי ביטוי גנים דומים מאוד לאלה של neocortex אנושי עוברי, אשר נחשבים לשלוט בהתפתחות של קיפול קליפתי, בין היתר39.
המאפיינים הביולוגיים והמולקולריים של החמוס bRG הופכים אותם לתווססים מאוד, בדומה ל-bRG האנושי. התוצאה היא ייצור מוגבר של נוירונים ופיתוח של neocortex מורחב ומורכב מאוד34. מאפיינים אלה הופכים חמוסים אורגניזמים מודל מעולה לחקר תכונות דמויי אדם של התפתחות neocortex כי לא ניתן לדגמןבעכברים 26,40. כדי לנצל את מלוא היתרונות של החמוס כאורגניזם מודל השיטה שהוצגה פותחה. הוא מורכב באלקטרו-אידוי רחם של עוברי חמוס E33 עם פלסמיד המביע GFP (pGFP) תחת שליטה של מקדם בכל מקום, CAG. לאחר מכן ניתן לנתח את העוברים המאלקטרו-אידויים באופן עוברי או לאחר הלידה. על מנת להפחית את מספר בעלי החיים שהוקרבו, חמוסים נקבה (ג'יל) מחטאים על ידי כריתת רחם ותרמו לאימוץ כחיות מחמד. אם העוברים המיויעדים נקטפים בשלבים עובריים, מתבצע ניתוח שני ועוברים מוסרים על ידי ניתוח קיסרי, בעוד שהנוברים עוברים כריתת רחם. אם העוברים המיויעדים מנותחים בשלבים שלאחר הלידה, ג'יל עובר כריתת רחם לאחר שהגורים נ גנחו או הוקרבו. לפיכך, מוצג גם פרוטוקול כריתת הרחם של ג'יל.

<table><tbody><tr><td>מזרק</td><td>BD</td><td>309628</td><td>אלקטרופורציה</td></tr><tr><td>4-0 תפר ויקריל</td><td>Ethicon</td><td>V392ZG</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>תרסיס אלומיניום</td><td>cp-pharma</td><td>98017</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>אמוקסיצילין + חומצה קלבולנית (Synulox RTU)</td> <td>WDT</td><td>6301</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק כובע</td> ניתוח <td>WPI</td><td>MPH6S12</td><td>אלקטרופורציה</td></tr><tr><td>תמיסת משחת Dexpanthenol</td><td>באייר</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td>יריעת וילון לניתוח 45x75 ס"מ</td> פינצטה <td></td><td>אלקטרודה לניתוח</td><td>2513052 הרטמן</td></tr><tr><td>, ציפוי פלטינה 5 מ"מ</td><td>BTX</td><td>45-0489</td><td>אלקטרופורציה אלקטרופורציה</td></tr><tr><td></td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td>אלקטרופורציה</td></tr><tr><td>ירוקה מהירה</td><td>סיגמא</td><td>F7258-25G</td><td>אלקטרופורציה</td></tr><tr><td>חמוס מוסטל פוטוריוס פורו</td><td>מרשל</td><td>NA</td><td>אורגניזם ניסיוני</td></tr><tr><td>מקור אור סיבים אופטיים</td><td>אולימפוס</td><td>KL1500LCD</td><td>מלקחיים אלקטרופורציה</td></tr><tr><td></td><td>Allgaier instrumente</td><td>08-033-130</td><td>מלקחיים לניתוח</td></tr><tr><td>3C-SA</td><td>רוביס טק</td><td>3C-SA</td><td>מלקחיים לניתוח</td></tr><tr><td>55</td><td>דומוסטאר</td><td>11295-51</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>מלקחיים 5-SA</td><td>Rubis Tech</td><td>5-SA</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>ספוגיות גזה גדולות</td><td>הרטמן</td><td>401723</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>ספוגיות גזה קטנות</td><td>ניתוח</td><td>401721 הרטמן</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>GFP</td><td>מעבדות Aves GFP1020</td><td></td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>זכוכית (זכוכית בורוסיליקט עם נימה, OD: 1.2 מ"מ, תעודת זהות: 0.69 מ"מ, אורך 10 ס"מ)</td> <td>מכשיר סאטר</td><td>BF120-69-10</td><td>אלקטרופורציה</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>בלה-פארם</td><td>K4011-02</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>כרית חום</td><td>Hans Dinslage</td><td>Sanitas SHK18</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>יוד (תמיסת בטדין 100 מ"ג/מ"ל)</td> <td>Meda</td><td></td><td>997437</td></tr><tr><td>Surgery Isofluran</td><td>CP</td><td>21311</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לטעינת ניתוח 20&micro; l</td><td>Eppendorf</td> <td># 5242 956.003</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Metamizol</td><td>WDT</td><td>99012</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>מספריים לניתוח מצנבאום</td><td>Aesculap</td><td>BC600R</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>מכשיר סאטר</td><td>דגם P-97</td><td>אלקטרופורציה</td></tr><tr><td>pCAGGS-GFP</td><td>NA</td><td></td><td>NA מ- Kalebic et al., eLife, 2018</td></tr><tr><td>נוגדן PCNA</td><td>Millipore</td><td>CBL407</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>pH3 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab10543</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>אזמל</td><td>Aesculap</td><td>ניתוח 294200104</td><td></td></tr><tr><td>מכונת גילוח</td><td>בראון</td><td>EP100</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>Sox2 נוגדן</td><td>R+D מערכות</td><td>AF2018</td><td>נוגדנים</td></tr><tr><td>מהדק כירורגי 13 ס"מ</td><td>WDT</td><td>27080</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>כף כפולה כירורגית (ויליגר)</td> <td>WDT</td><td>27232</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>וילון כירורגי</td><td>WDT</td><td>28800</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים קטנים</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>מחזיק מחט תפירה</td><td>Aesculap</td><td>BM149R</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח נוגדן Tbr2</td><td>Abcam</td><td>ab23345</td><td>פיפטה להעברת נוגדנים</td></tr><tr><td>3 מ"ל</td><td>פישר ניתוח 13439108 מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>ניתוח Julabo</td><td>TW2</td><td></td></tr></tbody></table>

ב vivo מיקוד של תאי הצבי העצבי neocortex חמוס על ידי באלקטרופורציה ברחם

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

מניפולציה של ביטוי גנים ב vivo במהלך התפתחות עוברית היא שיטת הבחירה בעת ניתוח התפקיד של גנים בודדים במהלך התפתחות היונקים. באלקטרואידיות הרחם היא טכניקת מפתח למניפולציה של ביטוי גנים במוח היונק העוברי בvivio. פרוטוקול לאלקטרו-אידוי הרחם של הניאו-קורטקס העוברי של החמוסים, טורף קטן, מוצג כאן. החמוס משמש יותר ויותר כמודל להתפתחות neocortex, כי neocortex שלה מציג סדרה של תכונות אנטומיות, היסטולוגיות, תאיות, מולקולריות אשר נמצאים גם פרימטים אנושיים ולא אנושיים, אבל נעדר במודלים מכרסמים, כגון עכבר או חולדה. באלקטרו אידוי הרחם בוצע ביום העוברי (ה) 33, שלב midneurogenesis ב חמוס. באלקטרואידציה ברחם מטרות תאי האבות העצביים רירית החדרים הצדדיים של המוח. במהלך neurogenesis, תאים אלה של הצבי להוות את כל סוגי תאים עצביים אחרים. עבודה זו מציגה תוצאות וניתוחים מייצגים ב- E37, יום לאחר הלידה (P) 1 ו- P16, התואמים ל- 4, 9 ו- 24 ימים לאחר האלקטרואידציה של הרחם, בהתאמה. בשלבים מוקדמים יותר, הצטמיות של תאים ממוקדים מורכבת בעיקר של תת סוגים עצביים שונים, ואילו בשלבים מאוחרים יותר רוב התאים המסומנו הם נוירונים postmitotic. לכן, באלקטרואידיות הרחם מאפשרת לחקור את ההשפעה של מניפולציה גנטית על התכונות הסלולריות והמולקולריות של סוגים שונים של תאים עצביים. באמצעות השפעתו על אוכלוסיות תאים שונים, באלקטרופורציה ברחם יכול לשמש גם למניפולציה של תכונות היסטולוגיות ואנטומיות של neocortex החמוס. חשוב לציין, כל ההשפעות האלה הן אקוטיות ומבוצעות עם ספציפיות spatiotemporal שנקבע על ידי המשתמש.

באלקטרואידציה של רחם של חמוסים ב E33 הביא מיקוד של תאי אב עצבי רירית פני השטח בחדר של neocortex עוברי(איור 1). תאים אלה נקראים progenitors אפי והם מאוד משגשגים, מה שנוצר את כל סוגי התאים האחרים במהלך הפיתוח. על חלוקה אסימטרית, הצמרים apical יצרו עוד צווי אפי ותא מובדל יותר, בדרך כלל ציד בסיס (BP), אשר delaminated מפני השטח בחדר. BPs היגר לאזור הנביט המשני, SVZ. כאשר האלקטרואדידציה בוצעה ב- E33, BPs רבים שזה עתה נולדו היגרו לחלק הבאזל-רוב של SVZ, שם הם יצרו את OSVZ22.<...

מוצג כאן פרוטוקול לביצוע מניפולציה גנטית במוח החמוס העוברי באמצעות באלקטרואידיות הרחם. שיטה זו מאפשרת מיקוד של תאי האבות העצביים בneocortex ב vivo.

ב Vivo מיקוד של תאי הצבי העצבי Neocortex חמוס על ידי באלקטרופורציה ברחם

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לבצע מניפולציה גנטית ב-vivo במודל בעלי חיים מרכזי המאפשר לנו לחקור את ההתרחבות והקיפול של ניאוקורטקס מתפתח. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא בשימוש בספציפיות מרחבית ותכובית גבוהה במיקוד אותם תאי גזע עצביים שהם סוג תא המפתח להתפתחות המוח. לפני תחילת ההליך, למשוך נימי זכוכית על מושך פיפטה מיקרו ולהשתמש מלקחיים לחתוך את החלק הדיסטלי של נימי כדי להתאים את הקוטר של קצה נימי.ביום העוברי 33, הוסיפו את הריכוז המתאים של דנ"א ב-PBS, בתוספת 0.1% Fast Green עם ערבוב עדין, וה מניחים חמוס נקבה בהריון בצום של 3 שעות על שולחן ניתוחים עם כרית חום. אשר את רמת ההשמדה המתאימה על ידי נגיעה בעור הצחיחיני וצביטת העור בין בהונות השני והשלישי או השלישי והרביעי של שתי הגפיים האחוריות. Isoflurane יכול לגרום לתופעות לוואי, כולל בחילות וסחרחורת.בעת טיפול isoflurane בצורה נוזלית, להשתמש בציוד מגן. במהלך הניתוח, השתמש במיכלים מתאימים כדי ללכוד את הגז. להזריק את החיה תת עורית עם משכך כאבים, אנטיביוטיקה, גלוקוז, ולהחדיר משחה על העיניים של החיה.השתמש קוצץ כדי לגלח את הבטן, ולנקות את העור החשוף עם מים, סבון, ותו תות העונה יוד. לאחר מכן, לייבש את העור עם ספוגיות גזה לחטא עם אלכוהול וקרצוף יוד. עבור אלקטרופורציה ברחם, מניחים וילון סטרילי מעל החיה ולהשתמש אזמל לעשות חתך בעור כ 5 ס"מ באלבה linea.השתמש מספריים כדי לחתוך דרך שכבת השריר ולה מניחים ספוגיות גזה סביב אתר החתך. הרטיבו את הגזה עם PBS וה מניחים את הרחם על ספוגיות. באמצעות פיפטה עם קצה ארוך, לטעון אחד נימי זכוכית משך עם 5 microliters של פתרון DNA לכל עובר להיות מוזרק.חבר את נימי טעון למחזיק ולחבר את הצד השני של המחזיק לצינור ושופר. אתר את ראשו של העובר הראשון והצב מקור אור סיב אופטי ליד הראש. באמצעות הקשתית פיגמנט כנקודת התייחסות, לחדור את העור, הגולגולת, ואת רקמת המוח עם קצה נימי זכוכית ולהשתמש pipetting הפה כדי להקל על המסירה של 3-5 microliters של פתרון ההזרקה לתוך החדר של אחת ההמיספרות המוחיות.מכיוון שהתובנה המוזרקת מכילה 0.1% Fast Green, הזרקה מוצלחת תגרום לכתמים ירוקים כהים של החדר המוזרק, שכעת יהיה גלוי כמבנה בצורת כליה. לאחר ההזרקה, מניחים את אלקטרודות פינצטה על הרחם מעל ראש העובר עם הקוטב החיובי מעל האזור להיות ממוקד ואת הקוטב השלילי מתחת לאזור מוזרק. הגדר את אורך הדופק של האלקטרופורט ל-50 אלפיות שנייה, את מתח הדופק ל-100 וולט, את מרווח הדופק לשנייה אחת ואת מספר הפולסים לחמש.כאשר כל הפרמטרים נקבעו, לחץ על Pulse"ושחרר במהירות כמה טיפות של PBS חם על העובר האלקטרופול. כאשר כל העוברים כבר אלקטרופולציה, להחזיר את הרחם לחלל צפי ולהשתמש תפר 4-0 כדי לסגור את שכבת השריר עם צדת. סוגרים את העור באופן דומה ומכסים את הפצע בתרסיס אלומיניום.ואז להחזיר את החיה לכלוב שלה עם מקור חום וניטור עד חקירה מלאה. ארבעה ימים לאחר אלקטרופוזיה ביום העוברי 37, רוב התאים הממוקדים וצאצאיהם עדיין נמצאים באזורים הנביטתיים והתאים נצפו לעתים רחוקות עוד יותר בבסאלי בתוך הלוח קליפת המוח. זהות אב יכולה להיבדק על ידי immunofluoresence עבור סמנים של תאי רכיבה על אופניים, כגון PCNA, ואילו תת קבוצה של אבים שעברו מיטוזה יכול להיות מוצג על ידי סמנים כגון פוספו-histone 3.ביום שלאחר הלידה אפס, שמונה ימים לאחר אלקטרופורציה, צאצאי התאים הממוקדים התפשטו לכל השכבות ההיסטולוגיות. באמצעות שילוב של סמני גורם שעתוק, ניתן לחשוף אוכלוסיות שונות של חותם בסיס. לדוגמה, Sox2 הוא סמן של תאים מולדים שגשוג, כולל גליה רדיאלי בסיס.וחלבון מוח T-box 2 הוא סמן של אגניטורים בזלית נוירוגניים, שהם בעיקר בני-אצאים בינוניים. ביום שלאחר הלידה 16, רוב התאים הממוקדים מפסיקים להתחלק ולהבדיל לנוירונים וגליה, עם חמוס לאחר לידה יום 16 neocortex המציג את דפוס הקיפול האופייני. אלקטרופורציה ברחם של עוברי חמוס היא שיטה רבת עוצמה ללמוד את הפונקציה של גנים.היא אפשרה לנו לחקור גנים שהיו מעורבים בהתפשטות הניאוקורטקס באבולוציה, כולל גנים ספציפיים לבני אדם. ובשיטתו רבת העוצמה הזו, אכן הצלחנו לגלות מאפיינים מרכזיים של האופן שבו ההתפשטות האבולוציונית של הניאוקורטקס האנושי ככל הנראה עבדה.

in-vivo-targeting-neural-progenitor-cells-ferret-neocortex-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation של E16 עוברים עכברוש

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation E15 של עוברי עכברים

ב electroporation ברחם היא שיטה ערך עבור transfecting ובתאים עצביים in vivo. בהתאם למיקום של אלקטרודות ואת timepoint ההתפתחותי של electroporation, תת מסוימים של תאים בקליפת המוח יכול להיות ממוקד. התאים הממוקדים אז יכול להיות מנותח in vivo או במבחנה על ההשפעות של שינוי גנטי.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

ב electroporation ברחם מאפשר למסירה גן מהירה באופן מרחבית, ובזמן שבשליטת במערכת לפתח את העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מתארים וישימה מאוד בפרוטוקול electroporation ברחם, שניתן להשתמש בהם כדי לספק בונה ביטוי עובריים לתוך מערכת העצבים המרכזית מספר תחומים, כולל diencephalon telencephalon, ואת הרשתית.

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

שטח pial הוא אזור אב ייחודי במערכת העצבים המרכזית, כי הוא מקבל תשומת לב גוברת. בזאת, אנו פירוט שיטה למניפולציה גנטית מהירה של אזור זה באמצעות אב שיטת electroporation שונה. הליך זה יכול לשמש לחקירות תאיות ומולקולרית של שושלות תאים ומסלולי איתות המעורבים בהתמיינות תאים ועל מנת להבהיר את גורלו ואת המאפיינים של תאי בת.

Electroporation שטח pial ילודים

הליך זה מראה כיצד למקד אינטרנוירונים במוח הקדמי של העכבר המתפתח באמצעות אלקטרופורציה ברחם. טכניקה זו הייתה יעילה במיוחד להשגת ביטוי גנים סלקטיבי בתת-סוגים בין-נוירונים המיועדים לשכבות השטחיות של קליפת המוח.

Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד להעביר באופן ספציפי אזורים שונים במערכת העצבים המרכזית C57BL/6 באמצעות אלקטרופורציה ברחם. פרוטוקול זה כולל הוראות מפורטות לטרנספקציות של אזורים המתפתחים לקליפת המוח, ההיפוקמפוס, התלמוס, ההיפותלמוס, גרעין המחיצה הצדדית והסטריאטום.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation בC57BL / 6 העכבר

כתב יד זה מספק פרוטוקולים המשתמשים ב electroporation ברחם (IUE) כדי לתאר את הקישוריות המבנית של נוירונים ברמת התא בודד ועל הרגישויות של נוירונים שכותרתו fluorescently. היסטולוגיה משמש כדי לאפיין הדנדריטים ותחזיות axonal. הקלטה כל התא פרוס חריפה משמשת לחקור רגישות.

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

כפול בתוך הרחם מאפשר מיקוד אוכלוסיות תאים כי הם מופרדים באופן זמני. טכניקה זו שימושית כדי להמחיש אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים אלה באמצעות חלבונים פלורסנט בתנאים נורמליים, אך גם לאחר ניסויים פונקציונליים כדי perturb גנים של עניין.

כפול ברחם באמצעות אלקטרופורציה ועד לאוכלוסיית היעד באופן זמני ולאוכלוסיות שאינן מופרדות

כאן, אנו מציגים את המניפולציה הגנטית החריפה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים חתוכים על ידי אלקטרופורציה. מודלים אלה של אורגנואידים בקליפת המוח נוחים במיוחד להזרקה מכיוון שניתן לזהות בקלות מבנים דמויי חדרים לאחר החיתוך, מה שמאפשר חקירה תפקודית של התפתחות קליפת המוח האנושית, הפרעות נוירו-התפתחותיות ואבולוציה קליפת המוח.

אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים

למדו שיטת אלקטרופורציה ברחם לשינוי גנטי בתאי גזע עצביים בחמוס עוברי. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות הנאוקורטקס והתרחבותו האבולוציונית.

ב Vivo מיקוד של תאי הצבי העצבי Neocortex חמוס על ידי באלקטרופורציה ברחם

גלה סרטונים נוספים